评价Ti-6Al-7Nb合金的细胞相容性及其组织相容性★

李凯1，刘彦普1，杨涛1，闫志伟1，李璇2

1解放军第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科，陕西省西安市 710032；2解放军第一五三医院检验科，河南省郑州市 453000

李凯★，男，1981年生，河南省新野县人，汉族，解放军第四军医大学在读硕士，医师，主要从事颌面创伤及正颌外科研究。
achelk@fmmu.edu.cn

通讯作者：刘彦普，博士，教授，解放军第四军医大学口腔医学院颌面外科，陕西省西安市 710032 liuyanpu@fmmu.
edu.cn

ＡＩＭ: To evaluate cell compatibility and biocompatibility of Ti-6Al-7Nb alloy.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was carried out in the Department of Oral Biology, Stomatological College of the Fourth Military Medical University of Chinese PLA from May to October of 2006.①Cytotoxic test: According to National Standard of Medical Appliance (GB/T16886), the cytotoxic test was conducted in vitro among 5 groups: Ti-6Al-7Nb alloy group, Ti-6Al-4V alloy group, pure Ti group, pure plumbi group and blank group. L-929 cells at logarithmic growth phase were used to prepare the cellular suspension of 1×107 L－1 after trypin digestion and then were incubated on plate, which was followed by adhesive growth of cells, removal of primary medium, and wash with buffer phosphate. Then leaching liquor by four kinds of materials and DMEM were added respectively. Inverted phase contrast microscope was used to determine cellular morphology at days 1, 3, 5, 7 of culture. Each well of culture plate containing MTT was washed with buffer phosphate, added with dimethyl sulfoxide and leaching liquor was extracted. Enzyme-Linked Immunoassay was adopted for absorbance value (A value) at the wave length of 490 nm. Then relative proliferation rate of cells was calculated according to the formula of (A value of trial group/A value of blank group) ×100%. Cytotoxicity was ranked as 0, 1, 2, 3, 4 grades corresponding to relative proliferation rate ≥100%, 80%－99%, 50%－79%, 30%－49%, 0－29%.②Acute hemolysis test: Fresh anticoagulated and attenuated blood was sampled from 10 mL New Zealand rabbits. Ti-6Al-7Nb alloy and Ti-6Al-4V alloy of each 5 g were soaked into tube containing 10 mL saline, while distilled water and saline of each 10 mL into positive control group and negative control group, respectively. Supernatant liquid was removed after centrifugation. Spectrophotometer was used to assay A value and then hemolysis rate was calculated by (Dt－Dnc)/(Dpc－Dnc)×100% (Dt for alloy group, Dnc for negative control group, Dpc for positive control group).③Short-term subcutaneous implantation test: Implantation material was prepared in bladder between subcutaneouly and muscle in 10 New Zealand rabbits, the length from bladder bottom to incision was more than 10 mm and the interval between the two bladders was more than 10 mm, in order to prevent the contact. Each rabbit was implanted with four kinds of materials, one for each kind. Three rabbits were executed after anesthesia at weeks 1, 4, 12 post-operation to conduct hematoxylin-eosin staining in the surrounding tissues of materials and observe the number and type of inflammatory cells, together with thickness of fibrous coating membrane, which were all indices of tissue reaction degree.
ＲＥＳＵＬＴＳ: ①In cytotoxic test, L-929 cells soaked in Ti materials for 7 days were confluenced in normal morphology and regular arrangement; A large amount of cells died in pure plumbi group. The relative proliferation rates of Ti-6Al-7Nb alloy group, Ti-6Al-4V alloy group, pure Ti group, and pure plumbi group were 100%, 97%, 101% and 9% respectively. The level of cytotoxicity was grade 0 in Ti-6Al-7Nb alloy group and pure Ti group, grade 1 in Ti-6Al-4V alloy group, and grade 4 in pure plumbi group.②The hemolysis degree of Ti-6Al-7Nb alloy and Ti-6Al-4V alloy was 0.95% and 1.08%, which was lower than 5%, the national standard. No obvious acute hemolysis appeared.③In the subcutaneous implantation test, the fibrous membrane coated with Ti materials was transparent and thin, whereas that with pure plumbi was translucent and ivory white. And 12 weeks post-operation, the inflammatory cells surrounding Ti materials were lower in density, coating membrane became thinner. The number of inflammatory cells and coating thickness in pure plumbi group was higher than those of Ti material groups, and the tissue reaction was more serious. The inflammatory cell/tissue reaction degree was grade Ⅰ in Ti-6Al-7Nb alloy group and pure Ti group, grades Ⅰ and Ⅱ in Ti-6Al-4V alloy group, and grades Ⅱ and Ⅲ in pure plumbi group.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: Ti-6Al-7Nb alloy having good cell compatibility and biocompatibility is an ideal biomedical titanium alloy.

