微囊化卵巢细胞植入卵巢摘除小鼠腹腔对胰岛α和β细胞

微囊化卵巢细胞植入卵巢摘除小鼠腹腔对胰岛α和β细胞
生物活性的影响*★

周金玲，许晴，金洁，史小林

周金玲★，女，1980年生，黑龙江省五常市人，汉族，首都医科大学生殖医学研究中心在读硕士，主要从事微囊化卵巢细胞异体移植的实验研究。
zjl801116@126.com

通讯作者：史小林，教授，博士研究生导师，首都医科大学生殖医学研究中心，北京市 100069
zhyxzhx@ccmu.
edu.cn

Influence of transplanting microencapsulated ovarian cells into the abdomen on the bioactivity of pancreatic islet alpha and beta cells in mice *★

ＡＩＭ: To observe the effect of transplanted microencapsulated ovarian cells on the biological function of pancreatic islet cells.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was conducted in the Center of Reproductive Medicine, Capital Medical University from July 2005 to September 2006. Thirty adult female ICR mice were randomly divided into control group, ovariectomy group and transplantation group with 10 mice in each group. The bilateral ovaries of the ovariectomy group were extirpated via back incision; in the transplantation group, the microencapsulated ovarian cells were transplanted into the abdomen after bilateral ovariectomy. The control group mice were normally feed for 10 days without any operation. The mice of the ovariectomy group and transplantation group were killed at the 60th day after operation to take their blood samples and pancreatic tissue. Serum estrogen (E2) quality concentrations of three groups were tested by radioimmunoassay. Pancreas tissues were embedded by paraffin and sectioned to detect the glucagon, insulin, insulin receptor α and insulin receptor substrate -2 by immunohistochemistry. The average absorbance value of the positive areas was measured with image analyzer.
ＲＥＳＵＬＴＳ: All 30 mice were involved in the result analysis. ①Serum estrogen quality concentration of the ovariectomy group was lower than the control group and transplantation group significantly [(1.089±0.885), (37.582±20.019), (35.766±13.313) ng/L, t =5.759, 8.219, P < 0.01], but there was no significant difference in the serum estrogen level between the transplantation group and the control group. ②The glucagons and the positive products (A) of the ovariectomy group were significantly higher than those of the control group (1.282±0.076, 1.038±0.053; 1.023±0.055, 0.822±0.090, P < 0.01); there was no significant difference between the transplantation group and the control group; the insulin receptor α and positive products (A) of insulin receptor subtrate-2 in the ovariectomy group were significantly lower than those of the control group (0.929±0.142, 1.099±0.098; 0.891±0.118, 1.135±0.069, P < 0.01), but there was no significant deference between the transplantation group and the control group.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: Ovariectomy combined the transplantation of microencapsulated ovarian cells could improve the quality concentration of serum estrogen, and effectively regulate the bioactivity of pancreatic islet α and β cells.

Zhou JL, Xu Q, Jin J, Shi XL.Influence of transplanting microencapsulated ovarian cells into the abdomen on the bioactivity of pancreatic islet alpha and beta cells in mice.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(13):2425-2429(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2425(ps).pdf]

