海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢激素分泌细胞异体移植对垂体形态学的影响*★

吴桐，翁静，刘玲，史小林

课题背景：课题为国家自然科学基金资助项目（39670096）。在以往的研究中曾开展大鼠胚胎性腺的异体异位移植，发现移植后的性腺可以在异体存活并分泌激素，但受体大鼠的免疫排斥等因素仍然会对移植的性腺（特别是卵巢）状况有不良的影响。应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊技术包裹细胞进行异体移植，被证明是一种可避免受体产生免疫排异的有效方法。本课题组对海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化的小鼠卵巢性激素分泌细胞的研究中，显示微囊化的细胞具有良好的分泌激素的功能。

应用要点：①海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化的大鼠卵巢性激素分泌细胞能够利用微囊化的材料学特性，在异体存活、产生激素并对腺垂体产生影响。②应用活细胞进行激素替代，可以借助靶细胞与激素之间的相互调控，达到激素替代的个体化治疗目的，从而有效地降低副作用的发生。

偏倚或不足：本实验中未观察到明显的动情周期，如何达到微囊化移植的最佳效果尚待进一步观察。

吴桐★，女，1981年生，江苏省昆山市人，汉族，首都医科大学生殖医学研究中心在读硕士，主要从事卵巢细胞体外培养与移植的实验研究。
Wutong1618@
yahoo.com.cn

通讯作者：翁静，副教授，硕士研究生导师，首都医科大学生殖医学研究中心，北京市 100069
weng.jing@263. sina.com

摘要
目的：已有研究证实海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊对机体无明显毒副作用且生物相容性好，应用这一技术包裹细胞，可明显延长异体内移植物的存活时间。将海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢细胞体外培养后进行异体移植，观察其治疗卵巢功能丧失模型大鼠的可行性及垂体形态学变化。
方法：实验于2006-03/2007-09在首都医科大学生殖医学研究中心完成。①实验动物：30只Wistar雌性大鼠,随机分为正常对照组，卵巢摘除组，微囊移植组，每组10只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。②实验方法：卵巢摘除组：无菌条件下切除双侧卵巢；微囊移植组：海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠生物膜包裹传至P2代的大鼠卵巢细胞，制成微囊体外培养，收集24 h培养液以检测雌二醇分泌状态；将微囊化的卵巢细胞移植入已行双侧卵巢切除术的大鼠腹腔。用阴道涂片观察大鼠动情周期恢复情况。术后40 d麻醉后处死动物，放射免疫法检测血清雌二醇质量浓度，垂体组织常规石蜡包埋，连续切片，分别进行苏木精-伊红染色和雌、孕激素受体免疫组织化学染色。LEICA Q500IW自动图像分析仪对垂体细胞的面积，雌、孕激素受体吸光度值进行定量测定。
结果：①放射免疫法检测培养液显示，微囊化的卵巢激素分泌细胞具有继续合成和分泌雌二醇的功能。②检测血清中雌二醇质量浓度结果显示，卵巢摘除组明显低于正常对照组和微囊移植组，差异具有显著性意义，正常对照组和微囊移植组之间差异无显著性。③动情周期未恢复。④苏木精－伊红染色可见卵巢摘除组大鼠垂体中有大量阉割细胞,平均面积>180 μm2,与卵巢摘除组比较，微囊移植组大鼠垂体中细胞平均面积和阉割细胞数目均显著减少。⑤垂体雌、孕激素受体免疫组织化学吸光度值结果显示，卵巢摘除组明显低于正常对照组和微囊移植组，差异具有显著性意义。
结论：微囊化大鼠卵巢细胞异体移植后，可在受体大鼠体内继续合成和分泌雌二醇，并可以减少垂体内阉割细胞的形态和数目，提高垂体细胞雌激素受体和孕激素受体的表达，提示移植后细胞对垂体有反馈调节作用。
关键词：微囊；卵巢；细胞培养；移植

吴桐，翁静，刘玲，史小林．海藻酸钠－多聚赖氨酸－海藻酸钠微囊化大鼠卵巢激素分泌细胞异体移植对垂体形态学的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):108-112????? [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-108(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2007)01-00108-05

Morphological changes in pituitary following allotransplant of alginate-polylysine-alginate microencapsulated ovarian cells in rats

