肝素化纳米材料P(LLA-CL)的制备及其表征和抗凝血性特征****★◆

石海涛1,2，莫秀梅1,2，何创龙1，过凯2，刘生和3

应用要点：本课题通过具有工艺简单、操作简便、易于控制、对环境无污染等优点的等离子体技术成功接枝肝素，使得P(LLA-CL)材料在保持其机械性能的前提下，具有优良抗凝血性能。同时，为使研究从实验阶段真正意义上应用于临床奠定了基础。

相关链接：等离子体表面改性技术的特点是:①它对材料表面的作用深度仅数百埃,不会影响基体材料的性质。② 能够处理各种形状的表面。③有较强的杀菌作用。因此，低温等离子体技术是生物医用材料较为理想的表面处理技术，而对于高分子复合材料膜表面肝素化是一个全新的研究方向。

同行评价：本文是一篇关于表面肝素化可降解生物材料制备与性能的实验研究，文章选题符合当今生物材料的研究发展方向，实验数据量较大，测试手段较多，结果分析较为合理，内容有较好的实用价值。论文中作者所做的成果具有一定创新性。

东华大学，1生物科学与技术研究所，2纤维材料改性国家重点实验室，上海市 201620；3上海交通大学附属第六人民医院，上海市 200233

石海涛★，男，1983年生，东华大学在读硕士，主要从事静电纺生物材料和组织工程研究。
shihaitao@ mail.
dhu.edu.cn

通讯作者：莫秀梅1，2，教授，东华大学，1生物科学与技术研究所，2纤维材料改性国家重点实验室，上海市 201620
xmm@dhu.edu.cn

国家自然科学基金资助项目（30570503）*；纺织生物医用材料科学与技术创新引智基地“高等学校学科创新引智计划”建设项目（b07024）*；2005上海市浦江人才计划:项目（05PJ14013）*；上海市2005年重大基础研究课题（05DJ14006）*

摘要
目的：采用等离子体技术引发表面接枝肝素方法，使纳米材料P（LLA-CL）表面肝素化，以提高材料的抗凝血性。
方法：制备静电纺高聚物P(LLA-CL)纳米纤维，采用等离子体技术引发纳米材料P(LLA-CL)表面肝素化，对其表面进行改性，并测试其力学性能，同时对肝素化材料进行了接触角测试观察其表面亲水性，傅里叶全反射红外光谱分析进行表面分析，扫描电镜观察纤维形态，EDS能谱对表面元素组成进行表征，血液相容性实验评价肝素化P（LLA-CL）材料表面的血液相容性。
结果：采用等离子体技术能够成功将肝素接枝到P(LLA-CL)表面。等离子体处理后P(LLA-CL)材料表面接触角显著减小，亲水性增强；等离子引发肝素化后，材料仍能保持良好的机械力学性能；红外光谱、扫描电镜和EDS结果表明等离子体引发肝素成功接枝到P(LLA-CL)表面；血液相容性实验显示肝素化材料复钙时间全血凝血时间明显延长。
结论：材料在等离子体肝素化改性处理后抗凝血性能改善，血液相容性提高。
关键词：P(LLA-CL)；等离子体处理；肝素化；抗凝血性

石海涛，莫秀梅，何创龙，过凯，刘生和.肝素化纳米材料P(LLA-CL)的制备及其表征和抗凝血性特征[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):10-14 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-10(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00010-05

Preparation, characterization and anticoagulant property of P(LLA-CL) nanofibrous scaffolds by heparinization

