基于3D Slicer应用程序构建大鼠小脑外形微细结构信息数据库*☆

李莉1，丁库克2，刘霞1，李慧1，宋一志1，景朋1，陆涛1

首都医科大学，1基础医学院解剖教研室，2生物工程学院，北京市 100069

李莉☆,女，1969年生，河南省封丘县人，汉族，首都医科大学在读博士，主要从事神经解剖学，数字解剖学等研究。 wang.lily@tom.com

通讯作者：丁库克，副研究员，首都医科大学生物工程学院，北京市 100069

Reconstructing rat cerebellum microstructure database using 3D Slicer

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＡＩＭ：To establish a detailed digitalized dataset for the rat cerebellum of three-dimensional (3D) reconstruction, and find out an available method to reconstruct cerebellar nuclear.
ＭＥＴＨＯＤＳ: The experiment was carried out in the Laboratory of Anatomy Department, Capital University of Medical Science from March 2003 to May 2005. Five SD rats were anesthetized, and the cerebellum was sectioned serially after fixed with formamint phosphate buffer and stained with Nissel's method, then the sections were photographed as 1 868×1 491 with scanner. The original image dataset was received, aligned semi-automatically and segmented manually using alignment software belonged to Biomedical Engineering College of Capital University of Medical Science and photoshop 7.0. The segmented structures were reconstructed using 3D Slicer, which was developed by Harvard University. The photos of cerebellar appearance were obtained using Cad-cam apparatus, which was used in Department of Stomatology.
ＲＥＳＵＬＴＳ: ①Totally 159 original images of rat cerebellum were obtained by Nissel's staining, with the clear boundary. The cortex was stained deeply while the white matter was understained, and the central nucleus of cerebellum was stained deeply, appearing clear edge.②Totally 159 3D surface datasets of rat cerebellum were made up as .vtk file, then the motion display file of dataset was displayed using 3D Slicer and constructed as .gif file. Windows Media Player was used to broadcast them. Compared with the imaged obtained by Cad-cam apparatus, the information of cerebellar appearance obtained by 3D Slicer were more fully, the structure was truer, and the feeling of laminar was stronger.
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ: The rat cerebellum database through sectioning, aligning and segmenting is more suitable for 3D reconstruction of tissues microstructure.

Li L, Ding KK, Liu X, Li H, Song YZ, Jing P, Lu T.Reconstructing rat cerebellum microstructure database using 3D Slicer.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(22):4296-4299(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-22/22k-4296(ps).pdf]

摘要
目的：建立大鼠小脑外形三维重构的可视化数据集，为小脑中央核团的三维重建摸索一个可行的方案。
方法：实验于2003－03/2005－05在首都医科大学解剖教研室实验室完成。取SD大鼠5只，麻醉后处死取小脑，固定后进行冰冻连续切片、贴片，后经尼氏染色，用扫描仪对各切片进行投射扫描，图像大小为（1 868×1 491），获取原始图像数据库，并通过首都医科大学生物工程学院开发的配准软件及图像处理软件photoshop 7.0对数据库中的数据进行半自动配准及人工分割，应用哈佛大学开发的图像处理专业软件3D Slicer对分割后的数据库进行三维重建。并应用牙科Cad-cam仪器对小脑外形进行扫描，获取完整的小脑外形图像。
结果：①小脑尼氏染色获得的原始图像共159张，图像边缘清晰，可见深染的皮质和浅染的白质部分，白质间的小脑中央核深染，边界清晰。②共获得159个小脑外形的三维表面模型数据库(.vtk 文件)。在3D Slicer 应用程序上可选择小脑外形的三维表面模型数据进行三维显示，并构建了它们的动画显示文件（.gif），使用Windows Media Player 应用软件即可以播放；与应用牙科Cad-cam仪器对小脑表面扫描获取的小脑表面的图像比较，信息更饱满，图像更真实，层次感强。
结论：通过切片、配准、分割等方法获得了大鼠小脑外形微细结构信息的数据库，此法更适用于组织微细结构的三维重建。
关键词：小脑；三维重建；组织切片；3D Slicer

李莉，丁库克，刘霞，李慧，宋一志，景朋，陆涛.基于3D Slicer应用程序构建大鼠小脑外形微细结构信息数据库[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(22):4296-4299 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-22/22k-4296(ps).pdf]

