中国组织工程研究与临床康复 2007年 第11卷 第5期
双极射频能量对人膝关节软骨的急性效应
茅泳涛，董启榕（苏州大学附属第二医院骨科，江苏省苏州市 215004）
茅泳涛，男，1974年生，江苏省启东市人，汉族，2006年苏州大学毕业，硕士，医师，主要从事关节外科的研究。 szgk@szgk.net
通讯作者：董启榕，教授，博士生导师，苏州大学附属第二医院骨科，江苏省苏州市 215004 dqr@szgk.net
摘要
目的：了解双极射频能量对纤维化软骨的治疗效应。
方法：实验于2005－08/2006-12在苏州大学附属第二医院骨科实验室完成。①选用全膝置换术后的股骨髁软骨共9例11膝，内外髁分成不同样本，共计22份。采用美国杰西实业有限公司的Atlas等离子手术系统，3.5mm Right Angle射频头，能量设置分别为：0级、2级、6级。②选择股骨髁表面软骨II级或III级病变区域，将其分成3个区：1区：假手术组，2区：2级射频能量治疗组，3区：6级射频能量治疗组。在室温生理盐水匀速持续灌洗状态下，分别用2，6级射频能量治疗，直至大体观察表面平整，色泽轻度改变。假手术组不开射频，只是模拟射频治疗。③术后将样本分别置于40g/L甲醛溶液中固定进行组织学检查。另取二处II级病变区域，选择一块作6级射频治疗，另一块假手术处理，处理后送作扫描电镜检查。
结果：①股骨髁表面软骨大体观察：可见假手术组关节软骨表面苍白，纤维毛糙；治疗区关节软骨表面光滑，平整。在2级能量作用区和6级能量作用区并没有发现外观上的明显差异。②组织学观察：苏木精-伊红染色见假手术组软骨表面凹凸不平，有纤维碎片形成。治疗区软骨表面平滑，软骨陷窝间或呈空泡状，不同能量设置的切片观察结果相似。Masson染色发现假手术组软骨表面纤维化明显，在纤维化的软骨表面下可以见到蓝染加深，而基底部相对较浅。治疗区软骨表面平整，对胶原染色没有明显影响。不同能量设置的切片观察结果相似。③扫描电镜结果：显示病变软骨表面纤维化明显，纤维碎片形成。治疗后可见胶原纤维融合，表面变平，碎片消失。
结论：纤维化软骨经过射频治疗后，其表面形态及基质得到了良好的改善。
关键词：导管消融术；软骨，关节；纤维化
Acute
effect of bipolar radiofrequency energy on human knee articular cartilage
Mao
Yong-tao, Dong Qi-rong
Department
of Orthopaedics, Second Affiliated Hospital, Suzhou University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Mao
Yong-tao, Master, Physician, Department of Orthopaedics, Second Affiliated
Hospital, Suzhou University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Correspondence
to: Dong Qi-rong, Tutor of doctor, Professor, Department of Orthopaedics,
Second Affiliated Hospital, Suzhou University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Received: Accepted:
Abstract
AIM: To
evaluate the therapeutic effect of bipolar radiofrequency energy in fibrillated
cartilage.
METHODS:
The experiment was carried out in the laboratory of the Department of
Orthopaedics, Second Affiliated Hospital, Suzhou University from August 2005 to
December 2006. ①The fibrillated cartilage of twenty-two femoral
condyles of eleven knees from 9 cases after total knee arthroplasty were
enrolled. With Atlas DNR operation system produced by American Jiexi Shiye Co.,
Ltd. and 3.5mm
Right Angle radiofrequency head, the energy was composed of 0 grade, 2 grade
and 6 grade. ②The cartilage with
outerbridge classification Ⅱ or Ⅲ partial-thickness
lesions were divided into three districts: district one: sham operation group;
district two: treatment group using radiofrequency energy of grade two;
district three: treatment group using radiofrequency energy of grade six.
Lavaged by saline of room temperature with equal speed, the radiofrequency
energy of grades two and six was performed until smooth surface of samples and
slight change of color were produced. The treating mode was same in shame
operation group, although radiofrequency energy was shut. ③The
samples were sent for histological observation after being fixed in 40 g/L formalin. Another two cartilage samples of
outerbridge Ⅱ lesions were selected to be treated by
radiofrequency energy of grade six or sham operation, respectively, and then
sent for analyzed by scan electron microscope (SEM).
