雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架的血液及组织相容性★

刁繁荣，吕安林，张薇，李军杰，张荣庆，苑媛，胡小菁，胡艳

刁繁荣★，男，1972年生，江西省万载县人，汉族，解放军第四军医大学在读硕士，主治医师，主要从事冠状动脉粥样硬化性心脏病介入治疗的研究。
anan0521@163.com

通讯作者：吕安林，博士，副教授，硕士生导师，解放军第四军医大学西京医院心内科，陕西省西安市 710032
lvanlin@fmmu.edu.cn

In vivo blood compatibility and histocompatibility of rapamycin-tirofiban eluting stent★

ＡＩＭ: To observe the thrombosis and restenosis, the changes of histopathological and biochemical indexes after rapamycin-tirofiban eluting stent (RTES) transplantation, and evaluate the blood compatibility and histocompatibility of RTES.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was accomplished in the Laboratory of Experimental Surgery, the Fourth Military Medical University of Chinese PLA between March and November in 2005. Grouping: Eight miniature pigs were randomly divided into experimental group (n =4) and control group (n =4). Stents made with rapamycin-tirofiban and polymer were implanted into the coronary arteries of pigs in experimental group, while stents made with rapamycin and polymer were implanted in the control group. Coronary artery restenosis model was established with coronary over-stretch in swine, 2 stents for each swine. Clopidogrel of 75 mg/d was given for antiplatelet therapy, 3 months in control group and 1 month in experimental group. Evaluation:①The behavior states of animal post-operatively.②The whole blood cell counts and biochemical indexes before and 2 days, 7 days, 4 weeks, 12 weeks after stents were implanted.③All the animals were sacrificed, and the implanted vessels were selected to conduct histopathology observation and then calculate the lumen area losing rate. Losing rate of lumen area (%)=(Surrounding area of stents－lumen area)/surrounding area of stents ×100%.④Lungs, livers, kidneys and the ventricular walls, which infused by the stents supported arteries, were also observed histologically.
ＲＥＳＵＬＴＳ: Eight miniature pigs were involved in the result analysis.①Animal ethology: Before, during and 3 months after the implantation, there was no significant difference in heart rate, blood pressure and body weight between two groups. Behavior, diet or urination was not influenced.②Blood cell count and biochemistry: White blood cell number was increased in both groups 2 days post-operatively [(13.1±2.8)×109, (7.2±2.1)×109 L－1; (12.5±3.3)×109, (6.3±2.2)×109 L－1], with the significant difference (t =3.37, 3.08, P < 0.05); There was no obvious change in whole blood cell, white blood cell and blood platelet counts in the two groups (P > 0.05). γ-glutamic-pyruvic transaminase, glutamyl transpeptidase creatinine and urea nitrogen were all identical with those before implantation (P > 0.05).③Histopathology of vessels: No adhesive thrombosis appeared in the two groups. The lumen area and intimal area were both higher in experimental group than in control group [(4.96±0.35), (4.89±0.46) mm2; (1.12±0.10), (1.05±0.09) mm2], but the losing rate of lumen area was lower than that in control group [(19±9)%, (21±7)%].④Morphology and pathology of organs: All the cells were confirmed normal. No definite inflammatory cell, hemolysis or necrosis was found.

ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: Both the blood compatibility and histocompatibility of RTES is implanted in coronary arteries of miniature pigs for three months are good. RTES can decrease the systemic administration dose of antiplatelet drugs.

Diao FR, Lü AL, Zhang W, Li JJ, Zhang RQ, Yuan Y, Hu XJ, Hu Y.In vivo blood compatibility and histocompatibility of rapamycin?鄄tirofiban eluting stent.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(13):2411-2414(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2411(ps).pdf]

