几丁糖对扩张后皮瓣纤维包膜中胶原含量的影响

几丁糖对扩张后皮瓣纤维包膜中胶原含量的影响**

仇树林，闫焱，张培培，赵伟，朱昊，褚国华，冯敏，韩胜，李兵

课题背景：课题系关于几丁糖对扩张后皮瓣纤维包膜影响的系列研究，分动物实验与临床研究两部分；动物实验部分已经完成，临床应用部分预计2008年6月完成。近年来很多学者尝试应用药物干预扩张后皮瓣纤维包膜的形成过程，但在药物的选择上均不理想。

应用要点：将几丁糖应用于扩张器植入后纤维包膜的研究并无先例。实验中发现，几丁糖的应用不仅可以减弱纤维包膜的弹性回缩作用，同时又不影响纤维包膜对皮瓣的营养作用。若将此方法推广应用于临床，可以有效提高扩张后皮瓣的利用率，课题具有实用意义。

偏倚或不足：①实验采用大白兔作为实验对象，不能真实体现几丁糖对人体纤维包膜胶原含量的影响。现在已开始临床实验。②已有研究表明多种药物可以减少纤维包膜挛缩，在今后的研究中将把几丁糖与这些药物进行对照。③实验现仅进行了组织学观察，对其内在机制及作用机制还缺乏认识，这将成为该课题今后的研究方向。

河北省人民医院整形外科，河北省石家庄市?? 050051

仇树林，男，1952年生，河北省平山县人，汉族，1978年河北医科大学毕业，主任医师，主要从事皮瓣移植、创伤修复的研究。
Qiushulin8229@ sina.com

摘要
目的: 近年来很多学者尝试应用药物干预扩张后皮瓣纤维包膜的形成过程，但在药物的选择上均不理想。观察几丁糖应用前后纤维包膜中胶原纤维含量及扩张后皮瓣回缩率的变化规律，分析几丁糖对纤维包膜中胶原含量的影响。
方法: 实验于2006-03/11在河北省人民医院临床研究中心完成，动物实验方法符合动物伦理学要求。①实验材料及分组：选用新西兰大白兔15只，每只背部中段脊柱两侧旁开3 cm处设为扩张区，均将左侧设为几丁糖组，右侧设为对照组。②实验方法：几丁糖组在腔隙内注入20 g/L医用几丁糖0.5 mL，再植入20 mL皮肤软组织扩张器1枚；对照组常规植入20 mL皮肤软组织扩张器1枚。待实验动物切口愈合拆线后开始扩张注水，每只皮肤软组织扩张器注水达到40 mL后停止注水。③实验评估：于停止注水10 d后，切取两组扩张器表面相同部位纤维包膜及带纤维包膜皮瓣，用图像分析法计算各组织块收缩率；取纤维包膜组织作常规苏木精-伊红染色、Masson染色进行光镜观察，并应用真彩病理图像分析系统测量平均灰度，对比两组之间的差异。
结果: 实验设置几丁糖组和对照组各15例，全部取材成功。①几丁糖组纤维包膜组织平均灰度值显著高于对照组（170.383± 14.313，159.762±10.623，P < 0.05）。②几丁糖组扩张后皮瓣回缩率显著低于对照组[（43.371±7.312）%，（45.637±6.613）% （P < 0.05）]。
结论: 应用几丁糖干预纤维包膜的形成过程，可以使纤维包膜中胶原含量降低，从而可以有效减少扩张后皮瓣的回缩率。
关键词: 外科皮瓣；几丁糖；组织扩展器；胶原；成纤维细胞

仇树林，闫焱，张培培，赵伟，朱昊，褚国华，冯敏，韩胜，李兵．几丁糖对扩张后皮瓣纤维包膜中胶原含量的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):1-4 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-1(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00001-04

Influence of chitosan on collagen content in the fibrous capsule of expanded skin flap

