同济大学，1材料科学与工程学院，2工程实验馆，上海市 200092

许乾慰☆，男，1960年生，湖北省大冶县人，汉族，1998年香港理工大学毕业，博士，教授，主要从事高分子材料的教学和研究。
xu_qw@mail.tongji.edu.cn

中图分类号:R344 文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2007)13-02415-05

收稿日期：2006-11-24
修回日期：2007-03-01
（06-50-11-8490/Y·Y）

Blood compatibility of heparin-modified acyclic polyurethane elastomers☆

ＡＩＭ： To improve the technique of covalently grafting of heparin (Hep) onto the surfaces of acyclic polyurethane (PU) elastomers and to investigate the blood compatibility of Hep-modified PU obtained.
ＭＥＴＨＯＤＳ: This experiment was conducted in the laboratory of School of Materials Science and Engineering, Tongji University from August 2005 to August 2006. Material preparation: ①Acyclic PU was synthesized by "one-step" method, using hexamethylene diisocyanate (HMDI) or isophorone diisocyanate (IPDI) and chain extender, 1,4-butanediol, as hard segments, while polytetrahydrofuran as soft segment. HMDI-PU and IPDI-PU were obtained, respectively.②Hep was immobilized on the surface of PU elastomers by covalent bond grafting to obtain PU-Hep, PU-polyvinyl alcohol (PVA)-Hep, PU-polyethylene glycol (PEO)-Hep and PU-PVA-PEO-Hep. Experimental evaluation: ①The amount of heparin immobilized on PU surface was determined by toluidine blue colorimetric method and the release rate of heparin was determined by spectrophotometry.②The blood compatibility of heparin immobilized surface was assayed by hemolysis test and platelet adhesion test.
ＲＥＳＵＬＴＳ: ①The amounts of heparin grafted on IPDI-PU-PVA-PEO and HMDI-PU-PVA-PEO surfaces were 64.8 mg/m2 and 51.0 mg/m2, respectively.②The Hep amount decreased to 51.7 mg/m2 (released by 20.2%) for IPDI-PU-PVA-PEO-Hep and to 39.1 mg/m2 (released by 23.3%) for HMDI-PU-PVA-PEO-Hep after 20-day soaking. The release rate of Hep from the heparinized PU became stable after soaked for 7 days and was about 0.6×10－8 g/(m2·min). ③The rate of hemolysis decreased (IPDI-PU from 2.40% to 1.94%, HMDI-PU from 3.20% to 2.36%) when Hep was immobilized on PU surface. All the rates of hemolysis observed were less than 5%, indicating that the materials prepared met the hemolysis standard of biomedical materials. The blood compatibility of IPDI-PU was better than that of HMDI-PU.④Platelet adhesion test: The number of adhesive platelet was higher on IPDI-PU than on HMDI-PU, and the ability of inhibiting thrombosis was better. After Hep grafting, the blood compatibility of PU-PVA-PEO-Hep was also superior to that of PU-PVA-Hep and PU-PEO-Hep.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: PU surfaces heparinized by covalent bond grafting exhibit good blood compatibility and low release rate of heparin. Such heparin-modified PU can be used as materials for fabricating artificial heart valve.

Xu QW, Xiao SY.Blood compatibility of heparin?鄄modified acyclic polyurethane elastomers.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(13):2415-2419(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2415(ps).pdf]