摘要
目的:观察雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架置入后再狭窄、血栓、生化指标和重要器官组织病理学变化情况，评估其血液及组织相容性。
方法: 实验于2005－03/11在解放军第四军医大学实验外科实验室完成。以聚合高分子材料为药物载体，采用微喷法制备雷帕霉素支架及雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架。实验分组：8只小型猪按随机数字表法分为两组，复合药物组和雷帕霉素组，每组4只。复合药物组应用雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架，雷帕霉素组应用雷帕霉素支架。再狭窄模型采用国际公认的小型猪冠状动脉过度扩张再狭窄模型。每只猪于冠状动脉中成功置入上述支架各2枚。术后两组小型猪服用硫酸氯吡格雷75 mg/d抗血小板治疗，雷帕霉素组服用3个月，复合药物组服用1个月。实验评估：①观察术后动物行为状态。②支架置入术前、术后2，7 d，4，12周分析全血细胞计数、生化指标。③麻醉后处死动物，取出支架置入段血管,行组织病理学观察，计算管腔面积丢失率。管腔面积丢失率（%）=(支架围绕面积－管腔面积)/支架围绕面积×100%。④取肺、肝、肾组织及支架血管段供血的心室壁行组织学观察。
结果:8只小型猪均进入结果分析。①术后动物行为学观察：两组术前、术中及术后3个月造影时，动物心率、血压、体质量的变化差异无显著性意义，术后也无明显行为异常及饮食、排尿便异常。②血细胞计数和生化检测结果：复合药物组、雷帕霉素组术后2 d白细胞计数均高于术前[分别为（13.1±2.8）×109，（7.2±2.1）×109 L－1；（12.5±3.3）×109，（6.3±2.2）×109 L－1],差异有显著性意义(t =3.37，3.08，P < 0.05)；其余各时段两组外周全血红细胞、白细胞、血小板计数差异无显著性意义(P > 0.05)。γ－血清谷丙转氨酶、谷氨酰转肽酶及肌酐、尿素氮未见明显改变(P > 0.05)。③血管组织病理学检测:两组血管均未见附壁血栓。复合药物组血管腔面积、新生内膜面积高于雷帕霉素组[分别为（4.96±0.35），（4.89±0.46）mm2；（1.12±0.10），（1.05±0.09）mm2]，管腔面积丢失率低于雷帕霉素组[（19±9）%，（21±7）%]，差异均无显著性意义（P > 0.05）。④重要脏器大体形态及病理学检查：证实细胞形态结构正常，无炎性细胞浸泡、出血和坏死。
结论: 雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架置入小型猪冠状动脉后3个月的血液相容性及组织相容性良好，并可减少术后抗血小板药物的全身用药量。
关键词：支架；组织相容性；雷帕霉素；替罗非班；生物材料

刁繁荣，吕安林，张薇，李军杰，张荣庆，苑媛，胡小菁，胡艳.雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架的血液及组织相容性[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(13):2411-2414 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2411(ps).pdf]

经皮冠状动脉内介入治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）的主要局限是支架内再狭窄[1，2]。近年，药物支架（主要为雷帕霉素支架和紫杉醇支架）的使用对预防再狭窄取得明显疗效，其发生率已降至5%～10%[3，4]，但术后全身强化抗血小板治疗增加了出、凝血等的发生率。能否局部替代全身给药抗血小板治疗，减少出、凝血并发症的发生，同时又不影响防治再狭窄疗效成为当今心血管内科学领域亟待解决的问题，为此本文研制了雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架，评估其生物相容性。