AIM:Heparin is immobilized on P(LLA-CL) scaffolds with plasma technique, in order to elevate the anticoagulant property of the material.
METHODS: Electrospun polymer P(LLA-CL) nanofiber was prepared, and heparin was immobilized on surface of P(LLA-CL) scaffolds with plasma technique to modify the surface. Fourier transform attenuated total reflection infrared spectroscopy was used for surface analysis, scanning electron microscope for fibrous morphology, and EDS for surface element. Blood compatibility of P(LLA-CL) scaffolds with heparinization was also evaluated.
RESULTS: Heparin could be successively immobilized on surface of P(LLA-CL) scaffolds with plasma technique. Qualitative analysis by infrared spectrum, scanning electron microscope, and EDS proved that the heparin had been immobilized on the surface of P(LLA-CL) scaffolds. Blood compatibility test revealed that the recalcification time and whole coagulation time of the modified material were obviously prolonged.
CONCLUSION: The modification of P(LLA-CL) scaffolds by heparinization can improve the anticoagulant property and increase blood compatibility.

Shi HT, Mo XM, He CL, Guo K, Liu SH.Preparation, characterization and anticoagulant property of P(LLA-CL) nanofibrous scaffolds by heparinization.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):10-14(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-10(ps).pdf]

关于材料的血液相容性，目前最关注的是血液在与高分子材料接触后，因材料因素引发的血液凝固反应。使材料获得抗凝血性的方法很多，如肝素固定化、提高材料的含水率以及形成微相不均匀结构等，其中肝素固定化是研究最为活跃、应用最为广泛的一个领域。迄今已有的聚合物肝素化方法主要是季铵盐离子化法、共价偶联法和终点附着法等多种方法[1-2]。在众多的方法中，肝素与聚合物结合的牢固性、生物活性或抗凝血的可持续性等一直是尚待改进的问题。本实验采用等离子体引发表面接枝肝素方法，使P（LLA-CL）表面肝素化，对其表面进行改性。等离子体法是通过放电、高频振荡、高压电源等，使聚合物材料表面产生等离子体，产生活性自由基或官能团，形成活性中心，再键合肝素[3]。研究等离子体引发接枝对表面亲水性的影响，利用全反射红外光谱表面分析技术，对表面元素组成进行表征。通过体外血液相容性实验，研究肝素化P（LLA-CL）材料表面的血液相容性。

1.1 材料
1.1.1 实验材料 P(LLA-CL)无规共聚物（50∶50）；肝素钠（Mr 6 000～20 000）由上海润捷化学试剂有限公司提供；1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC) 和N-羟基丁二酰亚胺（NHS），由Merck-Schuchardt公司提供；常用试剂：醋酸、食盐、氯化钙、乙醇、丙酮、柠檬酸三钠和戊二醛（均为分析纯）；新西兰大白兔由上海交通大学附属第六人民医院骨科提供。
1.1.2 实验仪器高压电源静电发生器(BGG6-358，北京机电院高技术股份有限公司)，DZF-6020真空干燥箱（上海恒科技有限公司），等离子体发生器（由东华大学理学院研制），JC2000A静滴接触角和表面张力测试仪（上海中晨数字技术设备有限公司），扫描电镜(JSM-5600LV, JEOL Ltd., 日本) ，NEXUS-670全反射红外光谱仪(Nicolet 公司，美国)，H5K-S万能拉伸仪(Hounsfield, 英国),Falcon EDS能谱分析仪器(美国EDAX)，D-78532Tuttlingen离心机（德国）。
1.2 方法
1.2.1 静电纺高聚物P(LLA-CL)纳米纤维制备按质量比为0.06将P(LLA-CL)聚合物溶解在丙酮中，磁力搅拌机搅拌3.0～4.0 h（室温），直至溶液成完全透明油状。然后用2 mL的塑料注射器吸取2 mL溶液，纺丝条件为电压15 kV，流速1.5 mL/h，喷头离接收板距离20 cm，在室温条件下进行静电纺丝[4]。制备的电纺纤维膜置于真空干燥器中保存、备用。
1.2.2 等离子体处理及肝素化将制备的纤维膜（0.10±0.05）mm放在真空等离子体发生器中（气压20 Pa），置于电极中央。通入氧气，待气压稳定后，启动RF电源，进行等离子体处理[5]，时间为50 s。等离子处理完后，采用液相法，将处理后P(LLA-CL)膜浸泡在配制好的2 g/L EDC 与 0.4 g/L NHS混合溶液中4 h。然后再将缩合后的膜浸泡在已经配制好的肝素溶液中20 h。超声波水浴洗涤3次，5 min/次，然后真空干燥、备用。配制肝素溶液时，将肝素钠溶于质量分数为0.03的的醋酸溶液中，配制成4 g/L的肝素钠醋酸溶液500 mL [6]。P(LLA-CL)材料表面接枝肝素的全过程如图1所示。