摘要
目的：改进脂肪族聚氨酯（polyurethane，PU）弹性体表面接枝肝素（heparin，Hep）的工艺过程，观察共价键合法接枝肝素后其血液相容性。
方法：实验于2005－08/2006－08于同济大学材料科学与工程学院实验室完成。材料制备：①脂肪族聚氨酯的合成：采用一步法合成以4,4'－甲烷二苯基二异氰酸酯(HMDI)或异氟尔酮二异氰酸醑(IPDI)、扩链剂1,4－丁二醇为硬段，聚四氢呋喃醚为软段的脂肪族聚氨酯，分别生成IPDI型聚氨酯和HMDI型聚氨酯。②共价键合法聚氨酯表面接枝肝素：形成PU-Hep，PU－聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)-Hep,PU－聚乙二醇（polyethylene glycol，PEO）-Hep，PU-PVA-PEO-Hep中间产物。实验评估：①接枝肝素含量的测定：甲苯胺蓝显色法测定聚氨酯表面的肝素含量；甲苯胺蓝分光光度法测定肝素释放速率。②肝素接枝表面的血液相容性测定：通过溶血实验和血小板黏附实验测定。
结果：①聚氨酯表面的肝素含量：IPDI型聚氨酯和HMDI型聚氨酯表面肝素（PU-PVA-PEO-Hep）接枝量分别达到64.8，51.0 mg/m2。②肝素释放速率：浸泡20 d后，IPDI型聚氨酯肝素化表面（PU-PVA-PEO-R-NHCO-Hep）的肝素含量从64.8 mg/m2下降到51.7 mg/m2（脱落20.2%），HMDI型聚氨酯肝素化表面（PU-PVA-PEO-Hep）的肝素含量从51.0 mg/m2下降到39.1 mg/m2（脱落23.3%）。肝素的释放速率在浸泡7 d后达到稳定，约为0.6×10－8 g/（m2·min）。③聚氨酯表面接枝肝素后溶血率：溶血率有一定降低（IPDI型从2.40%降低至1.94%、HMDI型从3.20%降低至2.36%），溶血率均小于5%，符合生物医用材料的溶血性要求，其中IPDI型聚氨酯血液相容性好于HMDI型。④血小板黏附情况：表面改性之前，IPDI型聚氨酯表面黏附的血小板数目多于HMDI型。IPDI型聚氨酯抑制血小板形成血栓的能力好于HMDI型。表面接枝肝素后，PU-PVA-PEO-Hep的血液相容性优于PU-PVA-Hep和PU-PEO-Hep。
结论：表面共价键合法接枝肝素的脂肪族聚氨酯有良好的血液相容性，且肝素释放速率慢，基本满足人工心脏瓣膜材料的要求。
关键词：脂肪族聚氨酯；肝素；共价结合；血液相容性；生物材料

许乾慰，肖世英.脂肪族聚氨酯弹性体肝素化的血液相容性[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(13):2415-2419
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2415(ps).pdf]

0 引言

采用高分子材料制成的人工心脏瓣膜，不仅有机械瓣膜的耐久性，而且力学性能更接近天然瓣[1]。聚氨酯（polyurethane，PU）具有优良的综合性能：良好的生物相容性、良好的物理机械性能，被看作下一代心脏瓣膜材料的最佳选择[2]。聚氨酯具有良好的抗凝血性，一方面归于其特殊的表面的氨基甲酸酯基结构，与人体的构造比较相似，所以其适应性较为优秀；另一方面是具有微相分离结构，微相分离结构和生物细胞壁的结构类似，所以具有较好的血液相容性[3]。虽然聚氨酯已经作为医用导管在临床上使用，但目前还无法达到心脏瓣膜长期使用的要求，所以需要进一步表面改性以提高其血液相容性。目前通过表面改性的方法来改善材料血液相容性的办法很多[4－7]，其中表面肝素化已成为研究最成熟和应用最广泛的抗凝血修饰手段[8]。表面肝素化有许多种方法，主要包括离子键合法和共价键合法。其中共价键合法常用的有低温等离子体法、光化学法、臭氧活化法、辉光放电法、电晕放电法、偶合接枝法等[9－12]。
现已商品化的聚氨酯医用材料采用4，4’－甲烷二苯基二异氰酸酯(HMDI)为原料。Szycher等[13]、Batich等[14]和Daka等[15]发现HMDI在合成过程中会产生致癌物质4,4－甲烷二苯基二胺。Darby等[16]从Mobay公司出售的聚氨酯产品中发现了少量4，4－甲烷二苯基二胺。由于脂肪族聚氨酯不含有苯环，从更安全的角度出发，由脂肪族异氰酸酯合成的聚氨酯材料变成为了替代的首选[17－19]。本文利用共价键结合的方法，将肝素（heparin，Hep）接枝在脂肪族聚氨酯材料表面，并测定其血液相容性。