RESULTS: ①Gross
inspection: the cartilage surface of sham operation group was pale and
roughness; smooth surface was acquired after treatment. No significant
difference appeared between grade two and grade six group. ②HE
staining observation: accidented surface with fibrillar fragment was found in
sham operation. Smooth surface with chondrocytes variably filling the lacunae
was observed after treatment, no histological differences among the sites
treated by different settings. Masson staining found significant fibrilar
surface of cartilage in the sham operation group, and deep blue stain was found
under fibrillar surface, while shallow in basilar part. Smooth surface of
cartilage appeared after treatment. No obvious effect was found by collagen
staining. No difference was found in Masson staining after treatment of
different grade. ③SEM: A rough surface with fibrillar fragment was
presented in partial-thickness lesions district. The fiber was melt and surface
became smooth without fribrillar fragment after treatment.
CONCLUSION:
After fibrillated articular cartilage received radiofrequency energy, its
surface and matrix are improved satisfactorily.
背景资料：各种原因所致的膝关节骨关节炎，均以软骨损伤退行性变为基础。软骨病变是连续的，微小的损伤即可慢慢扩散，软骨成形术即是对II级及III级软骨病变进行处理，阻止病变的进一步发展。射频技术由于价格相对低廉，使用方便，对安全性方面的顾虑小，有着机械清理所不能达到的优良效果，近几年在关节镜外科领域得到了广泛的应用。
应用意义：①本实验结果显示软骨经过射频治疗后，其表面形态及基质得到了良好的改善，使原本软化的治疗区域坚固，损伤区域的软骨边缘随之坚硬，产生了良好的治疗效应。②还能清除多余的软骨碎片，从而控制炎症介质的释放，对阻止病变的进一步发展起着重要的作用。③实验结果还证实了双极射频能量对纤维化软骨的处理有临床应用价值。
名词解释：射频技术：采用的是一种“低温消融”的技术，该技术利用射频（频率在300kHz～13MHz之间）所产生的能量，将射频电极与组织之间的电解液转换成等离子层，等离子体中的带电粒子将能量传给受作用组织，打开组织分子键，使目标组织中的细胞在分子水平上分解为简单的碳水化合物和氧化物，以分子为单位逐渐解体并脱落。
0 引言
各种原因所致的膝关节骨关节炎，均以软骨损伤退行性变为基础。病变首先表现为软骨软化，逐渐出现纤维化和龟裂，并可向周围及深层发展，最终发展为全层软骨损伤，以致软骨下骨外露。软骨病变是连续的，软骨成形术可以对II，III级软骨病变（Outerbridge分期）进行处理，阻止病变的进一步发展。利用射频能量进行软骨成形术由于价格相对低廉，使用方便，近几年得到了广泛的应用。本实验利用普通光镜、组织染色以及电镜观察来检测射频治疗后的软骨变化，明确射频能量对软骨病变的治疗效应。