随着计算机的广泛应用，利用计算机进行重建生物结构及功能正成为各国研究的热点。目前，美国、日本、韩国等国家相继开展了虚拟人的研究工作，开创了形态学数字化研究的里程碑[1]。中国也在2001年的“八六三”计划中批准并实施了虚拟人研究计划[2－5]。但各国的虚拟人研究仅仅基于大器官的重构，对于小器官、脑内核团及小血管等精细结构的重建尚不理想。既往的小脑外形的三维重建基于医学影像设备CT，MRI，PET等[6]，但仍不能有效地重构核团等微细结构。本实验采用组织切片染色技术，通过计算机图像处理软件对小脑的外形进行重建，以探索人体精细结构的三维重建，为相关结构的教学、科研等提供直观的、形象的、动态的图像。

设计：以动物为研究对象，单一样本实验。
单位：首都医科大学解剖教研室。
材料：实验于2003－03/2005－05在首都医科大学解剖教研室实验室完成。取SD清洁级大鼠5只，体质量250~300 g，雌雄不拘，由首都医科大学动物试验中心（许可证号为：scxk11-00-0012）提供。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第五、六、七作者，评估者为第三、四作者。
方法：
切片的获得：大鼠腹膜腔注射6%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉，在深度麻醉下，经左心室插管至升主动脉进行灌注固定。先用200 mL温台氏液冲洗，再灌注固定液，即含40 g/L多聚甲醛的冷（4 ℃）0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB，pH 7.3），持续30 min。灌注后，立即取出小脑，放入上述固定液中后固定3~5 h。然后将组织块置入含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PB（pH 7.3）中，放入冰箱(4 ℃)过夜。当组织块沉底后，用脑立体定位仪采用细针在小脑蚓部、脑干等处垂直扎3个孔以作配准参照。用Leitz Kryostat 1720式冰冻切片机作小脑横切位连续切片，片厚30 μm。将切片直接按顺序贴于载玻片上，经尼氏染色后，用乙醇逐级脱水，二甲苯透明，最后用树脂封固。
切片数据采集：将各切片放置于清华紫光扫描仪上，对各切片进行扫描，图像大小为（1 868×1 491），将获得的小脑切片的二维图像输入电脑，建立原始数据库。选择一套数据完整的图像进行随后处理。本实验以2号大鼠的数据库为依准。
配准及分割：图像配准是指对于一幅图像寻求一种?穴或一系列?雪空间变换，使它与另一幅图像上的对应点达到空间上的一致。这种一致是指机体同一解剖点在两张匹配图像上有相同的空间位置。配准的结果应使两幅图像上所有的解剖点，或感兴趣的点都达到匹配[2]。
以人机交互式半自动配准为原则。应用首都医科大学生物工程学院开发的配准软件及图像处理软件photoshop 7.0 在人工干预下进行图像配准。基于小脑中的3个配准标记点，得到每层的配准标记点，对相邻两层间的各标记点进行自动配准，最后手工进行细微调节，使所有图像相应点完全对准，达到最佳配准效果后，建立配准后数据库。
分割是将所要采集的目标图像与背景区分开来。应用图像处理软件photoshop 7.0将一幅图像打开，利用套索工具将目标图像的边界勾勒出来，填充前景色为白色（白色R=255，G=255，B=255），反选目标图像以外的区域即背景区，填充背景色为黑色(黑色R=0，G=0，B=0)，并将图像模式转换为灰度模式。这样，目标图像的灰阶值为255，背景区域灰阶值为0。逐一将所有图像全部分割。获得分割后数据库。本实验将小脑外形作为目标图像，采集分割后的小脑外形数据库。
三维重建：可视化技术依据连续图像，在计算机内部建立起组织、器官的三维结构，即三维重建。应用哈佛大学开发的图像处理专业软件3D Slicer对分割后的数据库进行三维重建及获得相应数据。根据分割后的图像分辨率、象素的长、宽、高等，输入3D Slicer中，并将分割后的二维数据的文件格式转化为3D Slicer可以自动导入的.0nn 体数据格式。本实验分割后的图像大小为1 868× 1 491，象素的长、宽=AB两点间的实际测量距离/AB间的象素值=19.8 mm/1 868= 0.011 mm/象素（AB为所扎3孔中的两孔），象素高=30 μm=0.03 mm。故而，每个象素代表的实际值为0.011 mm。这样，使得图像与重构物体间大小、形状等各方面都能相符，不致变形。将各种数据导入3D Slicer中，即可生成组织的表面模型。
应用牙科Cad-cam仪器对小脑扫描：将大鼠小脑表面用牙粉进行薄层喷涂后，应用牙科Cad-cam仪器对小脑表面进行扫描，获取小脑外表面的信息，并通过与仪器相连的计算机将扫描后获得的信息进行重构，并与3D Slicer重构的小脑外形进行比较。
主要观察指标：小脑外形形状及边界。

