中国组织工程研究与临床康复 2007年 第11卷 第5期
人工角膜的一体式制备及其增韧方法
刘妍君1，胡 平1，许 波1，黄一飞2，1清华大学化工系高分子研究所，北京市 100084；2解放军总医院眼科实验室，北京市 100853
刘妍君，女，1982年生，天津市人，汉族，清华大学化工系高分子研究所在读硕士，主要从事生物材料的研究。
liuyanjun04@mails.tsinghua.edu.cn
通讯作者：胡 平，教授，清华大学化工系高分子研究所，北京市 100084 hspinghu@mail.tsinghua.edu.cn
国家自然科学基金资助项目（30471734，30571839）
收稿日期：2006-10-10修回日期：2006-11-29(06-50-10-7266/M·Y)
摘要
目的：运用本体聚合的方法一体成型制备人工角膜，解决移植人工角膜手术中多孔裙边和光学中心两部分脱离及被眼球自发排出的问题，以及人工角膜强度的问题。
方法：实验于2005－05/2006－05在清华大学化工系高分子研究所和解放军总医院眼科实验室完成。①采取本体聚合的方法来制备人工角膜，一次性制得光学中心和多孔裙边，不使用任何粘结剂。②利用NaCl粒子的大小控制多孔裙边的孔径，采用（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸甲酯本体共聚和制成聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯－聚氨酯复合物两种方法增强多孔裙边，分别测量了两种方法增强后的人工角膜的撕裂强度。③分别通过白兔角膜移植和大鼠皮下埋植的方法来研究所制备的人工角膜的生物相容性及细胞长入情况。
结果：①采用NaCl作为成孔剂，制备的人工角膜多孔裙边中的孔呈现通孔的形态，这种结构非常适合细胞和组织的长入。②与20%(体积百分比)的甲基丙烯酸甲酯共聚改性后材料的撕裂强度是未改性前材料撕裂强度的460%，聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯－聚氨酯复合物的撕裂强度则可达未改性前材料撕裂强度的1
920%。③组织切片表明改性后材料具有良好的生物相容性。
结论：在本体聚合制备聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯人工角膜的基础上，提出两种不同机制的生物相容性多孔裙边增韧方法，大大提高了人工角膜的撕裂强度，可以取代目前溶液聚合制备水凝胶人工角膜的方法。
关键词：人工角膜；本体聚合；聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯；一体式；增韧
Preparation of artificial cornea and its toughening
Liu Yan-jun1,
Hu Ping1, Xu Bo1, Huang Yi-fei2
1Institute of
Polymer Science and Engineering, Department of Chemistry, Tsinghua University,
Beijing 100084, China; 2Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Liu Yan-jun, Studying for master’s degree, Institute of Polymer Science and
Engineering, Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China
Liuyanjun04@mails.tsinghua.edu.cn
Correspondence to: Hu Ping, Professor, Institute of Polymer Science and
Engineering, Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China
Supported by: the National Natural Science
Foundation of China, No. 30471734, 30571839
Received: 2006-10-10 Accepted: 2006-11-22
Abstract
AIM: Bulk
polymerization is used in this paper to prepare the artificial cornea and solve
2 kinds of problems during the artificial cornea replant operation: detachment
between porous skirt and central optic region; self-expelled by the eyeball.
Additionally, the intensity of artificial cornea is investigated.
METHODS: The research was
carried out from May 2005 to May 2006 by Institute of Polymer Science and
Engineering, Department of Chemistry, Tsinghua University and Department of
Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital.①Bulk polymerization was
used to prepare an
artificial cornea with a central optic region surrounded by a porous skirt,
which was simultaneously produced without using any adhesives.②The size of
pores in the porous skirt was controlled by NaCl particles. Two different ways,
bulk copolymerization with methyl methacrylate (MMA) and poly (2-hydroxyethyl methacrylate)-polyurethane (PHEMA-PU) composite,
were introduced to toughen the porous skirt, and the tear resistances of two
kinds of artificial cornea were tested.③Through the methods of white rabbit cornea
replantation and rat subcutaneous burying respectively, we studied the
biocompatibility and the cell generation of the prepared artificial cornea.
RESULTS: ①NaCl was used as the porosifier to prepare
artificial porous skirt and most of the pores in the skirt presented open
shapes. This kind of structure was very suitable for the generation of cells
and tissues. The amount of NaCl particles remnants was so small (3%-4% of total
sample weight) that could be ignored.②The
tear resistance of PHEMA which copolymerized with 20% (volume percentage) MMA
was 460% of that of the pure PHEMA. The tear resistance of PHEMA-PU composite
was 1 920% of that of the pure PHEMA.③Histological sections revealed that two kinds of toughened
porous skirts were quite suitable to be implanted due to good biocompatibility.