AIM: In recent years, many researchers try to intervene the expanded skin flap by medicine, but medicine selection is disturbing them. This study observed the change rules of the content of collagen fiber in the fibrous capsule and the shrinkage rate of expanded skin flap by using chitosan, so as to explore the influence of chitosan on the content of collagen in fibrous capsule.
METHODS: The experiment was performed at the Clinical Research Center of Hebei Provincial People's Hospital from March to November 2006. The experimental procedure was accorded with the animal ethical standards. ①Fifteen New Zealand White rabbits were selected. Each animal was made two 3 cm incisions on both sides of back on the deep layer of subcutaneous superficial fascia. The left side served as chitosan group and the right as control group. ②0.5 mL (20 g/L) medical chitosan was injected into the lacunes of chitosan group and a 20 mL skin soft-tissue expander was implanted subsequently. The control group was only implanted a 20 mL skin soft-tissue expander conventionally. When the wound healed, water was injected into the expander until 40 mL. ③Ten days post-injection, the fibrous capsule around the expander and the skin flap with fibrous capsule at the same site of two groups were harvested. The shrinkage rate was calculated using image analysis method. The fibrous capsule was taken to make HE staining and Masson staining slices and observed under light microscope. The mean gray scale was measured with pathology image analysis system. The difference between the two groups was observed.
RESULTS: Fifteen animals in each group were involved in the result analysis. ①The mean gray scale of chitosan group was significantly higher than that in control group (170.383±14.313, 159.762±10.623, P < 0.05). ②The skin flap shrinkage of chitosan group was significantly lower than that in control group [(43.371±7.312)%, (5.637±6.613)%, P < 0.05].
CONCLUSION: Chitosan can reduce the content of collagen fiber in fibrous capsule and decrease the shrinkage rate of the expanded skin flap efficiently.

Qiu SL, Yan Y, Zhang PP, Zhao W, Zhu H, Chu GH, Feng M, Han S, Li B.Influence of chitosan on collagen content in the fibrous capsule of expanded skin flap.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):1-4(China)?????[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-1(ps).pdf]

皮肤软组织扩张术现已成为整形外科常规治疗手段之一，但仍有诸多问题有待研究探讨，其中扩张器植入后的纤维包膜形成是影响其疗效的重要因素之一。本实验以几丁糖作为干预药物，对新西兰大白兔埋植的皮肤软组织扩张器纤维包膜形成过程实施干预，比较干预组与对照组纤维包膜中的胶原含量，以求证几丁糖对扩张后皮瓣纤维包膜形成及其降低扩张后皮瓣回缩率的作用。

