纳米羟基磷灰石颗粒对巨噬细胞DNA的损伤***☆
孙 皎，丁婷婷
课题背景：通过揭示纳米尺度效应对其生物学效应影响的机制、建立纳米颗粒安全性评价体系，将进一步推广纳米颗粒的应用领域、促进纳米材料产业化进程、保证纳米颗粒应用的安全性，消除对人体的健康危害。
相关链接： Donaldson和Tran 等人经过实验归纳指出纳米颗粒致炎作用主要通过4个基本途径：①颗粒表面特性造成氧化应激，导致细胞内钙的增高和基因的活化。②纳米颗粒中过渡金属的释放造成氧化应激，引起细胞内钙的增加和基因的活化。③纳米颗粒中过渡金属的释放使细胞表面受体如表皮生长因子受体等的激活，引起激发的基因的活化。④纳米颗粒在细胞内线粒体的分布可以产生氧化应激。此外由于体外实验的纳米颗粒化学成分的不同，细胞系的不同，作用时间以及剂量的不同都可以造成实验结果的差异。
偏倚或不足： DNA损伤、细胞凋亡或坏死是个复杂的过程，多种关键蛋白参与其中，相互调控，相互诱导。因此，在今后的研究中，本课题组将继续分析细胞损伤过程中功能基因的变化，从分子水平上揭示纳米颗粒与生物体相互作用的规律。另外，纳米尺度效应与纳米颗粒的生物学效应究竟存在怎样的密切关系呢？这是纳米技术领域内始终关注的焦点之一，也正是本课题试图继续探索的问题之一。
上海交通大学医学院附属第九人民医院/上海生物材料研究测试中心，上海市 200023
孙 皎☆，女，1959年生，上海市人，汉族，2004年上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）毕业，博士，教授，博士生导师，主要从事生物（口腔）材料的性能研究与评价。
Jiaosun59@ yahoo.
com
国家自然科学基金项目 (30470479)*, 上海市重点（特色）学科项目 (T0202)*, 上海市科委项目（0752nm026）*
摘要
目的：纳米颗粒由于其特殊的尺寸效应，会对细胞内处于纳米尺寸级的RNA、DNA和蛋白质等生物大分子直接产生不良影响，使生物体受到损害。因此，从分子水平上探讨纳米羟基磷灰石颗粒对细胞DNA损伤的相关基因或蛋白的影响具有重要的科学意义。
方法：实验于2005-12/2006-12在上海生物材料研究测试中心完成。①实验材料：纳米羟基磷灰石颗粒由中科院上海硅酸盐所提供，粒径大小为30～80 nm。300 W/40 kHz的超声条件下，用含体积分数为0.1小牛血清的RPMI-1640振荡纳米颗粒，制备成终浓度为1 g/L的悬浮液，4 ℃保存1周。②实验方法：选用RT-PCR的技术，通过原代培养大鼠腹腔巨噬细胞，在分子水平上检测纳米羟基磷灰石颗粒对DNA损伤通路中P53、P21、gadd45以及HSP70这些关键蛋白转录水平的影响。
结果：通过mRNA水平的检测，发现P53、P21及HSP70的表达均随着纳米羟基磷灰石颗粒浓度的增加而升高，并在100 mg/L条件下P53、P21及HSP70有显著性表达（P < 0.05），而当纳米羟基磷灰石颗粒达到200 mg/L，只有P21的表达反而有所降低，同时各浓度的纳米羟基磷灰石颗粒对gadd45表达无明显影响（P > 0.05）。
结论：实验证实了100 mg/L 纳米羟基磷灰石颗粒可以引起DNA的明显损伤。并且当纳米羟基磷灰石颗粒浓度达到200 mg/L时，受损的DNA已不易被修复。同时，P53和HSP70可成为评价纳米羟基磷灰石颗粒安全性较为灵敏的指标。
关键词：纳米颗粒；羟基磷灰石；DNA损伤；反转录-聚合酶链反应
孙皎, 丁婷婷.纳米羟基磷灰石颗粒对巨噬细胞DNA的损伤[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，12(1):15-18
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-15(ps).pdf]
中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00015-04
收稿日期：2007-09-27
修回日期：2007-11-08
(07-50-9-5308/M·Q)
Hydroxyapatite nanoparticles induce DNA damage in macrophages
Abstract
AIM:Nanoparticles with its special size effects have bad impacts on RNA, DNA and protein. This article investigates the influence of hydroxyapatite nanoparticles on DNA damage in a molecular level.
METHODS: Experiments were performed at the Shanghai Biomaterials Research & Testing Center from December 2005 to December 2006. ①Hydroxyapatite nanoparticles were offered by Shanghai Institute of Ceramic Chinese Academy of Sciences. Diameter of the particles was 30-80 nm. RPMI-1640 nanoparticles containing 0.1 bovine blood serum was used to prepare 1 g/L suspension at 4 ℃ for 1 week under 300 W/40 kHz ultrasound. ②Influence of hydroxyapatite nanoparticles on P53, P21, gadd45 and HSP70 of rat peritoneal macrophages in the DNA damage pathway was determined by RT-PCR.