CONCLUSION: Based on bulk polymerization of
PHEMA artificial cornea, we use 2 biocompatibility methods to increase the
toughness of porous skirt, which greatly increase the tear resistance of
artificial cornea. The methods in this paper can replace the method of commonly
used solution polymerization to prepare hydrogel artificial cornea.
课题背景：国内外的文献资料显示，人工角膜在制作上的问题多集中在光学中心部分与多孔裙边部分如何有机紧密粘结成为一个整体的问题上，而在性能方面的问题则主要集中在怎样提高以纯（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯聚合物为基的人工角膜（光学中心及其周边多孔部分）的生物相容性以及强度方面，其中关键的问题在于对聚合物性能的改善。
创新要点：①对支架材料聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯进行改性，提高其抗撕裂性能。②文章提出了一次性合成具有光学中心和多孔裙边结构的人工角膜的新方法；采用了两种方法提高纯聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯的撕裂强度，一是利用甲基丙烯酸甲酯单体与（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯单体进行共聚，二是利用聚氨酯用单体（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯溶胀后聚合，以达到提高材料多孔部分撕裂强度的目的。
术语解析：①本体聚合：不加其他介质，只有单体本身，在引发剂、热、光等作用下进行的聚合反应。②溶液聚合：单体，引发剂在适当溶剂中的聚合过程。
0 引言
角膜移植是治疗各种原因所致角膜混浊、视力障碍的有效方法，而供体角膜来源困难，人工角膜则成为挽救和恢复患者视力的有效方法[1，2]。研究者曾采用聚甲基丙烯酸甲酯、硅胶和丙烯酸、钛金属、尼龙、陶瓷、碳纤维、羟基磷灰石、自体牙齿、骨或软骨等设计制造人工角膜[1，3－8]。上世纪80年代以来，人工角膜的研究多集中在周边多孔性支架材料方面[9－13]，许多材料难以和眼组织融合，易产生并发症，有异物感[14,15]。聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯水凝胶具有优良的光学性能和良好的亲水性，是一种在眼科领域中被广泛应用的生物材料[16,17]。
“中心－裙边”结构的思想已经取代了传统的单片式的思想。中心可透光，称为光学中心；裙边是紧密包围在光学中心边缘的多孔区域，用以固定光学中心，孔的存在是为使组织很好的长入[18]。此两部分的脱离及被眼球自发排出使大量的人工角膜手术失败[19，20]。
本文采用本体聚合代替了溶液聚合来制备以聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯为基材的一体式人工角膜。研究了两种方法提高多孔裙边的撕裂强度。增强后的人工角膜植入动物体内观察其应用效果及生物相容性。
1 材料和方法
设计：观察对比实验。
单位：清华大学化工系高分子研究所。
材料：实验于2005－05/2006－05在清华大学化工系高分子研究所和解放军总医院眼科实验室完成。（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸甲酯从华北地区特种化学试剂开发中心购得，偶氮二异丁腈与N，N－亚甲基丙稀酰胺从北京益利精细化学品有限公司购得，均为分析纯。新西兰白兔9只，体质量2～2.5
kg，雌雄不拘；大鼠9只，体质量200 g，雌雄不拘。均由解放军总院实验动物中心提供。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者、资料收集为第三作者、实施为第三作者、评估为第一作者，采用盲法评估。
方法：
人工角膜的制备：Ⅰ制备以聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯为基的人工角膜：①在洁净的烧杯中加入定量（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯，N，N－亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）、偶氮二异丁腈（引发剂），搅拌至均一的溶液。②将食盐筛出直径在200～300
μm的粒子，干燥在模具中堆砌成中空圆柱，置于洁净烧杯中；将①溶液倒入中空圆柱，氮气保护，密封，50 ℃ 烘箱中反应12 h，升温至75 ℃，继续反应12 h取出。③把已成型的人工角膜毛坯切割、打磨成人工角膜的尺寸，浸泡于去离子水中，25
℃ 下每8 h更换去离子水，72 h取出。
Ⅱ与甲基丙烯酸甲酯本体共聚增强多孔裙边：①在洁净的烧杯中量取一定比例的（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯一定量的N，N－亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）、偶氮二异丁腈（引发剂），搅拌至均一的溶液。②同Ⅰ②。③同Ⅰ③。
Ⅲ聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯－聚氨酯复合增强多孔裙边：①同Ⅰ①。②将食盐筛出直径150～300
μm的粒子，干燥；将饱和聚氨酯溶液与盐粒搅拌混合（10 mL四氢呋喃20 g盐粒），灌注于模具中，紧密压实，放置12 h，真空干燥12 h，制成中空圆柱，浸渍于①溶液中，氮气保护，密封，溶胀12