摘要
目的：观察微囊化卵巢细胞种植于去卵巢小鼠腹腔后对胰岛细胞生物活性的影响。
方法：实验于2005－06/2006－09在首都医科大学生殖医学研究中心完成。将30只成年雌性ICR小鼠随机分为3组，正常对照组、卵巢摘除组和微囊种植组，每组10只。卵巢摘除组经背部切口取出双侧卵巢；微囊种植组于卵巢摘除同时，将微囊化卵巢细胞种植到腹腔内。正常对照组于饲养第10天，卵巢摘除组和微囊种植组于术后60 d处死采血并取出胰腺组织。以放射免疫法测定各组实验动物血清中雌二醇的质量浓度。胰腺组织分别应用免疫组织化学法标记胰高血糖素、胰岛素、胰岛素受体α和胰岛素受体底物2。实验结果用图像分析仪进行吸光度值的测定。
结果：30只小鼠均进入结果分析。①卵巢摘除组血清雌二醇的质量浓度低于正常对照组、微囊移植组，差异有非常显著性意义[分别为（1.089±0.885），（37.582±20.019），（35.766±13.313）ng/L，t =5.759，8.219，P < 0.01]，正常对照组与微囊种植组之间差异无显著性意义。②卵巢摘除组胰高血糖素、胰岛素的阳性产物（A）显著高于正常对照组，差异有显著性意义(分别为1.282±0.076，1.038±0.053; 1.023±0.055, 0.822±0.090, P < 0.01)，微囊种植组与正常对照组比较差异无显著性意义；卵巢摘除组胰岛素受体α和胰岛素受体底物2的阳性产物（A）显著低于正常对照组，差异有显著性意义?穴分别为0.929±0.142，1.099±0.098; 0.891±0.118，1.135±0.069, P < 0.01)，微囊种植组与正常对照组比较差异无显著性意义。
结论：在去除卵巢的同时进行了微囊化卵巢细胞的种植，可明显提高血清雌二醇的质量浓度，较有效地调节胰岛α细胞和β细胞的生物活性。
关键词：卵巢；胰岛；种植；微囊；激素替代疗法

周金玲，许晴，金洁，史小林.微囊化卵巢细胞植入卵巢摘除小鼠腹腔对胰岛α和β细胞生物活性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(13):2425-2429 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-13/13k-2425(ps).pdf]

女性绝经后最显著的变化是雌二醇水平降低，这种变化被认为与女性更年期综合征、骨质疏松、冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率增高有关。此外，曾有关于应用激素替代治疗（hormone replacement therapy，HRT）进行绝经后胰岛素抵抗综合征的临床实践的报道[1]，有研究认为绝经后体内雌激素的减少所导致的胰岛素抵抗是心血管疾病和2型糖尿病发病率增加的关键环节，适量的HRT可有效预防绝经后女性心血管疾病和2型糖尿病的发生[2，3]。近几年关于雌激素提高机体胰岛素敏感性的机制研究已成为国内外的研究热点。Goodrow等[4]的研究显示应用雌激素可降低空腹血糖和提高胰岛素的敏感性。但HRT对胰岛素敏感性亦有双重作用，适量的雌激素能改善胰岛素的敏感性，而大剂量雌激素则加重胰岛素抵抗。因此补充生理剂量的雌激素对于改善老年女性的生活质量至关重要。本实验采用海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠微囊化免疫隔离技术[5，6]，将微囊化卵巢细胞植入卵巢摘除鼠的腹腔内，目的是对卵巢与胰岛细胞生物活性之间的相关性进行研究。