AIM:It is confirmed that alginate-polylysine-alginate (APA) microcapsule has good biocompatibility and no obvious toxic side effect. APA microencapsulation can prolong the survival time of allotransplants. This study conducted an allotransplantation after APA microencapsulated rat ovarian cells are cultured in vitro, explored the feasibility of APA microencapsulated rat ovarian cells in treatment of ovariectomized rats and studied the morphology changes of the pituitary.
METHODS: The experiment was conducted in the Center of Reproductive Medicine, Capital Medical University from March 2006 to September 2007.①Experimental animals: Thirty female Wistar rats were divided randomly into 3 groups (10 rats each group): control group, ovariectomy group and implantation group. Experimental procedures were in accordance with the ethical standard of animals.②Methods: In ovariectomy group, ovaries on both sides were extirpated at sterile. In implantation group, the P2 generation of rat ovarian cells were microencapsulated by APA, and cultured in vitro. We collected the microencapsulated cells' culture medium at 24 hours to test the secretion of estradiol (E2). And then the microencapsulated ovarian cells were implanted into abdomen of the ovariectomized rats. Estrous cycle of rats was observed by using vaginal smear. Rats under anesthesia were sacrificed at the 40th day postoperation. The quality concentrations of serum E2 were detected by radioimmunoassay. Pituitaries were embedded by paraffin and sectioned continuously. The morphologic figures of pituitary were shown by hematoxylin-eosin stain, the expression of estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) were detected by immunohistochemistry. The area of pituitary cells and the absorbance values of ER, PR were all measured by using LEICA Q500IW automatic image analyzer.
RESULTS: ①The radioimmunoassay outcomes showed that the microencapsulated rat ovarian cells had the ability to synthesize and secrete E2.②E2 concentrations in the control group and the implantation group were significantly higher than that of the ovariectomy group, but there was no remarkable difference between the implantation group and the control group.③The estrus cycle was not resumed.④A number of castration cells could be observed in hematoxylin-eosin stained pituitary sections in the ovariectomy group, with the average area > 180 μm2. In the implantation group, both the number and the area of castration cells were much lower than that in the ovariectomy group. The absorbance values of ER and PR were significantly lower in the ovariectomy group than that of the control group and the implantation group.
CONCLUSION: APA microencapsulated rat ovarian cells can continue to synthesize and secrete E2, reduce the morphology and number of castration cells after allotransplantation, and increase the expressions of ER and PR, which all indicate that implanted cells have feedback regulation effect on pituitary.

Wu T, Weng J, Liu L, Shi XL. Morphological changes in pituitary following allotransplant of alginate-polylysine-alginate microencapsulated ovarian cells in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):108-112(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-108(ps).pdf]