Li K, Liu YP, Yang T, Yan ZW, Li X.Cell compatibility and biocompatibility of Ti-6Al-7Nb alloy.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(13):2406-2410(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/007-13/13k-2406(ps).pdf]

摘要
目的：评价Ti-6Al-7Nb合金的细胞相容性和组织相容性。
方法：实验于2006－05/10在解放军第四军医大学口腔生物学实验室完成。实验分组：①细胞毒性试验：按照GB/T16886.5 -2003《医疗器械生物学评价》体外细胞毒性的试验方法进行。分为5组：Ti-6Al-7Nb合金组、Ti-6Al-4V合金组、纯钛组、纯铅组、空白对照组。将对数生长期的L-929细胞用胰蛋白酶消化后制备成浓度为1×107 L－1的细胞悬液，接种于培养板,待细胞贴壁生长后弃去原培养液。磷酸盐缓冲液冲洗后分别加入4种金属材料的浸提液和空白对照组的DMEM培养液。培养1，3，5，7 d在倒置相差显微镜下观察细胞形态。每孔加入MTT后继续培养，抽出浸提液，磷酸盐缓冲液冲洗后加入二甲基亚砜，在490 nm波长下用酶联免疫检测仪上测定吸光度值(A值)，计算细胞相对增殖率，相对增殖率=（实验组A值/空白对照组A值）×100%。相对增殖率为≥100%，80%~99%，50%~79%，30%~49%，0~29%时细胞毒性分别为0，1，2，3，4级。②急性溶血性试验：抽取新西兰兔血10 mL，制成新鲜抗凝稀释兔血。将Ti-6Al-7Nb合金、Ti-6Al-4V合金各5 g浸泡入10 mL生理盐水的试管。阳性对照组及阴性对照组分别为10 mL的蒸馏水及生理盐水。每个试管中加0.2 mL稀释兔血，离心后取上清液，用分光光度计在波长为545 nm波长下测吸光度值，计算溶血率，溶血率=(Dt－Dnc)/(Dpc－Dnc)×100%。Dt，Dnc，Dpc分别代表Ti-6Al-7Nb合金组或Ti-6Al-4V合金组、阴性对照组、阳性对照组的A值。③短期皮下埋植试验：在10只新西兰大白兔皮下至肌肉间制备皮囊植入材料。囊底至切口>10 mm，两皮囊间相隔>10 mm，使植入材料相互之间不接触。每只兔植入4种金属材料各1个。于术后1，4，12周麻醉后处死动物各3只，取材料周围组织行苏木精－伊红染色，观察炎性细胞数量及种类，使用电子测量尺Version 1.0测量纤维包膜厚度。参照GB/T16175-1996中的评价标准确定组织反应程度,其反应程度主要通过试验区组织中炎性细胞数量及种类变化，纤维包膜形成与否及厚度变化评价。
结果：①细胞毒性评价：3种钛金属材料浸泡7 d时L-929细胞形态正常，生长近汇合，排列密集规则；纯铅组可见大量细胞死亡。浸泡7 d时Ti-6Al-7Nb、Ti-6Al-4V、纯钛、纯铅相对增殖率分别为100%，97%，101%，9%。经过评价，Ti-6Al-7Nb合金和纯钛的细胞毒性为0级，Ti-6Al-4V合金为1级，纯铅为4级。②细胞相容性评价：Ti-6Al-7Nb合金组、Ti-6Al-4V合金组溶血率分别0.95%，1.08%,低于国家标准规定的5%界限，无明显的急性溶血性。③组织相容性评价：肉眼可见材料被纤维包膜包裹，3组钛金属周围包膜透明且较薄，纯铅组包膜较厚呈半透明乳白色。术后12周时3种钛金属材料周围炎性细胞密度较低，包膜致密且进一步变薄。纯铅组炎性细胞数量及包膜厚度均较3种钛金属为高，组织反应较重。Ti-6Al-7Nb合金和纯钛炎性细胞/组织反应程度均为Ⅰ级，Ti-6Al-4V合金分别为Ⅰ、Ⅱ级，纯铅分别为Ⅱ、Ⅲ级。
结论：Ti-6Al-7Nb合金具有良好的细胞相容性和组织相容性，是一种理想的生物医用钛合金。
关键词：生物相容性；Ti-6Al-7Nb合金；细胞毒性试验；急性溶血性试验；短期皮下埋植试验；生物材料