1 材料和方法

设计：随机分组设计，对照动物实验。
单位：河北省人民医院整形外科。
材料：实验于2006-03/11在河北省人民医院临床研究中心（实验室标准为BSL-2）完成。选用新西兰大白兔15只，雌雄不限，体质量2.85~2.95 kg，由河北医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（冀）2003-1-003）。椭圆形20 mL医用皮肤软组织扩张器30枚，上海咸宁整形制品有限公司生产。20 g/L医用几丁糖（上海其胜生物制剂有限公司）；100 g/L水合氯醛（河北省人民医院制剂科）；40 g/L多聚甲醛（北京密利化学试剂厂）。动物实验方法符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第一作者，评估者经过正规培训。
方法：
实验分组：15只新西兰大白兔每只背部中段脊柱两侧旁开3 cm处设为扩张区，均将左侧设为几丁糖组，右侧设为对照组。
扩张器植入：实验动物称重，100 g/L水合氯醛???? 5 mL/kg腹腔注射，全身麻醉后取俯卧位，头及四肢固定，背部手术区备皮，碘伏消毒，铺无菌手术单。按术前实验设计，背部中段脊柱两侧旁开3 cm处取平行脊柱长约1.5 cm切口，在深筋膜浅层剥离约6 cm×6 cm大小的腔隙。①几丁糖组腔隙剥离完毕后，检查腔隙内无活动性出血，即将20 g/L医用几丁糖0.5 mL注入腔隙内，4指并拢垫无菌纱布自剥离区皮肤表面轻揉片刻以使几丁糖能均匀涂布于腔隙内表面，然后植入20 mL皮肤软组织扩张器，检查扩张器放置平坦无成角、折叠后经注射壶注入无菌生理盐水10 mL，再次4指并拢垫无菌纱布自剥离区皮肤表面轻揉片刻，以使几丁糖在扩张器表面尽可能分布均匀，注射壶埋置于距扩张器近头侧约2 cm处，将扩张区侧切口边缘内1 cm皮瓣深面与皮下深筋膜间断缝合后将皮肤切口间断缝合。②对照组腔隙剥离完毕后观察无活动性出血，直接植入20 mL皮肤软组织扩张器，检查扩张器放置平坦无成角、折叠后经注射壶注入无菌生理盐水10 mL，将注射壶埋置于距扩张器近头侧约2 cm处，与几丁糖组同法缝合伤口。术毕无菌敷料覆盖创口，绷带固定，腹腔注射无菌生理盐水15 mL催醒。创口隔日换药，术后1周拆线。
注水扩张：术后1周拆线开始注水。安抚实验动物，无麻醉状态下，碘伏消毒注射壶表面皮肤，经皮由注射壶注入无菌生理盐水，注水同时观察皮瓣颜色变化及表面张力情况，以扩张皮瓣指压反应四五秒为限控制注水量，避免因扩张过快引起并发症。同一只新西兰大白兔实验侧与对照侧每次注水量保持一致，视扩张器表面皮肤张力情况间隔3~5 d注水1次，注水至扩张器额定容量的200%后停止注水，约4周左右完成扩张注水过程。
扩张后皮瓣回缩率计算：于停止注水两周后取材，100 g/L水合氯醛5 mL/kg腹腔注射，全身麻醉状态下，术区备皮，碘伏消毒；选取扩张区中央部分，直尺测量后用龙胆紫画出4 cm×4 cm大小取材范围，切取带纤维包膜的全层皮瓣组织放置于滴有液体石蜡的玻璃板上，在其自然回缩的第5分钟照相，应用计算机图像分析系统计算回缩率。
纤维包膜组织平均灰度测量：在切取带纤维包膜皮瓣组织的近中线侧中央部分剥离剪取纤维包膜组织，并将纤维包膜组织块平铺于无菌纱布上，快速将其四角缝合固定后浸入40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋，常规5 μm切片、展片进行Masson染色；随机选取两组光镜100倍Masson染色切片各15个视野，应用捷达病理图像彩色分析系统测量平均灰度（与胶原纤维含量呈负相关），对两组间平均灰度进行比较。
主要观察指标：白兔扩张后皮瓣回缩率及纤维包膜组织平均灰度。
统计学分析：由第一作者应用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，计量资料以x(_)±s表示，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析实验设置几丁糖组和对照组各15例，全部取材成功，数据无脱失。
2.2? 两组兔扩张后皮瓣收缩率及纤维包膜组织平均灰度值比较在Masson染色切片中，应用几丁糖干预后纤维包膜厚度的4/6~5/6呈灰色，其中可见散在的成纤维细胞，核呈灰黑色，卵圆形，排列疏松（见图1）；而对照组纤维包膜全层绿色，成纤维细胞多呈长梭形，松散分布（见图2）。因Masson染色中胶原纤维被染成绿色，绿色的面积也就大致代表了胶原纤维的多少，应用几丁糖干预后切片中绿色区域的面积减小，这说明应用几丁糖干预后成纤维细胞成熟迟缓，分泌胶原减少。两组兔扩张后皮瓣收缩率及纤维包膜组织平均灰度值比较见表1。