1.2.3 测试与表征样品经干燥、真空喷金后采用扫描电镜观察表面形貌；采用傅里叶全反射红外光谱分析改性前后材料所含特殊基团的变化；接触角的测定，在接触角测定仪上用液滴(sessile drop)法测量蒸馏水液体的接触角，液滴体积为5 μL；采用H5K-S万能拉伸仪测试材料的力学性能，拉伸速度为10 mm/min，试样尺寸为：长5 cm，宽1 cm，厚0.02～0.09 cm；采用Falcon EDS能谱分析仪器(美国EDAX)对材料接枝肝素前后进行表面元素比较分析。
1.2.4 肝素化P(LLA-CL)材料的血液相容性 ①复钙时间实验：将0.2 cm×0.2 cm材料分为两组(每组3个试样)，一组纯P(LLA-CL)材料，另一组为肝素化后P(LLA-CL)材料，分别放入质量分数0.009的NaCl溶液中浸泡24 h，移至试管内，加入0.2 mL血浆，0.025 mol/L CaCl2溶液0.2 mL，于37 ℃水浴恒温，记录当试管内出现第一条丝纤状物的时间[7]。②Lee-White实验（全血凝血实验）：取10 mm×10 mm的洁净玻璃试管分为两组，一组为空白，一组为样品，每组3个平行样。试样经37 ℃恒温后，顺序沿管壁加入1 mL兔血于试管中，开始计时。3 min后每隔半分钟倾斜试管，至试管中血液不流动计为凝血时间[8]。

2.1 SEM观察纤维形态及傅里叶全反射红外光谱图2 a，b，c分别为纯P(LLA-CL)、等离子体处理和等离子体引发接枝肝素后P(LLA-CL)的纤维形态。图3给出了肝素钠、P(LLA-CL)膜和肝素化P(LLA-CL)纤维膜的红外谱图。

通过用Image J软件（National Institutes of Health， USA）进行分析表明：P(LLA-CL)纳米纤维平均直径为(378.8±0.4)nm，而经等离子体处理和等离子体引发接枝肝素后P(LLA-CL)纤维的直径为(503.9±0.5)nm和(728.0±0.5)nm。等离子处理后纤维的直径增大，孔隙率减小的变化与等离子处理时温度的升高有关。
从图3B，C中可以看出，在3 385 cm-1处附近均形成强而宽的红外特征吸收峰，即是肝素分子中的含有-COOH、-OH和-NH2等多种基团作用产生的特征性吸收峰，表明肝素接枝到材料表面，肝素分子化学式如图1所示；而在图3A所示的纯P(LLA-CL)红外图谱中在3 385 cm-1没有出现类似特征性吸收峰。同时，在1 620 cm-1附近纯肝素钠图谱（1 609 cm-1）和接枝肝素后P(LLA-CL)谱图(1 636 cm-1)中均出现了酰氨基的特征性吸收峰，表明肝素通过酰氨键固定在材料表面上。红外光谱的分析进一步分析证实了P(LLA-CL)材料表面酰氨键共价结合肝素全过程 [9]。
2.2 表面元素分析 EDS表面元素分析表明等离子体处理前P（LLA-CL）膜表面只有C元素和少量的O元素(EDS 能谱无法检测表面H元素)。等离子体引发接枝肝素后的P（LLA-CL）膜表面除含有C和O元素外，还含有与肝素钠粉末中的相同Na和S元素。具体能谱图见图4所示。
肝素化处理前后，P(LLA-CL)材料表面元素组成见表1所示。
由表1可见，静电纺P(LLA-CL)膜表面只有C（46.36%）和O（53.64%）原子组成。而在肝素化后P(LLA-CL)材料表面增加了Na（6.48%）、Cl（6.88%）和S（0.80%）元素成分，显然均来自表面接枝后的肝素。Na和Cl元素来自于肝素钠，与纯肝素纳EDS元素能谱图相比，可以进一步判断肝素钠被接枝到材料表面上。但是，图4c中为同一肝素化P(LLA-CL)膜上选择两个不同位置进行能谱分析，发现Na和Cl元素在图1和图3中能谱强度各不相同，说明膜接枝上的肝素是不均匀分布的，这可能与等离子体处理的均匀性有关。