李凯，刘彦普，杨涛，闫志伟，李璇.评价Ti-6Al-7Nb合金的细胞相容性及其组织相容性[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(13):2406-2410 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2406(ps).pdf]

随着生物医学的发展需要，越来越多的金属材料被用于其中。现临床各种置换、植入器械主要以纯钛及Ti-6Al-4V合金为主。Ti-6Al-4V合金具有较高的强度和综合加工性能，它虽是为航空航天应用设计的，但被广泛用于制作外科修复及置换器件。纯钛、Ti-3Al-2.5V、Ti-6Al-4V等合金属是人们开发的第1代医用钛合金。但研究发现V对生物体有毒副作用[1，2]。Ti-6Al-7Nb合金做为第2代钛合金在瑞士被发明出来，该合采用无毒元素Nb代替了V并且其在机械学性能上优于Ti-6Al-4V合金[3]。虽然中国已经成功仿制了Ti-6A1-7Nb合金，但是其生物相容性资料却甚少。本实验通过国家医疗器械生物学评价中的试验方法评测其生物相容性，为其应用于临床提供参考。

设计：对比观察。
单位：解放军第四军医大学口腔生物学实验室。
材料：实验于2006－05/10在解放军第四军医大学口腔生物学实验室完成。选取清洁级健康新西兰大白兔10只，雌雄不限，体质量2.0~2.5 kg，由解放军第四军医大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（军）2006-015）。实验用材料：Ti-6Al-7Nb合金、Ti-6Al-4V合金（西部超导材料科技有限公司），纯钛、纯铅（广东冠鹰医疗器械制造有限公司）。实验用试剂：①MTT(Sigma，USA) ，实验前用5 g/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)新鲜配制,过滤除菌。②胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。③DMEM培养液(Gibco,USA)，内含体积分数为0.1的胎牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素100 kU/L、10 g/L谷氨酰胺、pH 7.2。④二甲基亚砜(Amresco,USA)。⑤胰蛋白酶（磷酸盐缓冲液配制浓度为2.5 g/L，pH 7.2。实验用仪器：①96孔培养板（Costar,USA）。②CO2恒温培养箱（Hera cell,Germany）。③倒置相差显微镜（ck-40,Olmypus，Japan）。④SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。⑤Powerwave340型酶联检测仪（Bio-TEK Instrument,USA）。⑥电子测量尺Version 1.0(解放军第四军医大学正畸学教研室，电子学教研室制作)。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第一、三、四作者，评估为第一、五作者。所有参试人员均经过专业培训。
方法：
细胞毒性试验：按照GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价》体外细胞毒性的试验方法进行[4]。
合金试件及其浸提液的制备：分别将Ti-6Al-7Nb合金、Ti-6Al-4V合金、纯钛、纯铅制备成5 mm×1 mm的圆型试样。表面抛光后依次用无水乙醇浸泡脱脂，超声波清洗器清洗15 min，三蒸水冲洗3遍热风烘干后，在121 ℃下，高压蒸汽灭菌20 min备用。4种金属材料浸提液采用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液，试件按表面积（cm2）与培养液体积（mL）之比为3∶1，加入培养液，置于37 ℃培养箱内72 h使金属离子尽可能多的析出，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，制备出材料浸提液。空白对照组为DMEM培养液。