2.1 小脑尼氏染色获得的原始图像小脑尼氏染色获得的原始图像共159张，标记为NO.1～159，并对图像进行配准和分割等处理。图像1为6张连续的图像（NO.84～89）。可见小脑图片中有3个标记点，其中两个标记点在脑干上。图像边缘清晰，可见深染的皮质和浅染的白质部分。这些图像中（图2）均可见白质间的小脑中央核，深染，边界清晰。

2.2 小脑外形分割后的图像本实验对小脑外形进行分割，获得分割后的数据集。图3显示白色区域为目标区，背景为黑色，可见分割后的图像与原始图像的相应区域一致。

2.3 小脑外形三维重构与可视化结果共获得159个小脑外形的三维表面模型数据库(.vtk 文件)。在3D Slicer 应用程序上可选择小脑外形的三维表面模型数据进行三维显示。如图4所示为小脑外形模型在浏览过程中抓取的二维图像实例，并构建了它们的动画显示文件（.gif），使用Windows Media Player 应用软件即可以播放。
2.4 应用牙科Cad-cam仪器对小脑扫描的结果应用牙科Cad-cam仪器对小脑表面进行扫描，获取小脑外表面的信息，通过计算机获取小脑表面的多个图像，见图5。

3 讨论

位于颅后窝的小脑构成重要的运动通路，具有运动学习、调控等多种功能，接受来自脊髓、脑干、间脑及大脑皮质等部位的纤维传入，并发出纤维投射于上述部位[7－11]。对于小脑三维结构的研究，随着CT，MRI等影像学技术的迅猛发展不断深入地进行[12，13]。但对于核团等细微结构的重建仍待寻求好的方法。
目前，获得二维图像数据的方法主要有两种：一种是通过组织连续切片照相获得，一种是通过医学影像设备如CT，MRI，PET等方式获得。中国的可视虚拟人研究所获得的原始图像均是来自于机床的铣切及同步的数据采集系统[14]，铣切的进位即切片厚度为0.2 mm，对于大体结构的三维重建具有重要意义，并且在这方面诸多学者也发表了许多文章[15－20]，对于三维重构研究作出了很大的贡献。对于CT，MRI等方式获得的图像为灰度图像，图像信息不完整，对于软组织的识别不够理想。上述两种方式均对微细结构、核团等的识别存在缺陷。本实验为获得微细结构信息，采用脑立体定位仪用细针在小脑蚓部、脑干等处垂直扎3个孔作配准参照，用冰冻切片机作小脑横切位连续切片，并将切片直接按顺序贴于载玻片上，即边切片边贴片，尽可能保持片子完整及不变形，后经尼氏染色。用清华紫光扫描仪对各切片进行扫描，获取小脑切片的二维图像，最终获得完整、真实的原始图像数据库。并对原始数据库中的数据以人机交互式半自动配准为原则，进行配准，使所有图像相应点完全对准，达到最佳配准效果后，建立配准后数据库。应用图像处理软件，将配准后的所有图像进行分割，获得分割后数据库。应用3D Slicer软件对分割后的数据库进行三维重建并获得相应数据。此方法相对于应用CT，MRI等影像学技术不能很好重构的组织更为适合，获取的图像相对于应用牙科Cad-cam仪器对小脑表面进行扫描所获得的图像而言，信息更为饱满，图像更为真实，层次感更强，适用于组织的三维重建。
图像的配准和分割是进行三维重建的关键步骤。目前，配准的方式分为人工、半自动和自动三种。由于计算机自动配准往往准确性较差，故本实验采取半自动方式，在计算机自动配准的基础上进行人工干预，进行细微的调节。图像的分割可以根据图像灰度、颜色、纹理等特征进行计算机的自动的分割，但往往带有局限性和不准确性，而人工分割是利用图像分析软件及相关背景知识达到将目标区域分割出来的目的。本实验采用人工分割的方法，将具有彩色的图像分割为3D Slicer所能辨认的.bmp格式的黑白灰度图像，从而保证了分割的准确性。
本实验应用的3D Slicer软件还具有测量功能，可对小脑的体积、表面积、长、宽、高等数据进行测量分析，为研究小脑的功能、形态结构提供重要的解剖学参考。本实验是对大鼠小脑外形进行的三维重构，为进一步对核团的重构寻求方法学上的可行性。

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