1 对象和方法
设计：对比观察。
单位：苏州大学附属第二医院骨科。
对象：实验于2005－08/2006-12在苏州大学附属第二医院骨科实验室完成。选用全膝置换术后的股骨髁软骨（研究中均已向患者告知研究方法及目的，并获取其理解和同意），共9例11膝，内外髁分成不同样本，共计22份。仪器：Atlas等离子手术系统（美国杰西实业有限公司），3.5mm Right Angle射频头，能量设置分别为：0级、2级、6级。
设计、实施、评估者：设计实施者为第一、二作者，评估者为第二作者，均受过专业培训。
方法：
取材：选择股骨髁表面软骨II级或III级病变区域，使用蓝色标记液（美蓝）将其分成3个区：1区：假手术组，2区：2级射频能量治疗组，3区：6级射频能量治疗组。置于自制容器中，接室温下生理盐水，在匀速持续灌洗状态（模拟关节镜手术时环境）下，分别用2，6级射频能量治疗，治疗方式模仿临床手术。正确设置能级后，脚控开启射频能量，Right
Angle直角射频头逐渐靠近软骨表面治疗区域进行消融，但尽量不接触组织，直至肉眼下表面平整，色泽轻度改变（由白色至轻度黄色）。2级能量治疗完2区后，设置6级能量对3区进行治疗。假手术组不开射频，只是模拟射频治疗，仅作射频头轻轻接触。术后将样本分别置于40g/L甲醛中固定7d～1月，直至进行组织学检查。另取二处II级病变区域，选择一块作6级射频治疗，另一块假手术处理，置于生理盐水冲洗多次，再置于电镜固定液中，送作扫描电镜检查。
软骨组织学观察：将固定后的组织块使用EDTA彻底脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋，作5μm切片，分别进行苏木精-伊红染色和Masson染色。另两份标本置于生理盐水中，多次冲洗，以洗净表面，固定于电镜固定液（戊二醛磷酸盐缓冲液冲液）中，进行扫描电镜观察。
主要观察指标：股骨髁表面软骨大体观察、组织学染色及扫描电镜观察结果。
2 结果
2.1 股骨髁表面软骨大体观察结果：假手术组关节软骨表面苍白，大量纤维形成，部分区域有蟹肉样外观，凹凸不平，触之质软；治疗区关节软骨表面色泽变白或微黄，偶有焦黑斑，表面光滑，平整，边缘较硬。在2级能量作用区和6级能量作用区并没有发现外观上的明显差异。
2.2 股骨髁表面软骨组织学染色结果：苏木精-伊红染色见假手术组软骨表面凹凸不平，有纤维碎片形成，可见分层现象，靠近基底部可见同源细胞群。治疗区软骨表面平滑，软骨陷窝间或呈空泡状。不同能量设置的切片观察结果相似。Masson染色发现假手术组软骨表面纤维化明显，软骨陷窝周围蓝染较深，表示细胞分泌旺盛，在纤维化的软骨表面下可以见到蓝染加深，表面胶原分泌旺盛，而基底部相对较浅。治疗区软骨表面平整，对胶原染色没有明显影响。各组软骨陷窝空泡数相似，软骨深层可见软骨细胞随机填满陷窝。不同能量设置的切片观察结果相似。
2.3 股骨髁表面软骨扫描电镜观察结果：假手术组病变软骨表面纤维化明显，凹凸不平，多处龟裂，纤维碎片形成(见图1)。治疗区可见胶原纤维融合，表面变平，碎片消失（见图2）。
a：（×100） b：（×500） c：（×1000）
图1 扫描电镜观察假手术组病变表面纤维化明显，龟裂，纤维碎片
a：（×100） b：（×500） c：（×1000）
图2 扫描电镜观察治疗组股骨髁表面软骨治疗后，软骨表面平整，纤维融合
3 讨论
软骨的损伤破坏了关节的协调性，对软骨下骨失去了保护作用，并有促进软骨基质内蛋白聚糖及纤维碎片释放的作用，其结果是导致滑膜炎以及关节炎症，纤维化的软骨也是机械和化学的刺激源[1]。软骨病变是连续的，微小的损伤即可慢慢扩散。对于关节软骨的非全层损伤的治疗比较困难，软骨成形术即是对II，III级软骨病变进行处理，阻止病变的进一步发展。机械清理一度为软骨成形术的标准方式，但是机械的刨削打磨无法加以良好的控制，往往去除了过多的健康软骨，且不能获得平滑的软骨表面，从而难于阻止软骨病变的加重[2，3]。激光技术能够修整软骨表面使之平滑，具备一定的治疗作用，但是高温烧灼使软骨全层受损，甚至导致软骨下骨缺血性坏死，以及有发生激光介导的关节滑膜炎等并发症的可能[4，5]。