MTT实验：将对数生长期的L-929细胞用胰蛋白酶消化后用培养液制备成浓度为1×107 L－1的细胞悬液，接种于4块96孔培养板,每种材料接种9孔。每孔加入100 μL细胞悬液，37 ℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液。磷酸盐缓冲液冲洗3遍后分别加入4种金属材料的浸提液和DMEM培养液。每孔100 μL继续培养，于3，5 d更换材料浸提液。1，3，5，7 d各取1块培养板在倒置相差显微镜下观察细胞形态并照相。每孔加入MTT 20 μL后继续培养4 h，小心抽出每孔内浸提液，磷酸盐缓冲液冲洗后每孔加入150 μL二甲基亚砜。振荡培养板10 min，490 nm波长下用酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A值)。通过计算得出细胞相对增殖率，相对增殖率=（实验组A值/空白对照组A值）×100%。对材料毒性程度的评估标准参见美国药典[5]，细胞毒性0，1，2，3，4级相对增殖率分别为≥100%，80%~99%，50%~79%，30%~49%，0~29%。
急性溶血性试验：
新鲜稀释兔血制备：抽取新西兰兔血10 mL，立即注入有20 g/L草酸钾抗凝剂的试管中，从中取4 mL加入含5 mL生理盐水的试管，制成新鲜抗凝稀释兔血；将0.2 mL兔血样本加入10 mL蒸馏水中，在分光光度仪545 nm波长下测量吸光度值为0.79（符合标准要求的吸光度值应在0.8±0.3）。将Ti-6Al-7Nb合金、Ti-6Al-4V合金各5 g浸泡入10 mL生理盐水的试管。阳性对照组及阴性对照组分别为10 mL的蒸馏水及生理盐水。各组均需重复3只试管。将12只试管置于37 ℃恒温水浴箱中30 min，每个试管中加0.2 mL稀释兔血，缓慢混合，37 ℃恒温水浴箱中维持60 min；离心所有试管(750 g，5 min)，分别吸取各试管中上清液，用分光光度计在波长为545 nm波长下测吸光度值，记录结果，每组3只试管的均值为该组的吸光度值（A值）。溶血率按下列公式计算：溶血率=(Dt－Dnc)/(Dpc－Dnc)×100%。Dt，Dnc，Dpc分别代表Ti-6Al-7Nb合金组或Ti-6Al-4V合金组、阴性对照组、阳性对照组的A值。
短期皮下埋植试验：
试件制备：分别将Ti-6Al-7Nb合金、Ti-6Al-4V合金、纯钛、纯铅制备成2 mm× 7 mm的圆柱状试件，超声波清洗，高压消毒备用。10只新西兰大白兔于术前1 d使用脱毛剂脱毛。速眠新Ⅱ注射液1.5 mL/kg肌肉注射麻醉动物。术前常规消毒，切开脊柱两侧皮肤使用钝器解剖法在皮下至肌肉间制备皮囊植入试样。囊底至切口>10 mm，两皮囊间相隔>10 mm，使植入试样相互之间不接触。每只兔植入4种金属试样各1个，植入试样后分层缝合创口。术后注射青霉素3 d预防感染，观察动物的活动及进食情况，创口感染情况，于术后1，4，12周麻醉后处死动物各3只，带材料周围组织取出放入40 g/L甲醛液中固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红染色，并进行病理图像分析，观察炎性细胞数量及种类，使用电子测量尺Version 1.0测量纤维包膜厚度。参照GB/T16175-1996中的评价标准确定组织反应程度[6]。其反应程度主要通过试验区组织中炎性细胞数量及种类变化，纤维包膜形成与否及厚度变化评价。
主要观察指标：各组材料的细胞毒性评价、细胞相容性评价、组织相容性评价。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.0进行数据处理，数据以x ±s表示，行方差分析及均数间两两比较的q检验(Newman-Keuls法)。