设计：随机对照动物实验。
单位：首都医科大学生殖医学研究中心。
材料：实验于2005－06/2006－09在首都医科大学生殖医学研究中心完成。选择SPF级健康雌性ICR小鼠30只，体质量25～30 g，6～8周龄，由首都医科大学动物部提供（医学实验动物合格证号：11963）。饲养环境温度和湿度分别为18～28 ℃和40%～70%，通风良好，自然光照，自由取食饮水。主要试剂：胰蛋白酶、海藻酸钠（Sigma公司），Ⅰ型胶原酶（Gibco公司），胎牛血清、DMEM-F12（1∶1）培养液、Hanks、多聚赖氨酸（Hyclone公司）。鼠抗胰岛素单克隆抗体、兔抗胰高血糖素多克隆抗体、兔抗胰岛素受体α、兔抗胰岛素受体底物2多克隆抗体及SP-9000通用型免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
设计、实施、评估者：设计为通讯作者，实施、评估为第一作者，图像分析为第二、三作者，分析者不知晓实验动物分组情况。
方法：
动物分组：雌性ICR小鼠30只按随机数字表法分为3组，正常对照组、卵巢摘除组、微囊种植组，每组10只。正常对照组小鼠于饲养第10天，卵巢摘除组和微囊种植组小鼠于术后60 d处死采血，并取出胰腺组织。
卵巢细胞分离与培养：无菌条件下取出小鼠双侧卵巢，经2.5 g/L胰蛋白酶和2 g/LⅠ型胶原酶（1∶1）消化，900 r/min，离心10 min，去上清，加培养液吹打，制成单细胞悬液，过60目细胞筛，调制细胞密度为500～1 000 L－1，用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM-F12培养液于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。待培养的卵巢细胞长满培养瓶底80%～90%时进行传代。
微囊化卵巢细胞的制备：将卵巢细胞悬浮于15 g/L海藻酸钠溶液中，细胞密度为5 000～10 000 L－1，通过自制微囊发生装置打入到11 g/L氯化钙溶液中，轻微搅拌形成凝胶珠，依次用0.5 g/L多聚赖氨酸、1.5 g/L海藻酸钠包裹凝胶珠，最后用0.05 mol/L柠檬酸钠液化囊心。将制备好的微囊收集于培养板中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。培养的微囊化卵巢细胞分为两组：一组于培养24 h后，种植到去卵巢小鼠腹腔内；一组继续培养，于培养不同时间提取培养液，放射免疫分析法检测雌二醇含量。
卵巢摘除及微囊种植手术：卵巢摘除组和微囊种植组实验动物以3.3×10－3 mL/g盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉，以小鼠两后肢大腿根部上缘连线与后中线的交点到最后一肋附及的椎骨连线的中点为中心，作纵行皮肤切口，切除双侧卵巢（卵巢摘除组）。微囊种植组小鼠与此同时将微囊化卵巢细胞注入腹腔，每只鼠植入微囊0.5 mL[内约含(200±20)个微囊]。
检测动情周期：各组小鼠每日清晨8时检查动情周期，首先观察外阴的变化，然后用无菌生理盐水棉签轻拭小鼠阴道壁，取出棉签在滴有生理盐水的载玻片上涂匀制成涂片进行镜检。
苏木精－伊红染色及免疫组织化学标记：胰腺组织经Bouin固定，制成4.0～5.0 μm的石蜡切片，进行苏木精－伊红染色及免疫组织化学SP法标记，一抗分别是鼠抗胰岛素单克隆抗体（1∶100），兔抗胰高血糖素多克隆抗体（1∶100），兔抗胰岛素受体α多克隆抗体（1∶200），兔抗胰岛素受体底物2多克隆抗体（1∶400），二氨基联苯胺显色。免疫组织化学标记步骤按说明书进行。
放射免疫分析检测：待测血清标本和微囊培养液在室温下融化后进行测定，操作步骤按试剂盒说明书进行。
图像分析：实验结果用LEICA Q500IW自动图像分析仪对染色阳性部位进行吸光度值的测量，每张切片取5个视野计算平均吸光度值，A值越大表示染色越深，即检测物的阳性度越高。
主要观察指标：微囊培养液中雌二醇的质量浓度，小鼠动情周期检查，各组小鼠血清雌二醇的质量浓度，胰腺外分泌部细胞苏木精－伊红染色结果，胰腺免疫组织化学标记结果。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5进行数据处理，计量数据以x ±s表示，进行正态性检验，方差齐性检验，两独立样本t检验，单因素方差分析（ANOVA）和q检验。

2.1 实验动物数量分析纳入小鼠30只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 卵巢细胞的体外培养与传代原代培养的卵巢组织细胞在不断换液的过程中，内含的卵细胞因是不贴壁细胞，故逐渐被去除，培养瓶内残留的细胞应包括，具有内分泌功能的颗粒细胞和卵泡膜细胞，结缔组织细胞及未分化的卵巢间充质细胞等。待卵巢细胞接近长满时，在倒置显微镜下进行观察，可见培养中的卵巢细胞呈鹅卵石样排列（图1）。体外生长的卵巢细胞进行传代培养，可传至第6代（本实验仅传至6代），细胞生长状态如培养的原代细胞。

2.3 微囊化卵巢细胞的生长与功能状态
2.3.1 微囊化卵巢细胞的生长状态本实验方法制备的微囊的直径500～700 μm。每个微囊内约有2.5×104 个卵巢细胞。将体外培养的微囊化卵巢细胞置于倒置显微镜下观察，可见微囊内的卵巢细胞排列紧密、活性较好（图2）。