RESULTS: The results showed that P53, P21 and HSP70 would express increased with the concentrations of hydroxyapatite nanoparticles. The expression of P53, P21 and HSP70 had obvious difference at 100 mg/L of hydroxyapatite nanoparticles (P < 0.05), but P21 expressed reduced when concentration of hydroxyapatite nanoparticles was 200 mg/L. Hydroxyapatite nanoparticles had no effects on gadd45 (P > 0.05).
CONCLUSION: 100 mg/L hydroxyapatite nanoparticles induces the obvious DNA damage. DNA damage is irreversible when the concentration of these nanoparticles is more than 200 mg/L. Both P53 and HSP70 are sensitive indexes to evaluate hydroxyapatite nanoparticles.
Sun J, Ding TT.Hydroxyapatite nanoparticles induce DNA damage in macrophages.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):15-18(China)????? [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-1/1k-15(ps).pdf]
0 引言
自从2003年7月对纳米技术研究所面临的公众安全信任危机问题展开讨论后，关于纳米颗粒的生物毒性和细胞生物学作用方面的研究已成为纳米技术发展的核心问题[1-2]。而目前国内外就纳米颗粒生物安全性的研究还只是处在初步的探索阶段，其研究深度也只是停留在一般组织病理学和细胞毒性（数量、形态和功能方面）检测的细胞层面上，缺乏从根本上揭示颗粒致细胞毒性或生物学不良反应的内在联系，即无法从真正意义上回答纳米颗粒的生物安全性问题[3-4]。
羟基磷灰石是生物相容性材料的典型代表，纳米级的羟基磷灰石颗粒也具有广阔的生物及临床应用前景。然而纳米颗粒正是由于其特殊的尺寸，在具有优异的理化性能的同时，它也可以通过生物学屏障，对RNA、DNA等细胞内大分子造成损伤，那么这种风险该如何来避免呢[5-6]？因此，要解决纳米羟基磷灰石颗粒的应用安全性问题，关键从分子水平上探索颗料与细胞接触后会如何改变信号转导通路，包括生成何种应激蛋白，细胞损伤相关基因是如何相互调控等。
目前已证实关卡控制基因准确控制着细胞DNA损伤的应答时序，协调应答的过程，而P53、P21、Gadd45和HSP70等都是此类基因，它们可以通过调节DNA复制、阻断细胞周期或促进细胞凋亡等程序，引起诸多相关基因的转录[7]。本实验通过探讨纳米羟基磷灰石颗粒对细胞损伤基因的影响，试图为纳米颗粒的安全应用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
设计：对比观察实验。
单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院/上海生物材料研究测试中心。
材料：2005-12/2006-12在上海生物材料研究测试中心完成以下相关实验。
纳米羟基磷灰石颗粒悬浮液的制备：纳米羟基磷灰石颗粒由中科院上海硅酸盐所提供，粒径大小为30～80 nm。300 W/40 kHz的超声条件下，用含10%小牛血清的RPMI-1640振荡纳米颗粒，制备成终浓度为1 g/L的悬浮液，4 ℃保存1周。
实验动物：雄性SD大鼠，2个月龄，体质量200～250 g，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司(SCXK(沪)2003-0002)，实验前1周于22 ℃室温饲养。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，资料收集为第二作者，实施为第二作者，评估为第一作者，采用盲法评估。
方法：
大鼠巨噬细胞的培养及诱导：大鼠腹腔注射6%的淀粉肉汤，5 mL/只，连续2 d，72 h后麻醉下处死大鼠，75%乙醇消毒。用D-Hank’s灌洗腹腔，无菌条件下吸取腹腔液，离心1 500 r/min，8 min，以10%小牛血清的RPMI-1640调整细胞浓度至2×109 L-1到6孔板，37 ℃，体积分数为0.05的CO2的条件下培养4.0～5.0 h后，PBS洗去未贴壁的细胞。加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基正常培养24 h后，用200，100，20，10 mg/L不同浓度的纳米羟基磷灰石颗粒诱导细胞24 h[8]。