射频技术采用的是一种“低温消融”的技术[6]，该技术利用射频（频率在300KHz－13MHz之间）所产生的能量，将射频电极与组织之间的电解液转换成等离子层，等离子体中的带电粒子将能量传给受作用组织，打开组织分子键，使目标组织中的细胞在分子水平上分解为简单的碳水化合物和氧化物，以分子为单位逐渐解体并脱落。
在Turner等[7]对28只模拟软骨软化的母羊模型进行射频以及机械刨削的对照研究中，发现假手术组的软骨细胞优于双极射频治疗组，双极射频治疗组显著优于机械刨削组，在所有的组织切片中没有发现软骨下骨损伤。作者认为比起机械刨削，双极射频破坏的软骨较少，是一个较好的手术方式。Kaplan等[8]在对施行全膝置换术后的六例膝关节股骨髁软骨的研究中，亦发现治疗区域软骨细胞活性正常，软骨细胞及基质同对照组相比没有显著的变化，作者认为在关节软骨使用射频能量是安全有效的。Yasura等[9]同样发现射频治疗能改善软骨表面的形态，且并没有改变软骨的刚度。
在Lu等[10-13]的一序列研究中，发现射频治疗后，软骨细胞有大量死亡的现象，但也发现双极射频能起到修整、平滑表面的作用，在一个实验对象为羊的最长达24周的研究中[10]，作者发现其治疗后的股骨髁软骨比未治疗的股骨髁软骨要平滑得多。
从本实验中可以看到：II级和III级病变的软骨表面软化，纤维形成，凹凸不平，射频治疗后，表面光滑平整，边缘变硬，可见双极射频能量可以很容易地消融软骨表面不平的部分，从而使之光滑平整。在射频治疗时，还能控制治疗区域大小，不会清理过多的软骨组织，不会遗留不平区域，机械刨削则不可能使治疗区保持平滑。研究发现[14,15]：II型胶原在受热至60℃时能从高组织度的半晶体性转变为融化的胶态。氢键连接在60℃时被打破，分子结合、直径增加。三螺旋结构转变为短的自由螺旋，连接区域被热能打破。在本实验中观察到软骨更平滑，有色泽改变，纤维化软骨的皱缩以及融合在实验中很明显。
另外，消融时可以使原本软化的治疗区域坚固，损伤区域的软骨边缘随之坚硬，这将产生良好的治疗效果。由于清除了多余的软骨碎片，可以控制炎症介质的释放，对阻止病变的进一步发展起着重要的作用。此外还可以看到，假手术组中纤维化的软骨表面胶原染色减弱或消失，说明胶原已变性，其下由于软骨细胞分泌功能旺盛，所以胶原纤维染色较深。射频治疗后，表面变性的胶原纤维被清除，而其下的胶原染色没有明显变化，即射频对软骨的基质成分没有影响。平滑表面的产生，表面基质质量的改善，使得关节表面得到功能上的重建。这会给关节表面应力的承载以及润滑带来好处，而且可以阻止关节液体从破碎处进入关节软骨导致进一步的分层现象。
在射频能量对软骨细胞的安全性方面存在一些争议[16,17]，Lu 等的研究结论是：软骨细胞在射频治疗后会大量死亡，据此他们认为软骨的“二次退变”不可避免。不过此结论并没有被其他研究者认可，新近Caffey等[18]利用骨关节炎患者行全膝关节置换术后的的股骨髁软骨对5种关节镜射频系统进行了比较，发现软骨细胞死亡深度为（479～1124）μm。在本实验中可以发现，射频能量设置为2级和6级时，其软骨表面治疗后的形态以及分子学检查并没有显著差别。能级设置是影响软骨细胞活性的主要因素[19,20]，因此，基于对软骨细胞的安全性考虑，在保证治疗目的的前提下，应尽可能地降低治疗时的射频能量。
在有限的临床研究中：Owens等[21]对39例II到III级的女性髌骨软化病例分别进行了双极射频（20例）和机械切削（19例）治疗。发现双极射频治疗组的膝关节功能改善优于机械切削组。Greenleaf等[22]对患者的二次关节镜检查结果发现90％的病变得到了改善，而且没有发现并发症、坏死以及关节软骨破裂。其他研究者[23-25]也发现双极射频治疗有优异的临床效果。
射频治疗的临床效果可以由本实验的结果来说明，平滑坚硬的软骨表面，基质纤维的重构，炎症介质的释放被抑制等因素对预后的好处是显而易见的。因此可以得出结论：软骨经过射频治疗后，其表面形态及基质得到了良好的改善，从而促使膝关节带来良好的功能恢复。
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