2.3.2 微囊培养液中雌二醇的质量浓度收集P0，P1，P2，P3，P4，P5代微囊化卵巢细胞培养液，采用放射免疫分析法检测培养液中雌二醇的含量（与血清雌二醇检测在相同时间同一条件下进行）。结果微囊培养液中检测到不同质量浓度的雌二醇，见表1。

2.4 小鼠动情周期检查正常对照组10只小鼠阴道脱落细胞涂片表明均存在明显的动情周期。卵巢摘除组小鼠阴道脱落细胞涂片检查见角化、未角化上皮细胞与白细胞持续同时存在，细胞比例无明显变化，且整体细胞数量极少，无动情周期出现；微囊种植组小鼠阴道脱落细胞涂片检查发现。角化与未角化上皮细胞在数量上远远多于白细胞，且不同时间各细胞所占比例也不相同，但未见明显的动情周期出现。
2.5 各实验组小鼠血清雌二醇的质量浓度利用放射免疫分析法检测血清雌二醇的质量浓度，正常对照组、卵巢摘除组和微囊种植组分别为（37.582±20.019），（1.089±0.885），（35.766±13.313）ng/L，检测结果显示，卵巢摘除组血清雌二醇的质量浓度低于正常对照组、微囊移植组，差异有非常显著性意义（t =5.759，8.219，P < 0.01），正常对照组与微囊种植组之间差异无显著性意义。
2.6 各实验组小鼠胰腺外分泌部细胞苏木精－伊红染色结果卵巢摘除组小鼠胰腺外分泌部细胞嗜酸性染色较正常对照组增强，细胞周围的嗜碱性物质减少甚至消失，微囊种植组与正常对照组无明显差别（图3）。
2.7 各组小鼠胰腺免疫组织化学标记结果高血糖素、胰岛素、胰岛素受体α及胰岛素受体底物2的阳性表达产物均呈棕黄色颗粒状。高血糖素阳性细胞主要分布在胰岛周围（图4）。胰岛素（图5）、胰岛素受体α（图6）及胰岛素受体底物2（图7）的阳性细胞主要分布在胰岛中央部。A值测量结果显示：卵巢摘除组胰高血糖素、胰岛素显著高于正常对照组，微囊种植组与正常对照组比较差异无显著性意义；卵巢摘除组胰岛素受体α和胰岛素受体底物2显著低于正常对照组，微囊种植组与正常对照组比较差异无显著性意义。各组平均A值测量结果见表2。