目前雌激素的补充主要用雌激素替代疗法，但是，由于内源性雌激素分泌不足，外源性雌激素呈非生理性释放，可产生一些严重的不良反应，诱发或加重某些疾病，如子宫肌瘤、子宫内膜癌、子宫内膜异位症等[1]。找到一种更为安全的治疗方法成为急待解决的问题。微囊移植技术具有免疫隔离作用，为解决雌激素个体化治疗提供了新思路。
微囊化免疫隔离技术以1986年O'Shea等[2]首次采用的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（Alginate-Polylysine-Alginate，APA）微囊发展最为成熟。用微囊包裹具有特定功能的组织细胞形成免疫隔离人工细胞，由于外来组织细胞可以分泌小分子生物活性物质，补充体内缺乏的生理活性物质，从而达到治疗疾病的目的。目前这方面研究主要是在微囊化胰岛细胞、甲状旁腺细胞、多巴胺分泌细胞、肝细胞、甲状腺细胞以及基因工程细胞治疗相应疾病上，取得了不同程度的进展。许晴等[3]将卵巢细胞微囊化，观察细胞体外增生及测定培养液中雌激素和孕酮的含量，发现微囊化后不影响卵巢细胞分泌物的释放。本实验采用APA微囊化免疫隔离技术，包裹卵巢细胞进行异体移植，观察其用于治疗实验性卵巢功能丧失的可行性，并观察对垂体的影响。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：首都医科大学生殖医学研究中心。
材料：实验于2006-03/2007-09在首都医科大学生殖医学研究中心完成。实验动物：清洁级成年雌性Wistar 大鼠30只，体质量220~250 g，首都医科大学实验动物中心提供（许可证号SCXK(京)2005-0006）。饲养环境温度20~26 ℃、湿度40%~70%。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
30只大鼠随机分为正常对照组，卵巢摘除组，微囊移植组，每组10只。卵巢摘除组：无菌条件下切除双侧卵巢；微囊移植组：APA生物膜包裹传至P2代的大鼠卵巢细胞，制成微囊体外培养，收集24 h培养液以检测雌二醇分泌状态；将微囊化的卵巢细胞移植入已行双侧卵巢切除术后大鼠的腹腔。
主要试剂：胰蛋白酶（Sigma公司），Ⅰ型胶原酶（Sigma公司），海藻酸钠（Sigma公司），胎牛血清、DMEM-F12培养液、Hanks、多聚赖氨酸（Hyclone公司）。兔抗大鼠雌激素受体α抗体（Santa Cruz公司）、兔抗孕激素受体抗体（武汉博士德公司）。
设计、实施、评估者：为本文所有作者。
方法：
卵巢细胞培养：无菌条件下取出大鼠双侧卵巢，去除卵巢周围的脂肪后剪成1 mm3的小块，经2.5 g/L胰蛋白酶和2 g/LⅠ型胶原酶（1∶1）消化， 37 ℃恒温水浴，30 min。1 000 r/min，离心5 min，去上清，加培养液吹打，制成单细胞悬液，过60目细胞筛，离心，将细胞重悬，调整细胞浓度为(3~5)×108 L-1，加入DMEM-F12培养液（含体积分数为0.1的胎牛血清），于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。待培养的卵巢细胞长满培养瓶底80%~90%时进行传代。
微囊化卵巢细胞的制备：将卵巢细胞悬浮于15 g/L海藻酸钠溶液中，细胞密度为(1.0~2.0)×109 L-1，通过自制微囊发生装置打入到11 g/L氯化钙溶液中，轻微搅拌形成凝胶珠，依次用0.5 g/L多聚赖氨酸、1.5 g/L海藻酸钠包裹凝胶珠，然后用0.05 mol/L柠檬酸钠液化囊心。最后形成包裹大鼠卵巢细胞的APA微囊[3]。将制备好的微囊收集于培养板中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。24 h后收集微囊培养液，放射免疫分析法测定雌二醇水平，以检测细胞分泌状态。
微囊化大鼠卵巢细胞的动物移植：微囊化大鼠卵巢细胞24 h培养后移植入行卵巢摘除术后的大鼠腹腔内，每只鼠植入微囊化卵巢细胞2 mL。
阴道涂片检查：于术后5 d起，每天清晨8时对各组大鼠阴道脱落细胞进行检查。以脱落细胞类型进行分析。
微囊化卵巢细胞分泌功能检测：术后40 d麻醉后处死大鼠，收集各组大鼠血清，放射免疫分析法测定血清中雌二醇和孕酮的质量浓度。
苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色：术后40 d麻醉后处死大鼠，垂体组织常规石蜡包埋，连续切片，厚度5 μm。每隔10片取3张切片，分别进行苏木精-伊红染色和雌、孕激素受体免疫组织化学染色。一抗分别是兔抗大鼠雌激素受体α抗体（1∶500），兔抗大鼠孕激素抗体（1∶100），二氨基联苯胺显色。脱水，透明，中性树胶封固；显微镜下观察。
图像分析：实验结果用LEICA Q500IW自动图像分析仪观察垂体细胞形态学变化，包括细胞截面积，雌、孕激素受体染色阳性部位进行吸光度值的测量，苏木精－伊红切片在高倍视野下，每张切片取3个视野，每个视野中细胞面积从大到小用LEICA Q500IW自动图像分析仪各标记20个，计算其平均面积和大小分布。雌、孕激素受体染色阳性部位每张切片取5个视野计算平均吸光度值，吸光度越大表示染色越深，即检测物的阳性度越高。
主要观察指标：①微囊培养液中雌二醇的质量浓度。②各组大鼠血清雌二醇和孕酮的质量浓度。③阴道涂片动情周期检查。④垂体形态学观测。⑤雌、孕激素受体免疫组织化学染色平均吸光度值。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5进行数据处理，计量数据以_x±s表示，进行正态性检验，方差齐性检验，两独立样本t检验，单因素方差分析（ANOVA）和q检验。检验水准α取0.05，P > 0.05表示差异无显著性意义，P < 0.05表示差异有显著性意义， P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

2.1 实验动物数量分析成年雌性Wistar 大鼠30只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 体外培养的大鼠卵巢细胞形态学观察倒置显微镜下观察，生长至近汇合期时的卵巢细胞呈鹅卵石样排列，贴壁良好，细胞边界不清，折光性好，细胞质内可见分泌颗粒（图1）。
2.3 APA微囊化卵巢细胞的生长状态将体外培养的微囊化卵巢细胞置于倒置显微镜下观察，可见微囊内的卵巢细胞排列紧密、活性较好（图2）。
2.4 24 h APA微囊培养液中雌二醇的质量浓度结果显示在体外培养中，微囊内的卵巢细胞可继续合成和分泌雌二醇，分泌状态良好，分泌物可自由通过微囊。见表1。

2.5 APA微囊化卵巢细胞移植后受体大鼠血清中雌二醇、孕酮水平在微囊移植40 d后，收集血清通过放射免疫分析法测定大鼠血清中雌二醇、孕酮水平，可见到微囊移植组雌二醇明显高于卵巢摘除组，并且差异有统计学意义（P < 0.01）。而与正常对照组接近。见表2。