1 材料和方法

设计：对比观察。
单位：同济大学材料科学与工程学院。
材料：实验于2005－08/2006－08于同济大学材料科学与工程学院实验室完成。试剂：聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA，聚合度124)、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEO，Mr 20 000）、甲苯胺蓝（化学纯）（国药集团化学试剂有限公司）；肝素钠（≥140 U/mg，上海绿鸟科技发展有限公司）；兔血（新西兰大白兔新鲜采集）。仪器：Quanta 200 FEG场发射环境扫描电子显微镜（FEI公司）；EQUINOXSS红外光谱仪（德国Bruker光谱仪器公司）；U1800紫外分光光度计（日本HITACHI公司）。
设计、实施、评估者：均为全部作者。
方法：
脂肪族聚氨酯的合成：采用一步法合成以HMDI或异氟尔酮二异氰酸醑(IPDI)、扩链剂1，4－丁二醇为硬段，聚四氢呋喃醚为软段的脂肪族聚氨酯[17]。分别生成IPDI型聚氨酯和HMDI型聚氨酯。
共价键合法表面接枝肝素：0.8 g聚氨酯（表面积为1 cm2）与质量分数为0.15的二异氰酸酯/环己烷溶液反应，质量分数为0.15的二丁基锡二月桂酸锡为催化剂，室温下搅拌反应4 h。反应结束后，用无水乙醚冲洗,室温下真空干燥，为活化后产物PU-NCO。再加入质量分数为0.07的 PVA/二甲亚砜溶液，60 ℃下反应3 h，用二甲亚砜和去离子水冲洗，真空干燥，制得PU-PVA。再次进行活化后，加入质量分数为0.2的 PEO/环己烷溶液，60 ℃下反应3 h后，去离子水冲洗后，再室温下真空干燥2 h，得产物PU-PVA-PEO。再次活化后，将样片加入双胺基端封的聚乙二醇（NH2-PEO-NH2）溶液中，在80 ℃下搅拌反应3 h，用去离子水清洗，真空干燥。2 g肝素溶于100 mL甲酰胺溶液中，将其pH值调为1左右，加入产物，缓慢滴加氯化亚砜，室温下反应3 h，用去离子水洗涤后，真空干燥。此外还制备一系列对比样品：PU-Hep，PU-PVA，PU-PEO，PU-PVA-R-NHCO-Hep，PU-PEO-R-NHCO-Hep，PU-PVA-PEO，PU-
PVA-PEO-R-NHCO-Hep。
涂敷法表面接枝肝素：称取2 g的IPDI型、HMDI型聚氨酯，溶于20 mL四氢呋喃中，加入0.06 g肝素（相对于聚氨酯含量3%）。放入58 ℃烘箱中48 h，使聚氨酯和肝素完全均匀溶解在四氢呋喃溶液中。将盖玻片分别浸入两种肝素－聚氨酯/四氢呋喃溶液中，然后放入58 ℃烘箱中24 h，四氢呋喃完全挥发后，形成一层透明薄膜。
接枝过程中间产物的定性分析：将各阶段的样品做红外光谱，以确定反应官能团的存在。
肝素标准曲线绘制及含量测定：采用甲苯胺蓝显色法[20]测定聚氨酯表面的肝素含量。
稳定性实验：将一定表面积（1 cm2）各阶段肝素化样品在37 ℃下浸泡在10 mL生理盐水中；在不同时间取3 mL溶液用甲苯胺蓝分光光度法测定浸泡液中的游离肝素含量，并将样品重新浸泡在10 mL生理盐水中；绘制时间－肝素分子脱落量相关曲线。
肝素接枝表面的血液相容性测定：溶血试验和血小板黏附试验，具体方法参见文献[17]。血小板在材料表面的黏附和活化会诱发凝血反应，同时还会释放出加快凝血反应的物质。因此，观测血小板的黏附和形态变化是评价材料抗凝血性能的重要方法[21]。医学上将黏附血小板的形态大致分为5种类型[22]。
本实验在标准条件下，将材料与富血小板血浆接触后，冲洗试验表面以除去非黏附细胞，随后固定试验表面，扫描电镜下观察。
主要观察指标：①接枝肝素含量。②肝素释放速率。③样品的溶血率。④血小板黏附的数量。⑤血小板黏附的形状。

2 结果

2.1 聚氨酯表面肝素过程的定性分析 所有反应均在无水条件下进行。通过红外光谱分析定性表征肝素结合过程中各阶段产物发现，各反应步骤均能顺利进行，肝素分子能以酰胺键方式共价结合到聚氨酯材料表面。见图1。