目前，临床虽然仍在广泛使用HRT治疗老年女性雌激素水平低下所引发的一系列代谢紊乱综合征，但对HRT的可行性却持有不同认识。多数学者认为HRT利多弊少，因为有实验证实HRT能明显调节血脂代谢，对心脑血管疾病的发生有一级预防作用[7]，并能较有效地防止胰岛素抵抗的发生，降低2型糖尿病的发病危险[8，9]。而认为HRT不利是因为有实验证实长期补充雌激素有增加乳腺癌和子宫内膜癌发生率的危险[10]，此外对于有心血管疾病高危因素的女性，HRT可增加其发病率[11]。目前HRT的方法改良，已成为医学界的研究热点。
性激素补充的剂量、途径的合理性是避免副作用发生关键点。大量的实验证实卵巢组织移植可纠正绝经期女性因性激素水平低下所引起的一系列代谢紊乱综合征[12]。但由于宿主对移植物的免疫排斥反应，影响了移植物在宿主体内的存活和正常发挥功能。史小林等[13]将大鼠胚胎卵巢分别种植到卵巢摘除鼠的颈部和肾被膜下，结果证实胚胎卵巢能在异体异位生长发育并具有内分泌功能，而且其内分泌功能还可置身于宿主自身的调控之下，但仍存在排异现象。
海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠微囊技术是1980年由Sun AM发明，微囊的半透膜允许小分子的营养物质、激素、代谢产物等自由扩散，阻止免疫细胞、大分子免疫球蛋白、补体通过，可避免受体对移植物的免疫攻击。研究者们应用这一技术包裹内分泌细胞，如胰岛等[14]，明显延长了移植物的存活时间，此外有实验证实微囊对机体无明显毒副作用且生物相容性好[15]。
本实验将微囊化卵巢细胞种植部位选择在腹腔，是因为种植的微囊可贴附于腹膜脏层的表面，腹膜脏层血供较为丰富，并能提供足够的生存空间，可为种植物存活创造良好的条件。种植时间选择摘除卵巢的同时，目的是为种植的卵巢细胞提供适合其生长的正常机体的生理环境，因去除卵巢后，垂体分泌功能将会自行调控，致使机体出现促性腺激素分泌过度的阶段，失去正常的生理环境。
实验将微囊化卵巢细胞植入机体的主要目的是纠正因卵巢功能衰退，造成的雌激素分泌不足。实验结果显示使用微囊化卵巢细胞种植的方法，可有效地达到补充雌激素的目的。因实验选择的微囊化卵巢细胞中，没有卵细胞，因此实验未见种植组小鼠出现明显的动情周期。
本实验包入微囊中的是除卵母细胞外的所有卵巢细胞，是因考虑到分泌雌激素的卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞均为高分化细胞，如使用纯化的颗粒细胞和卵泡膜细胞进行微囊化处理，将有可能直接影响微囊化卵巢细胞内分泌功能在体内的持续时间，因此添加了卵巢内的未分化细胞。
补充雌激素的主要目的是预防因雌激素分泌不足而引发的机体各器官的退行性病变。本实验重点关注了胰岛功能，特别是雌激素与胰岛α细胞和β细胞生物活性间的相关性。丁昉等[16]对卵巢切除大鼠空腹血糖进行测量，结果卵巢切除后空腹血糖增高。本实验分别对正常对照组、卵巢摘除组动物的胰岛素分泌细胞和高血糖素分泌细胞的功能活性进行检测，结果显示摘除卵巢后，分泌胰岛素和胰高血糖素的胰岛细胞的活性均显著增高。此外，对胰岛素受体及胰岛素受体底物2的检测结果显示在卵巢摘除组小鼠的阳性表达明显低于对照组。
胰腺β细胞上的胰岛素受体与胰岛素结合后，胰岛素受体的β亚基近膜区酪氨酸自身磷酸化并且与胰岛素受体底物2结合，胰岛素受体上激活的酪氨酸蛋白激酶催化胰岛素受体底物2上多个酪氨酸磷酸化，为下游含SH2区的蛋白提供位点，形成信号蛋白复合物，以介导进一步的信号传导。
小鼠胰岛素受体底物2基因敲除动物实验表明，胰岛素受体底物2介导的信号传导途径控制着胰岛β细胞代偿性增多的胰岛素抵抗状态[17]，即胰腺β细跑的代偿性增生主要由胰岛素受体底物2介导。另有研究表明高浓度胰岛素可使肝细胞胰岛素受体底物2的表达显著下调，并伴随糖代谢关键酶活性的降低等胰岛素抵抗症状，而雌激素可提高肝细胞胰岛素受体底物1和胰岛素受体底物2的转录和翻译水平，增强细胞胰岛素敏感性[18]。
基于上述理论分析本实验的结果，作者认为卵巢摘除后，由于雌激素缺乏，胰岛素受体酪氨酸的磷酸化作用受到一定程度的抑制，胰岛素受体含量下降，导致组织对胰岛素的敏感性降低，致使胰岛β细胞分泌胰岛素的活性增高。实验还观察到卵巢摘除后胰岛分泌高血糖素的α细胞活性显著增高，此结果验证了雌激素缺乏与胰岛素抵抗有内在联系的理论[19，20]。此外去卵巢后胰岛素与胰高血糖素生物活性同时增高，也提示机体糖代谢失调。值得注意的是去卵巢60 d后，这种失调仍然存在，提示失调并不是代偿性的。
实验在去除卵巢的同时给予微囊化卵巢细胞种植，结果显示微囊化卵巢细胞可有效地调控胰岛α细胞和β细胞的生物活性，改善组织细胞的胰岛素抵抗状态。表现在标记高血糖素、胰岛素、胰岛素受体α及胰岛素受体底物2的阳性度与卵巢摘除组差异显著而与正常对照组无明显差异，这一结果也进一步证实正常卵巢功能与胰岛分泌功能间存在着密切的相关性。具体机制还有待深入探究。