2.6 大鼠动情周期检查正常对照组10只大鼠阴道脱落细胞涂片呈正常动情周期变化，卵巢摘除组大鼠阴道脱落细胞涂片检查呈持续无角化状态，且整体细胞数量极少，无动情周期出现；微囊种植组大鼠阴道脱落细胞涂片检查发现，角化与未角化上皮细胞在数量上远远多于白细胞，但未呈现明显的动情周期细胞类型。
2.7 大鼠垂体形态变化的光学显微镜观察 ①正常对照组：各种细胞成分比例及分布正常，腺垂体及神经垂体均正常。②卵巢摘除组：腺垂体中细胞排列疏松，并出现较多的体积明显增大，浆内出现大空泡，有的胞核被挤在细胞一侧成月牙状核。这种去卵巢后出现的肥大的细胞通常称之为阉割细胞，阉割细胞多为嗜碱性细胞的改变。神经垂体无明显改变。③微囊移植组：与卵巢摘除组比较，阉割细胞数量显著减少，且细胞的体积也明显减小，偶见大空泡细胞。神经垂体无明显改变（图3）。

2.8 雌、孕激素受体免疫组织化学染色平均吸光度值结果雌激素受体α和孕激素受体阳性细胞均为核着色，阳性产物呈棕黄色，垂体前叶分布较多。卵巢摘除大鼠垂体前叶雌激素受体α、孕激素受体阳性细胞染色强度明显减少，微囊移植组雌激素受体α、孕激素受体阳性细胞染色强度有所增加，但仍未达到正常水平（图4，5）。利用图像分析仪对各实验组染色阳性部位进行吸光度值的测量结果提示：卵巢摘除组吸光度值明显低于正常对照组，微囊移植组吸光度值明显高于卵巢摘除组，但较正常对照组低（表3）。
2.9 垂体形态学变化的计算机图像分析对比卵巢摘除组和微囊移植组，垂体增大细胞的截面积和数量。结果显示大鼠卵巢摘除40 d后，细胞的平均面积增大至(189.22±22.91)μm2，其中平均面积>180 μm2的大细胞占54.21%，微囊移植使增大的阉割细胞面积显著减小(121.95±14.64)μm2（t =13.551，P < 0.01），其中平均面积>180 μm2的大细胞仅占4.52%（表4）。

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下丘脑，垂体和卵巢三级结构构成了一个完整的神经内分泌生殖调节体系。下丘脑-垂体轴调节卵巢激素的分泌，卵巢激素对垂体激素也具有反馈调节作用。早在1937年，Severringhans就已观察到去势后大鼠垂体促性腺激素含量明显增加，同时垂体有些细胞内液泡也增多或增大，细胞的大小与形态随着液泡的大小和形态变化而变化。这种去卵巢后增大的细胞通常被称为阉割细胞，周寿康等[4]研究发现去势后激素补充可以使肥大的阉割细胞恢复到正常细胞大小。
雌激素主要通过与雌激素受体结合发挥雌激素作用[5]。通常配体能上调或下调其受体的表达，Shupnik等[6]报道卵巢切除大鼠垂体雌激素受体αmRNA 表达下调，而雌激素替代能反转该变化。
本实验运用APA微囊免疫隔离技术，将大鼠卵巢雌激素分泌细胞微囊化移植入去势大鼠腹腔，发现血清中雌二醇、孕酮水平明显高于卵巢摘除组，且与正常对照组相似，说明微囊化后的大鼠卵巢雌激素分泌细胞可在受体腹腔内继续释放雌二醇、孕酮，具备良好的生物活性。但阴道脱落细胞涂片检查的结果显示，受体大鼠未出现规律的动情周期。而本课题组曾进行的大鼠胚胎性腺异体异位移植研究结果显示[7]，受体大鼠有动情周期的建立。本实验中受体大鼠未出现动性周期，分析原因可能是由于移植细胞成分主要为具有内分泌功能的颗粒细胞和卵泡膜细胞，结缔组织细胞及未分化的卵巢间充质细胞等，而无卵细胞的影响。在进一步的研究中，还需要更多的尝试。
微囊化卵巢雌激素分泌细胞移植的理想状态是移植后的卵巢细胞可以与下丘脑和垂体建立具有生物性调节作用的轴系统，本实验通过观察垂体细胞形态学的变化和激素受体表达的变化，说明微囊化卵巢雌激素分泌细胞对垂体具有反馈作用。微囊移植技术不但达到了免疫隔离的目的，而且显著改善了去卵巢大鼠模型的内分泌环境，对于治疗卵巢功能丧失大鼠具有一定的可行性。

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许晴，梁元晶，路欣，等.简便微囊制备法[J]. 首都医科大学学报，2006，27(4): 494-497
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