设计：对比观察。
单位：解放军第四军医大学西京医院。
材料：实验于2005－03/11在解放军第四军医大学西京医院外科实验室完成。选择健康成年小型猪8头，雌雄不限，月龄6～8个月,体质量38～49 kg，第四军医大学动物中心提供（SCXK(军)2002-005）。普通球囊导管和附件：6F动脉鞘、6F造影导管、6F JL3.5指引导管（美国Cordis公司）；0.014"×190 cm的B.M.W导丝（佳腾公司），球囊扩张压力泵（Merit公司）。支架：支架主体为直径2.5～3.0 mm、长度18 mm 的316L 医用不锈钢支架（北京乐普医疗器械公司），预装在球囊导管上。涂层材料为生物相容性好的高分子聚合材料（聚甲基丙烯酸丁酯/聚乙烯醋酸－乙烯酯）；采用微喷法制备聚合材料及雷帕霉素支架，聚合材料及雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架，载药量分别携带雷帕霉素1.2 g/m2、雷帕霉素1.2 g/m2和替罗非班0.7 g/m2，涂层厚度为6～10 μm，应用封装型载药方式，即在最外层涂覆一层不可降解的药物释放控制层。支架系统由本科研制（专利号：200610042995.3），北京乐普医疗器械有限公司协助制作。检测器械：Philip血管造影机（荷兰PHILIP公司）、Leica微图像处理仪（美国Leica公司）、Olympus光学显微镜（日本）。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，评估为第二、三、四作者。
方法：
动物实验：8头小型猪按随机数字表法分为复合药物组和雷帕霉素组，每组4只。复合药物组应用雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架，雷帕霉素组应用雷帕霉素支架。术前高脂饮食喂养3个月，术前3 d所有实验动物服用泡腾型乙酰水杨酸水溶片(巴米尔，阿斯利康制药有限公司) 300 mg/d、硫酸氯吡格雷片（泰嘉，深圳信立泰药业有限公司）75 mg/d 。再狭窄模型采用国际公认的小型猪冠状动脉过度扩张再狭窄模型[5，6]。0.3 mL/kg盐酸氯氨酮皮下注射(15 mg/kg)基础麻醉，0.06 g/L戊巴比妥钠肌注强化。固定动物，切开皮肤，分离皮下组织，暴露右股动脉穿刺成功后，置入6F鞘管。静脉给予肝素150～250 U/kg，送入导引钢丝，沿导引钢丝逆行插入6F JL3.5多功能造影导管，选择性冠状动脉造影，根据目标血管直径选择支架尺寸(支架血管直径比为1.1～1.2∶1)。将16枚支架分别置入小型猪的目标血管,每只猪在左前降支、左旋支或右冠状动脉各置入相应支架1枚，以1.2～1.6 MPa的压力球囊单次扩张10～20 s。两组成功置入支架16枚：两组各置入8枚支架。8枚支架置入左前降支，6枚置入左回旋支，2枚支架置入右冠状动脉。重复造影，无严重撕裂和血栓，依次退出球囊、导丝、指引导管。拔出动脉鞘，结扎股动脉并缝合伤口。肌肉注射青霉素160万单位预防感染。待动物苏醒后送回动物室，普通饲料喂养。两组均服用泡腾型乙酰水杨酸水溶片300 mg/d直至实验终止。雷帕霉素组术后服用硫酸氯吡格雷75 mg/d，服用3个月；复合药物组仅服用氯吡格雷75 mg/d，服用1个月。
复查冠脉造影：术后3个月行冠状动脉造影复查。采用造影机自带软件测定邻近支架正常血管腔内径为参照血管直径（mm）、支架内最小直径(mm)和管腔丢失率(%)，连续测量3次，取平均值。管腔丢失率(%)=（参照血管直径－支架内最小直径）/参照血管直径×100%。
各生化指标检测及动物行为学观察：术前、术后2，7 d，4，12周抽取血标本，测定血常规、血凝系列、肝肾功能。术中监测心率和动脉血压，比较支架置入前与实验终止前即刻的心率、血压变化。于支架置入前、实验终止前测量体质量。术后对动物行为学进行观察。
组织病理学检测：复查造影后麻醉后处死动物，取出心脏，用生理盐水灌注冠状动脉，待引流液清澈后，体积分数为0.1的中性甲醛溶液250 mL以13.3 kPa加压灌注10 min，分离支架和相邻远、近端各5 mm血管段，用剪刀垂直于管腔，剪取支架血管段的近、中和远端3个部分作为病理组织标本，各段标本长度约2 mm，用体积分数为0.1的中性甲醛溶液固定。取支架血管段供血区域心肌以及肺、肝、肾标本用生理盐水冲洗，体积分数为0.1的中性甲醛固定，苏木精－伊红染色组织学检查。
血管标本的处理分析：带支架血管段标本塑料包埋后，骨科切片机切片，每血管段标本切2片，每支架共6片。苏木精－伊红染色制备光镜标本。组织学切片的横截面积由计算机辅助数字(LEICA-Q550IW图像分析系统) 形态测量进行分析，确定管腔面积、支架围绕面积、新生内膜面积。将支架围绕面积作为正常参照管腔面积。管腔面积丢失率=(支架围绕面积－管腔面积)/支架围绕面积×100%。新生内膜面积为支架围绕面积减去管腔面积。血管狭窄>50%参照血管直径为再狭窄。
主要观察指标：①术后动物行为学改变。②血细胞计数和肝、肾功能。③血管内径。④血管组织病理面积学测量。⑤重要器官病理检查。
统计学分析：计数资料采用x ±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，所有数据由第一作者采用SPSS 11.5 统计软件进行分析。

2.1 术后动物行为学观察全部动物存活并完成实验。两组术前、术中及复查造影时，动物心率、血压、体质量的变化差异无显著性意义，术后也无明显行为异常及饮食、排尿便异常。
2.2 出血和血栓发生情况实验期间未观察到皮肤出血点、淤血、淤斑等出血并发症。支架置入即刻和复查造影时两组均未发现支架内血栓。血管组织切片均未见附壁血栓(图1)。

2.3 血管内径变化冠状动脉造影两组支架血管段两端及支架血管段内均未见血栓形成，无边缘效应及假性动脉瘤发生。定量冠状动脉造影分析显示，两组参照血管直径、支架内最小直径和管腔丢失率差异无显著性意义（P > 0.05），见表1。