图1结果表明，3 300 cm－1处为聚氨酯表面氨基(－NH2)的NH伸缩振动峰（图1a）。经过异氰酸根活化后，3 300 cm－1的NH伸缩振动峰明显减弱，同时在2 260 cm－1处出现异氰酸根（－NCO）的特征吸收峰（图1b）。活化后表面与PVA反应，2 260 cm－1吸收峰消失，同时在3 400 cm－1处出现了强吸收峰（图1c）。PVA含有大量的OH侧基，所以3 400 cm－1处峰明显增大表明PVA接枝在表面。再次经异氰酸酯活化处理并与PEO反应后，2 750~2 900 cm－1处的峰增强，这是长链PEO中CH2振动峰（图1d），说明PEO已经接枝在表面。肝素接枝后，在1 640 cm－1处出现了较强吸收峰（图1e），此为酰胺键特征吸收峰，表明肝素主要通过酰胺键固定在聚氨酯材料表面。
2.2 引入不同中间产物对肝素接枝量的影响 见图2。
图2结果表明，①未经过二异氰酸酯活化和未引入长链中间产物，直接在聚氨酯表面接枝的肝素量很小，超出甲苯胺蓝法测量精度，肝素接枝量计为0。②经过单纯使用PVA或PEO为中间产物后，不同聚氨酯表面接枝肝素量均有明显上升（IPDI型聚氨酯分别达到35.9，37.7 mg/m2，HMDI型聚氨酯分别达到34.8，41.3 mg/m2）。这是由于PVA含有活性侧基OH，增加了反应活性点进而增加肝素接枝量；PEO具有长链结构，分子两端含有活性OH基团，可以增加空间促进肝素接枝。③同时引入PVA和PEO为扩链点后，两种聚氨酯表面肝素接枝量进一步明显提高（IPDI型和HMDI型聚氨酯分别为64.8，51.0 mg/m2）。在实际反应中，部分活性点没有参加反应，所以同时引入PVA，PEO后的肝素接枝量并不是单独引入PVA，PEO接枝量的简单加合。

2.3 肝素化聚氨酯表面溶血率的影响因素
2.3.1 肝素接枝量对溶血率的影响 见图3。

图3结果表明，肝素化聚氨酯比未处理的HMDI型聚氨酯的溶血率（3.2%）低很多（PU-PVA-Hep、PU-PEO-Hep和PU-PVA-
PEO-Hep分别下降14.7%，10.0%，32.2%），说明在某种程度上，表面接枝肝素后的聚氨酯表面比未处理的聚氨酯表面具有更好的血液相容性。
2.3.2 不同聚氨酯本体相对溶血率的影响 化学共价键合法虽然采用了多种有机溶剂，但每一步都经过了严格的高真空脱溶剂、超声波振荡清洗、去离子水冲洗等处理，降低了残留有机溶剂的浓度，减少了对溶血率的影响。不同聚氨酯本体对溶血率的影响见图4（共价键结合法的样品为PU-PVA-PEO-R-
NHCO-Hep）。

图4结果表明，通过化学键接枝肝素后，IPDI型聚氨酯溶血率从2.40%下降到1.94%（降低19.2%），HMDI型聚氨酯从3.20%下降到2.36%（降低26.3%）。本课题的各类聚氨酯及其肝素化后聚氨酯的溶血性实验结果均小于5%，符合生物医用材料的溶血性要求[23]。
2.4 各种因素对血小板黏附的影响
2.4.1 未经处理的两种聚氨酯表面血小板黏附形态 见图5。

图5结果表明，IPDI型和HMDI型聚氨酯表面有较多以Ⅱ、Ⅳ型为主的黏附血小板分子聚集形态，大部分血小板伸出了伪足，胞基质已经开始铺展，部分血小板之间已形成胞丝联接区域。
2.4.2 经处理后的HMDI型聚氨酯表面对血小板黏附形态的影响 见图6。

图6结果表明，通过化学键接枝PVA、PEO和肝素后，表面呈现不同程度的网状、片状结构。改性后的表面没有原来的表面那么平整，但血小板没有发生大面积的聚集和严重的变形，有少量的血小板零星的黏附在表面，主要呈圆形。仔细观察比较血小板的黏附形态可以得出，PU-PVA-PEO-Hep的血小板几乎没有变形，说明PU-PVA-PEO-Hep的血液相容性优于PU-PVA-Hep和PU-PEO-Hep。
2.5 肝素释放速率的影响因素 各肝素化产物肝素脱落量与浸泡时间的关系见图7。各肝素化表面在浸泡的最初一段时间内，有较多的肝素分子脱落。在7 d以后达到稳定，表面肝素释放曲线趋于平直。

图7结果表明，不同聚氨酯类型和不同方法固定肝素都对肝素释放速率有影响。
不同聚氨酯类型对肝素释放速率的影响：浸泡20 d后，IPDI型聚氨酯肝素化表面（PU-PVA-PEO-R-
NHCO-Hep）的肝素含量从64.8 mg/m2下降到51.7 mg/m2（脱落20.2%），HMDI型聚氨酯肝素化表面（PU-PVA-PEO-Hep）的肝素含量从51.0 mg/m2下降到39.1 mg/m2（脱落23.3%）。这两种类型肝素化聚氨酯表面，经过长时间生理盐水的浸泡，仍保持了一定的肝素固定量。
不同方法固定肝素对释放速率的影响：采用涂覆法固定肝素的聚氨酯表面经过生理盐水浸泡后，肝素脱落速率远远大于化学共价键固定的肝素脱落速率。浸泡20 d后，测出表面肝素固定量由87.8 mg/m2下降到48.2 mg/m2（脱落45.1%），并继续以较大速度脱落。共价键合法接枝的肝素量平均还保持在45.4 mg/m2（脱落21.5%）。涂覆法是采用物理包埋原理将肝素分子固定在聚氨酯表面，稳定性显著低于化学键合法，大量的肝素分子溶解在生理盐水中，导致表面肝素含量骤然下降。