2.3 表面亲水性图5清晰的看到材料表面接触角的变化，而表面亲水性的增强有利于降低表面成分与血液的作用。

分别对3种膜进行测试，每组平行测试3次，所得数据进行平均取值见表2。材料经过等离子处理后，水接触角从105°降低到了0°，亲水性提高。

2.4 力学性能分析图6是等离子体处理前后两种纤维膜的典型的应力-应变曲线。
从图6可知，等离子体处理前后即纯P(LLA-CL)和肝素化的P(LLA-CL)的力学性能都较好，没有太大的变化。具体力学性能数据列于表3。静电纺纯P(LLA-CL)应变较等离子体引发接枝肝素化P(LLA-CL)的应变稍大，而静电纺P(LLA-CL)材料杨氏模量较肝素化P(LLA-CL)材料杨氏模量小，这可能是等离子体处理时，刻蚀作用使分子链松散，柔性增加使弹性增加，因而使材料呈现强度小幅下降和弹性略有上升的状况。

2.5 复钙实验结果[10] 复钙时间是在去掉钙的血浆中重新加入钙，使内源性凝血过程重现。复钙时间延长：Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ因子缺乏以及Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ因子严重缺乏、严重纤维蛋白原缺乏，血中抗凝物质增多。
肝素化P(LLA-CL)和纯P(LLA-CL)的复钙时间分别为（116.0±1.0） s，（108.0±1.0） s，肝素化P(LLA-CL)材料的复钙时间比纯P(LLA-CL)延长了8 s。说明肝素改善了材料的抗凝血性能，肝素化P(LLA-CL)能有效延缓内原性凝血途径的激活。
2.6 全血时间实验结果空白组、纯P(LLA-CL)和肝素化P(LLA-CL)材料的全凝血时间分别为（130±5）s，（150±5）s，45 min±5 s，肝素化后材料的全血凝血时间较处理前纯材料凝血时间明显延长，表明材料的抗凝血性能有所改善。

本文通过低温等离子体处理，对静电纺P(LLA-CL)进行表面改性，成功将具有天然抗凝血性的多糖混合物肝素接枝到材料上，赋予材料较好的稳定抗凝血性。
等离子体表面处理，是一种新兴的、容易操作、环保型的表面改性方法，很受科研工作者的关注。等离子体处理很好的改善了材料的亲水性，而亲水性的好坏直接关系到细胞生长和材料与血液的作用程度；扫描电镜图和红外光谱的分析表明等离子体能够引发接枝肝素于P(LLA-CL)上；通过对力学性能的分析，材料在等离子体处理后仍能保持较好的力学强度；体外抗凝血实验显示改性后材料具有较好的血液相容性。总之，本实验表明采用氧气等离子体处理，通过调节功率、处理时间和气流流量，能够成功地将肝素引发接枝到生物材料上。经过等离子体处理及接枝肝素都能提高P(LLA-CL)表面的抗凝血性，接枝肝素的效果更佳。

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