3 讨论

皮肤软组织扩张术在国内经历了20余年的发展，现在已经成为整形外科常规的治疗手段之一，对于某些疾病如秃发、鼻缺损、面颈部瘢痕的治疗，皮肤软组织扩张术已成为首选的治疗方法，对于一些先天性畸形、体表肿瘤用皮肤软组织扩张术治疗后的外形和功能修复效果明显优于其他方法。
虽然皮肤软组织扩张术已被广泛应用于整形外科临床，并向骨科、创伤外科、神经外科、颌面外科、耳鼻喉科、眼科等多学科渗透，但在基础理论和应用理论方面仍有许多问题有待进一步深入研究。临床医生们期望此项技术并发症更少、疗程更短，并且尽可能提高有限的供区皮肤软组织的利用率，以利用有限的供区皮肤软组织来修复更大的缺损，所以提高供区皮肤软组织利用率的问题越来越受到关注[1]。提高供区皮肤软组织的利用率可以通过提高扩张效率的方法来实现，方法主要有超量扩张、重复扩张和重叠扩张。扩张效率的提高使同等面积的供区皮肤软组织经扩张后面积增大了，但是扩张后皮瓣的回缩仍是限制其临床效果的难题，如果能使扩张后皮瓣转移至缺损区利用时其回缩率也减小，则会进一步提高供区皮肤软组织的利用率，而在导致扩张后皮瓣回缩的原因中，纤维包膜挛缩又是其中一个很重要的因素，因此近年来关于纤维包膜的相关研究日益受到重视[2-4]。
既往的实验及研究结果均显示，当皮肤软组织扩张器植入体内2周左右后，即在囊壁周围形成一层纤维囊壁，到6~8周时最厚，一般为0.3~1.2 mm。近年来很多学者致力于应用药物干预扩张器植入后纤维包膜形成过程的研究，期望寻求一种能减小纤维包膜厚度，从而减轻纤维包膜挛缩，以最大限度地减少因纤维包膜挛缩而导致的扩张后皮瓣回缩率增加。陈小平等[5]的研究表明应用氧自由基清除剂可使增厚的纤维囊壁变薄，从而减轻纤维包膜的弹性回缩作用；陈志鹏等[6]应用维生素E及粉防己碱，韩胜等[7]应用他莫昔芬干预纤维包膜形成，使纤维包膜变薄，其中胶原纤维含量减少，从而达到减轻扩张后皮瓣回缩的目的；曹东升等[8]报道应用确炎舒松使纤维包膜变薄，以减轻其弹性回缩的作用；亦有应用积雪草甙干预纤维包膜形成的研究[9]。上述研究结果表明，选择性的应用皮质类固醇激素、雌激素拮抗剂以及氧自由基清除剂等药物可以起到使纤维包膜变薄，胶原纤维含量降低，从而起到减轻纤维包膜挛缩进而减少扩张后皮瓣弹性回缩的作用。但是在上述研究中所采用的药物多具有明显的副作用，并不适于在临床推广应用，因此进一步探索疗效确切、无毒副作用、便于临床推广应用的药物和适当的给药途径，是目前这一领域亟待解决的问题。
几丁糖又名甲壳胺、壳聚糖、脱乙酰壳聚糖，是自然界中惟一带正电荷的氨基葡聚糖，由海洋甲壳类生物、昆虫和其他无脊椎动物甲壳素[β-（1-4）聚-2-乙酰乙基-D-葡糖]脱乙酰化制得[10-11]。几丁糖具有以下生物学性能[12-14]：①安全性：长期动物实验证明几丁糖长期毒性及急性毒性均甚小，口服及腹腔应用安全可靠。②降解性：从结构上看，几丁糖与细菌细胞壁上的肽聚糖有相似之处，都是通过β-1，4糖苷键连接的多糖聚合物，可被体内存在的溶菌酶、水解酶等降解成葡萄糖胺和低分子壳寡糖，而且葡萄糖胺可以直接被人体利用，壳寡糖对人体具有免疫调节活性。③生物相容性：几丁糖具有与粘多糖相似的结构特点，而粘多糖是细胞膜成分之一，且几丁糖中含有较多的氨基，具有聚阳离子的性质，因此它可以和细胞表面带负电荷的基团相互作用，与细胞膜发生特异性吸附，所以几丁糖又具有优异的生物相容性。
肖海军等[15]报道了几丁糖预防术后粘连的研究结果，证实几丁糖在临床应用中具有无毒性、无刺激性、无免疫抗原性、无热原性、不溶血，无致突变及致死性反应[16-19]，是一种组织相容性良好的可吸收降解的体内植入生物材料，具有止血、抑菌、促进上皮细胞生长、抑制成纤维细胞生长和防粘连等作用[20-22]。目前，几丁糖已经被广泛应用于普通外科、妇产科、骨科、眼科等临床科室。
在整形外科领域，闫迎军等[23]应用几丁糖预防硅凝胶乳房假体包膜挛缩的实验研究，证明几丁糖可以降低硅凝胶乳房假体植入后纤维包膜中胶原纤维的含量，从而起到预防包膜挛缩的作用。皮肤软组织扩张术后在扩张器周围形成纤维包膜的机制比乳房假体植入术后的纤维包膜形成复杂的多，除异物刺激作用外，长期而持续增强的扩张张力是其重要而又无法避免的关键因素。
本实验选择应用几丁糖干预扩张器植入后纤维包膜形成的过程，对药物干预前后纤维包膜中的胶原纤维含量及扩张后皮瓣的收缩率进行对比观察，证明几丁糖可以使扩张后皮瓣纤维包膜中的胶原纤维含量降低，从而降低扩张后皮瓣的收缩率。因此几丁糖有望作为减轻扩张后皮瓣弹性回所率的有效药物应用于临床。

4 参考文献