h；50 ℃ 下，反应12 h，升温至75 ℃，继续反应12 h取出。③同Ⅰ③。
材料的性能测试：热失重分析：3种方法制备的样品氮气保护，20 ℃/min升温。
扫描电镜分析：3种方法制得的样品冷冻干燥3 d，浸入液氮15 min，切割得到截面喷金，Hitachi
s450型扫描电镜观察，电压20 kV。
力学性能测试：3种方法制得的样品吸去表面水分，利用标准裤形刀具将其切割成撕裂样条。TS-2000电子拉伸机25
℃ 10 mm/min的速度湿态拉伸样条，测试样条撕裂强度。
动物实验：
大鼠实验：水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5 mL/kg），背部皮下埋植5
mm×6 mm×3 mm高压蒸汽灭菌的人工角膜材料，不用抗生素。分别于术后1，2，3个月取出材料，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，10 μm切片染色。
白兔实验：
兔的角膜瘢痕血管化模型：用复方麻宝静肌注0.1 mL/kg完全麻痹，用直径为15
mm的圆形滤纸片蘸取1 mol/ L氢氧化钠溶液贴于兔角膜正中，灼伤后用生理盐水迅速冲洗5 min，眼膏涂结膜囊，抗生素应用3个月。
人工角膜植入：360°分离结膜，9 mm环钻钻除中央混浊角膜，前房给予少量的黏弹剂，取直径为8
mm人工角膜，8-0尼龙线间断缝合至角膜植床上，BBS冲洗。将结膜－Tenon瓣完全覆盖于人工角膜上，8-0尼龙线间断缝合。球结膜下注射DG合剂，眼膏涂结膜囊。
组织观察：分别于术后1，2，3个月取出角膜，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，5
μm切片染色。
主要观察指标：①人工角膜的制备及其增韧。②材料的性能测试。③组织学观察结果。
2 结果
2.1 以聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯为基的一体式人工角膜制备及其增韧 见图1。
从图1a，b可以看出，光学中心区域和多孔裙边部分结合紧密。图1c是经过机械加工的特定尺寸的人工角膜。两种增韧方法制得的人工角膜光学中心和多孔裙边均与未增韧水凝胶同样柔软，且光学中心和多孔裙边是同时成形的，不采用任何黏结剂。
由图2可以得到，NaCl粒子有可能被包埋在聚合物内部，而植入白兔体内的样品厚度在1
mm左右，经过浸泡溶胀后，残余的NaCl量极少（3%～4%总重），可以忽略不计。
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图1 实验室制备的（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸甲酯的共聚物人工角膜
a：未加工的人工角膜粗坯; b：a图中光学中心部分的放大图(×20); c：机械加工后的人工角膜
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2.2 扫描电镜分析 见图3。由图3可以看出，制备得到的人工角膜多孔裙边呈现通孔形态，这种结构适合细胞和组织的长入。孔的平均直径为250 μm，可由NaCl颗粒的尺寸来调节。
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a （2－羟基）甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸甲酯共聚物多孔裙边
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b 聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯－聚氨酯复合物多孔裙边
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图3 两种方法制备多孔裙边扫描电镜分析
2.3 力学性能测试 见图4。
本体聚合所得聚合物的强度比溶液聚合得到的聚合物高，在采用甲基丙烯酸甲酯共聚增强的实验中，聚合物的撕裂强度随着甲基丙烯酸甲酯含量的增加而增强，含20%体积甲基丙烯酸甲酯的共聚物的撕裂强度是未改性前材料撕裂强度的460%。聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯－聚氨酯复合物的撕裂强度则可达未改性前材料撕裂强度的1
920%，多孔裙边部分的抗撕裂性能也有令人满意的提高。
2.4 组织学研究 图5为方法Ⅱ制得样品的大鼠组织切片照片，细胞已经大量长入材料多孔部分，血管基本消失。方法Ⅲ得到了相类似的结果。
白兔人工角膜组织学研究结果显示两种方法制备的材料孔隙均为新生组织充填。
手术后新西兰兔没有任何不良反应，打开结膜4个月后，人工角膜仍正常工作，没有被排出，且无坏死组织出现，无不良炎症反应。
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图5 （2－羟基）甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸甲酯共聚物多孔裙边 (苏木精-伊红染色, ×400)
a：1个月; b：2个月; c： 3个月
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3 讨论
与国际流行的聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯水凝胶溶液聚合不同，利用聚合物溶胀现象，国内首次通过本体聚合制备聚（2－羟基）甲基丙烯酸乙酯一体化人工角膜；在本体聚合中引入成孔剂，方便的控制了孔径，在本体聚合的基础上，提出两种生物相容性多孔裙边增韧方法，大大提高了人工角膜的撕裂强度撕裂强度随着甲基丙烯酸甲酯单体体积百分比的增大而增加，而溶胀聚合之后的共聚物的撕裂强度，提高更加明显；本体聚合优点突出，生物相容性优良，可以取代目前溶液聚合制备水凝胶人工角膜的方法。
4 参考文献
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