2.4 两组支架段血管病理组织学检查支架段血管组织面积学测量结果，两组血管腔面积、新生内膜面积和管腔面积丢失率差异无显著性意义（P > 0.05），见表2。

2.5 两组血细胞和生化检测结果血细胞计数：复合药物组、雷帕霉素组术后2 d白细胞计数均高于术前[分别为（13.1±2.8），（7.2±2.1）×109 L－1；（12.5±3.3），（6.3±2.2）×109 L－1]，差异有显著性意义(t =3.37，3.08，P < 0.05)，术后2 d复合药物组和雷帕霉素组白细胞计数差异无显著意义（P > 0.05）；其余各时段两组外周全血红细胞、白细胞、血小板计数差异无显著性意义(P > 0.05)。生化检测结果：γ－血清谷丙转氨酶、谷氨酰转肽酶及肌酐、尿素氮未见明显改变(P > 0.05)。
2.6 实验动物重要器官病理检查结果实验动物处死后重要脏器大体形态及病理学检查证实细胞形态结构正常，无炎性细胞浸泡、出血和坏死。

支架内再狭窄是经皮冠状动脉内介入治疗术后主要并发症，发生机制复杂。目前研究认为支架内再狭窄是一种机体对损伤的过度愈合反应，主要与血管弹性回缩、血管重塑、内膜过度增生和支架内血栓形成相关[7，8]。药物支架是近年预防支架内再狭窄的重要研究成果，其中雷帕霉素涂层支架的支架内再狭窄仅为5%～10%左右[9－12]。
雷帕霉素为一种免疫抑制药物，能阻止细胞由G1期向S期的转化，使细胞返回静止期，终末抑制血管平滑肌细胞迁移和增生。支架置入过程中，首先损伤血管内皮细胞，暴露内膜下胶原等组织，正常情况下血管内皮细胞可较快修复，但雷帕霉素的作用是非选择性的，在抑制血管内膜平滑肌增生的同时，也抑制内皮细胞的修复愈合，延缓血管内皮化过程，易于促进亚急性和晚发血栓形成[13－15]。一旦发生血栓，后果往往非常严重，因此药物支架内血栓的预防是心血管领域高度重视的问题。目前临床上冠心病患者置入药物支架后，标准二联阿司匹林和氯吡格雷强化抗血小板治疗9～ 12个月以防治支架内血栓，但这加大了出血并发症的发生率，据2006年CHARISMA 研究最新结果公布：安全性终点（主要安全性终点为严重出血、中度出血、致命性出血和颅内出血）结果显示，加用氯吡格雷组的中度出血发生率显著高于单用阿司匹林组(P < 0.001) [16]。为减少对全身抗血小板治疗的依赖，以支架本身为药物载体，局部抗血小板治疗可能是部分或全部替代全身抗血小板治疗、减少出血并发症的新途径。
血小板的活化、黏附和聚集是动脉血栓形成过程的关键步骤，血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体途径是血小板血栓形成的终末环节[17]。大量研究证实可逆性血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂——替罗非班是目前已知最强效的抗血小板药物,在临床上已取得较好疗效[18，19]。动物实验和临床证实替罗非班可引起血小板减少症[20，21]。雷帕霉素和替罗非班联用通过支架给药，局部药浓度较高，可能引起全身的药物毒性反应并对局部组织造成损害，因此有必要对雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架的生物相容性进行观测。
实验结果显示：经皮冠状动脉内介入治疗术后复合药物组动物全部存活，实验期间无行为学异常。对血液系统的影响，白细胞计数仅术后2 d较术前明显增高，这可能仅与手术应激性及术后感染有关，实验期未见对骨髓造血功能有明显影响，对实验动物的肝、肾功能也无明显损害。最重要的是通过支架血管段供血心肌以及相邻重要器官肺、肝、肾的病理标本苏木精－伊红染色后与正常组织检测对比，细胞形态结构完整，无炎症细胞浸润，未见实质性损害，证实雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架具有较好的生物相容性。复合药物组雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架置入即刻和复查造影时均未见支架内血栓，血管组织病理学检测亦未见附壁血栓，取得了与雷帕霉素组雷帕霉素支架置入后强化抗血板治疗同等效果（雷帕霉素组术后常规服用氯吡格雷3个月，而复合药物组术后服用氯吡格仅1个月），证明雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架在部分减少抗血板药物全身用药的情况下防治支架内血栓是可行和有效的。复合药物组与雷帕霉素组复查造影管丢失率（直径法）差异无显著性意义。血管组织病理学检测在管腔面积、血管内膜增生面积、管腔面积丢失率上，两组组差异也无显著性意义，说明雷帕霉素－替罗非班复合药物涂层支架并没有降低雷帕霉素预防支架内再狭窄的疗效。本实验为小样本动物研究，结果可能存在一定局限，但无疑为新型复合药物涂层支架的研发和抗血小板局部给药方案的深入研究提供了初步的实验依据。

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