2.1 细胞毒性评价 ①培养1 d时，纯铅组部分细胞未贴壁，成悬浮的死细胞，已贴壁的细胞形态为圆形。其余各组细胞几乎全部贴壁，折光性强，多为梭形和多角形，并见圆形分裂细胞。②培养3 d时，纯铅组大量细胞胞体变小成圆形，核固缩，贴壁细胞聚集成团，为中毒形态。其余组细胞形态正常，数量增多。③培养5 d时，纯铅组形态异常的细胞数量增加，可见部分死亡细胞，其余组细胞形态正常，生长旺盛。④培养7 d时，纯铅组可见大量细胞死亡，而其余组细胞形态正常，生长近汇合，排列密集规则（图1）。绘制出细胞生长曲线中，3种钛金属及空白对照组细胞生长曲线随时间变化而升高，提示细胞生长良好。纯铅组中细胞生长曲线形状较平直，提示细胞生长受到抑制。各组材料细胞相对增殖率及毒性等级见表1。
表1结果表明，浸泡1，3，7 d 3种钛金属的细胞相对增殖率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，浸泡5 d时Ti-6Al-7Nb合金组、纯钛组的细胞相对增殖率高于Ti-6Al-4V合金组，差异有显著性意义（P < 0.01）。各时间点3种钛金属与纯铅组的细胞相对增殖率相比差异均有显著性意义(P < 0.01)。3种钛金属的毒性级别都符合国家标准中的要求，Ti-6Al-7Nb合金稍优于Ti-6Al-4V合金。提示Ti-6Al-7Nb合金及纯钛不具有细胞毒性，Ti-6Al-4V合金具有较轻微的细胞毒性。纯铅的毒性级别较高，提示纯铅具有较强的细胞毒性。

2.2 细胞相容性评价 Ti-6Al-7Nb合金组、Ti-6Al-4V合金组、阳性对照组、阴性对照组吸光度值分别为0.017±0.002，0.018±0.001，0.781±0.026,0.010±0.002。阳性对照组、阴性对照组吸光度值均符合国标YY/T0127.1-93的要求。Ti-6Al-7Nb合金组、Ti-6Al-4V合金组溶血率分别0.95%，1.08%，均低于国家标准中规定的5%，可认为Ti-6Al-7Nb合金及Ti-6Al-4V合金都不会引起急性溶血反应。
2.3 组织相容性评价术后动物活动及进食皆正常，伤口无红肿、渗液、化脓等炎症反应，伤口Ⅰ期愈合，实验过程中无动物死亡。取材时肉眼见试样被纤维包膜包裹，3组钛金属周围包膜透明且较薄，纯铅组包膜较厚呈半透明乳白色。①术后1周组织学切片可见试样周围散在少量炎性细胞，以中性粒细胞为主，成纤维细胞大量增生并于试样周围形成不定形的包膜。②术后4周时3种钛金属试样周围纤维包膜中以纤维母细胞为主，极少见中性粒细胞，偶见淋巴细胞，未见多核巨细胞和异物巨细胞，包膜形态较为致密且厚度较1周时薄。③术后12周时3种钛金属试样周围炎性细胞密度进一步减低，包膜致密且进一步变薄。纯铅组各时间点炎性细胞数量及包膜厚度均较3种钛金属为高，组织反应较重（图2）。参照国家标准对各组材料进行组织反应程度分级，见表2。

表2结果表明，Ti-6Al-7Nb合金植入后其炎性细胞及组织反应程度与纯钛没有区别，并符合国家标准，可认为Ti-6Al-7Nb合金与纯钛一样在体内植入时具有良好的组织相容性。Ti-6Al-4V合金各时间点炎性细胞及组织反应程度较Ti-6Al-7Nb合金及纯钛重，但仍符合国家标准，提示Ti-6Al-4V合金植入体内会引起轻微的组织反应。纯铅组各种指标均较3种钛金属重，显示出了较强的组织反应，可认为纯铅植入体内时具有较差的组织相容性。