3 讨论

引入不同中间产物对肝素接枝量有明显的影响（图2）。虽然PVA含有活性侧基OH，可以大量增加活性点，但单独引入PVA却比单独引入PEO时的肝素接枝量小。这是因为PVA相对分子质量较小（聚合度124），链长有限，而肝素相对分子质量（10 000～ 50 000）[24]比较大，空间位阻也较大，大量的OH活性基团被包覆、屏蔽。虽然PEO没有能增加活性点，但PEO（Mr=20 000）具有柔软长链结构，具有良好的空间伸展性，可以增大肝素接枝的空间。
从聚氨酯溶血率的结果（图3，4）可以看出：化学接枝肝素能更有效的降低聚氨酯的溶血率，而IPDI型聚氨酯普遍比HMDI型聚氨酯具有更低的溶血率。这是由于IPDI型聚氨酯本身的化学组分及结构决定的，说明在某种程度上IPDI型聚氨酯有更好的血液相容性。
从聚氨酯血小板黏附结果（图5）可以看出：IPDI型和HMDI型聚氨酯本体相对血小板黏附的情况有所不同。表面改性之前，IPDI型聚氨酯表面黏附了较多的血小板，而HMDI型聚氨酯虽血小板黏附数目稍少，但变形比IPDI型聚氨酯黏附的严重。这是IPDI型和HMDI型聚氨酯表面结构决定的。IPDI单体为环状结构，极性比HMDI大，内聚能大，所以IPDI型聚氨酯表面微相分离程度高，抑制血小板形成血栓的能力比HMDI型聚氨酯强。通过表面改性可以改善材料的血液相容性，也减少了材料本体相血液相容性的差异。
经过共价键接枝肝素的聚氨酯，其表面肝素的脱落量在1周后达到稳定（图7）。初期其脱落量比较高，这是主要由于材料表面吸附的部分游离的和包裹在试样内未反应的肝素释放、溶解在生理盐水中所致。但一段时间后，肝素几乎没有再脱落[释放速度小于1.0×10－5 g/（m2·d）]，表明各肝素化表面具有较好的稳定性。
肝素能与血浆中一些抗凝蛋白质结合而增强抗凝蛋白质的抗凝活性，所以微量的肝素释放就可以保持抗凝蛋白的活性以达到抗凝血性。根据孙多先等[25]的研究，肝素化抗凝血材料的键合方式决定着肝素释放速率。离子键合的肝素化材料的远远高于共价键合的肝素化材料的肝素释放速率。而以物理包埋法的肝素化材料，肝素固定相比前两种方法是最不稳定的。研究者通过引入“空间桥梁”增加肝素的活性后，发现肝素脱落速率在1×10－8 g/（m2·min）的数量级时便可以有较理想的抗凝血性能[26]，而且抗凝血活性保持时间可以很长。本课题共价键合法接枝的肝素释放按浸泡20 d后表面肝素未脱落量51.7 mg/m2（IPDI型聚氨酯）和39.1 mg/m2（HMDI型聚氨酯），理论计算这种肝素化材料可以分别使用14，10年左右，可以基本满足心脏瓣膜长期使用的初步要求.
结论：①接枝时同时引入PVA、PEO，既可以增加反应活性点又可以增加接枝空间，达到最好的接枝效果。IPDI型和HMDI型两种聚氨酯的肝素接枝量分别为64.8，51.0 mg/m2。②浸泡20 d后，IPDI型聚氨酯肝素化表面（PU-PVA-PEO-R-NHCO-Hep）的肝素含量从64.8 mg/m2下降到51.7 mg/m2（脱落20.2%），HMDI型聚氨酯肝素化表面（PU-PVA-PEO-Hep）的肝素含量从51.0 mg/m2下降到39.1 mg/m2（脱落23.3%）。肝素的释放速率在浸泡7 d后达到稳定，约为1.0×10－5 g/（m2·d），即0.6×10－8 g/（m2·min），基本满足心脏瓣膜使用的初步要求。③本试验中所用聚氨酯的溶血率均小于5%，符合医用标准。④接枝肝素后，血小板黏附量下降，程度也有所减轻。

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