Stevenson JC，Crook D，Godsland IF, et al. Oral versus transdermal hormone replacement therapy. Int J Fertil 1993；38(Suppl 1):30-35
McKenzie J，Fisher BM，Jaap AJ，et al. Effects of HRT on liver enzyme levels in women with type 2 diabetes: a randomized placebo-controlled trial. Clin Endocrinol 2006;65(1):40-44
Samsioe G. HRT and cardiovascular disease.Ann NY Acad Sci 2003；997:358-372
Goodrow GJ，L'Hommedieu GD，Gannon B，et al. Predictors of worsening insulin sensitivity in postmenopausal women. Am J Obstet Gynecol 2006;194(2):355-361
游言文,臧卫东,曹靖.微囊化牛嗜铬细胞移植对疼痛大鼠行为学及脊髓P物质释放的影响[J].中国临床康复,2005,9(30):90-92
de Groot M, Schuurs TA, van Schilfgaarde R. Causes of limited survival of microencapsulated pancreatic islet grafts. J Surg Res 2004；121(1):141-150
孙曙光,勾美图.围绝经期和绝经后妇女应用激素替代治疗2年后血脂蛋白和载脂蛋白的变化[J].中国临床康复，2005,9(11):54-55
Sumino H，Ichikawa S，Itoh H，et al.Hormone replacement therapy decreases insulin resistance and lipid metabolism in Japanese postmenopausal women with impaired and normal glucose tolerance. Horm Res 2003；60(3):134-142
Salpeter SR，Walsh JM，Ormiston TM，et al. Meta-analysis: effect of hormone-replacement therapy on components of the metabolic syndrome in postmenopausal women.Diabetes 2006；8(5):538-554
Coombs NJ, Taylor R, Wilcken N，et al.HRT and breast cancer：impact on population risk and incidence.Eur J Cancer 2005；41(12):1775-1781
Stevenson JC. The metabolic basis for the effects of HRT on coronary heart disease.Endocrine 2004;24(3):239-244
白文佩,郑淑蓉，陈淑玲.激素替代治疗对绝经后妇女糖代谢的影响[J].中国临床药理学杂志，1999，15(1):14-17
史小林,曹金燕,翁静,等.大鼠胚胎卵巢异体异位移植的研究[J].生殖医学杂志，2000，9(2):104-108
Zhou D,Sun YL,Vacek I，et al. Normalization of diabetes in cynomolgus monkeys by xenotransplantation of microencapsulated porcine islets. Transplant Proc 1994；26(3):1091
李保国,华泽钊,张洪德,等.胰岛移植用免疫隔离微胶囊的牢固度、生物相容性和通透性研究[J].中国免疫学杂志,2001,17(2): 85-88
丁昉,石凤英,刘邦忠,等.卵巢切除对大鼠肥胖评定指数与血糖的影响[J].复旦学报：医学版,2005，32(4)：495-496
Hirayama I，Tamemoto H，Yokota H，et al. Insulin receptor-related receptor is expressed in pancreatic beta-cells and stimulates tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-1 and -2.Diabetes 1999；48(6):1237-1244
谢平，刘美莲，曾卫民，等.雌激素和高胰岛素调节胰岛素受体底物- 1 ,2 表达机制研究[J]. 中国病理生理杂志，2005,21(1):175-178
Borissova AM, Tankova T, Kamenova P, et al. Effect of hormone replacement therapy on insulin secretion and insulin sensitivity in postmenopausal diabetic women.Gynecol Endocrinol 2002；16(1):67-74
Vasudevan H，Xiang H，McNeill JH. Differential regulation of insulin resistance and hypertension by sex hormones in fructose-fed male rats.Am J Physiol 2005；289(4):H1335-H1342