Ti-6Al-4V合金做为现临床常用钛合金，虽然较早期医用金属材料具有更好的机械性能及生物相容性，但是其中V元素的存在却被研究证明具有细胞毒性[7，8]。Ti-6Al-7Nb合金做为Ti-6Al-4V合金的替代合金被发明出来，其在电化学实验及模拟体液浸泡实验中已被证明具有良好的抗腐蚀性并较Ti-6Al-4V合金具有更良好的机械性能及细胞相容性，这种良好的性能主要依赖于Ti-6Al-7Nb合金表面氧化形成的钝化膜[9-14]。同时有研究认为Ti-6Al-7Nb合金这种良好的抗腐蚀性可能与合金中所添加的Nb元素促使钝化膜的致密度增加有关[15]。同时Ti-6Al-7Nb合金在经过表面处理后其抗腐蚀性及钝化膜的牢固程度可以的到进一步的加强[16，17]。
实验通过MTT法来测量Ti-6Al-7Nb合金的细胞毒性，MTT比色法是一种检测体外培养细胞生长存活的新方法，其原理是活细胞中处于细胞色素b和c位点的细胞线粒体脱氢酶能裂解四氮唑的环，可以把淡黄色、水溶性的MTT还原为蓝紫色、不溶于水的甲瓒颗粒，后者能被二甲基亚砜溶解显色，用酶标仪检测溶解于二甲亚基亚砜的MTT的显色浓度可得到吸光度值，吸光度值的大小可以反映存活细胞数量的多少及细胞代谢活性的强弱，因而吸光度值降低程度即可反映材料析出液的细胞毒性大小[18，19]。试验结果表明各组钛金属吸光度值较高，显示细胞生长旺盛。纯铅组吸光度值较低，显示细胞生长被抑制或死亡。通过相对增殖率计算出细胞毒性分级，3种钛金属细胞毒性分级均符合国家标准，Ti-6Al-7Nb合金细胞毒性与纯钛相近，较Ti-6Al-4V合金毒性轻，可认为Ti-6Al-7Nb合金是一种具有良好细胞相容性的生物医用金属。
溶血试验是用于评价长期与骨或软组织接触的材料的体外急性溶血反应。通过对材料与血细胞在体外接触过程中所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定，对材料的体外溶血性进行评价。因该试验能敏感地反映试样对红细胞的影响，故为一种特别有意义的材料筛选试验。具有毒性物质的材料所造成的溶血反应程度较其在细胞培养中所产生的毒性反应程度为大，当在溶血试验中测得有溶血活动时，可提示材料有毒性[20]。试验按照有关标准建议的方法，对Ti-6Al-7Nb合金的溶血活动进行测试，其溶血率为0.95%，远小于5% ，故可认为在溶血试验中Ti-6Al-7Nb合金无溶血性。
虽然通过细胞毒性实验的结果可以认为Ti-6Al-7Nb合金具有良好的体外细胞相容性。但是体外实验必竟无法完全模拟出体内环境。所以有必要对Ti-6Al-7Nb合金进行动物体内埋植实验。体内埋植实验结果显示，植入试件1周后组织呈活性反应，3种钛金属与纯铅组相差不大。这种结果的出现可能与植入时间有关，因为1周的植入时间还不足以让纯铅组和其他组产生显著差异。随着植入时间延长，Ti-6Al-7Nb合金表现出良好的体内组织相容性，炎性反应减轻消失。纯铅组则出现炎性反应相对较重及包膜相对变厚的情况，呈现出一定的组织毒性。实验中发现组织学切片中，试样两头包膜较试样中段为厚，炎性反应为重。这种现象的产生可能与试样两端在动物活动时与周围组织磨擦并对组织产生刺激有关，所以在进行评价时应从试样中段进行，以最大限度的保证实验结果的可靠。依照YY/T0127.8-2001中动物体内埋植实验评价方法，3种钛合金在动物体内无反应或轻度组织反应。纯铅组为中度组织反应。通过以上实验可以初步得出结论，Ti-6Al-7Nb合金具有良好的生物相容性。

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