反转录－聚合酶链反应检测相关蛋白：不同浓度纳米羟基磷灰石颗粒作用大鼠腹腔单核巨噬细胞24 h 后，用Trizol试剂盒按说明书提取细胞总RNA。2 μg总RNA于20 μL反应体系反转录，2 μL 反转录产物于 25 μL体系PCR，β-actin与P53、P21、Gadd45和HSP70各目的基因分别进行同管扩增[9]。采用Primer Premier 5.0进行引物设计（引物由华大基因－上海鼎安合成）。P53引物序列及参数为：5-GCG TTG CTC TGA TGG TGA-3（上游），5-CAG CGT GAT GAT GGT AGG A-3（下游），退火温度55 ℃，35个循环，产物232 bp；Gadd45：5-CGA TGC CCT GGA GGA AGT-3（上游），5-CGC AAC AGA AAG CAC GAA T-3（下游），退火温度48 ℃，30 个循环，产物191 bp；HSP70：5-GCG ACC TGA ACA AGA GCA-3（上游），5-GGG CTG GTT GTC CGA GTA-3（下游），退火温度50 ℃，30个循环，产物239 bp；P21：5-TAC GTC TGG GAG CGT GTT C-3（上游），5-AAA TCT GTT AGG CTG GTC TGC-3（下游），退火温度50 ℃，30个循环，产物266 bp；β-actin：5-GAG AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3（上游），5-CAT CTG CTG GAA GGT GGA CA-3（下游），退火温度48/50/55 ℃，30/35 个循环，产物452 bp。1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。凝胶成像仪拍照， BIO-RAD 软件对RT-PCR的电泳结果做灰度扫描。mRNA 表达相对强度=各条带灰度值/相应β-actin条带灰度值。
主要观察指标： P53、Gadd45、P21、HSP70及 β-actin的表达强度。
统计学分析：数据均采用Means±SD表达，由第二作者采用SPSS 12.0软件进行样本均数的t检验分析。当 P < 0.05时，提示差异有显著性意义。
2 结果
RT-PCR结果显示不同浓度的纳米羟基磷灰石颗粒对DNA损伤的相关基因的表达有着不同程度的影响，见图1。
羟基磷灰石颗粒的纳米颗粒对P53表达有明显的影响，P53的表达与纳米羟基磷灰石颗粒的浓度呈一定的正相关，见图2。经统计学分析，当纳米羟基磷灰石颗粒浓度为100 mg/L时，它的表达与阴性对照相比差异有显著性意义（P < 0.05）；而当200 mg/L纳米颗粒诱导巨噬细胞后，P53有极其显著的表达（P < 0.01）见表 1。
各浓度的纳米羟基磷灰石颗粒对gadd45的转录则无明显影响，见图3。经统计学分析，与阴性对照相比，纳米羟基磷灰石颗粒诱导后gadd45均无显著表达（P > 0.05）。见表2。
巨噬细胞经纳米羟基磷灰石颗粒诱导24 h后，HSP70的表达情况与P53相似，它的表达也与纳米羟基磷灰石颗粒的浓度呈一定的正相关，见图4。经统计学分析，当纳米羟基磷灰石颗粒浓度为100 mg/L时，它的表达与阴性对照相比差异有显著性意义（P < 0.05）；而当200 mg/L纳米颗粒诱导巨噬细胞后，HSP70有极其显著的表达（P < 0.01）。见表3。
纳米羟基磷灰石能够诱导P21的表达，见图5。而经统计学分析，该蛋白的表达随着纳米羟基磷灰石颗粒浓度的递增而上调，当其浓度达到100 mg/L时，P21的表达量最高。而当200 mg/L的纳米羟基磷灰石颗粒诱导巨噬细胞后，P21的表达则下调。见表4。
3 讨论
目前国际上已证实有30多种基因参与细胞对DNA损伤的应答。P53是一种著名的原癌基因，同时也是具有监测细胞内DNA损伤状况功能的指标蛋白。作为P53的下游基因，p53蛋白会通过上调P21（细胞周期依赖的蛋白激酶抑制剂）的表达，从而阻止细胞分裂并给细胞提供足够的时间来修复损伤。Gadd45(生长抑制和DNA损伤诱导基因)则含有一个与p53结合的元件，它可以与p21 竞争结合PCNA(增殖细胞核抗原)，从而通过切除核苷酸来修复受损的DNA。然而，如果受损的DNA是不能被修复的，P53将调控Bcl-2、Fas等机制来启动细胞凋亡及其他程序。因此在本实验中，通过分子水平上检测DNA损伤应答通路中P53、P21及gadd45的表达，来探讨不同的纳米颗粒对细胞损伤的作用途径和机制。
本实验结果表明，纳米羟基磷灰石颗粒能够诱导P53的活化，并且P53的表达与纳米羟基磷灰石颗粒的浓度呈明显的正相关性。而作为P53的下游基因，纳米羟基磷灰石颗粒引起P21和gadd45的表达情况则完全不同。在一定浓度纳米羟基磷灰石颗粒的诱导下，P21有明显表达，但gadd45却无明显变化。因此，以上研究结果证实纳米羟基磷灰石颗粒在10～200 mg/L的浓度条件下能够明显造成细胞DNA的损伤，并且相对于切除核苷酸来修复受损DNA的方式，纳米羟基磷灰石颗粒更倾向于通过P53阻止细胞分裂来给细胞提供足够的时间来修复损伤。同时还有一点值得注意的是，当纳米羟基磷灰石颗粒达到200 mg/L时，P21的表达有所下调，这说明在这个浓度条件下，DNA的损伤已不易修复，细胞可能出现大量凋亡甚至坏死。
HSP家族是一类高同源性的分子伴侣蛋白家族，其中HSP70是其中较为重要的蛋白分子。HSP70在机体受到外界环境不利影响时对细胞可以起到保护和调控的重要作用，它通过调控下游信号如SAPK/ JNK信号通路而影响细胞凋亡，从而保护细胞以及维持生物体整体的功能性稳定。在本实验中，HSP70的表达随着纳米羟基磷灰石颗粒的浓度升高而增加，说明纳米羟基磷灰石颗粒引起的应激反应导致了HSP70早期反应性增高，从而利于细胞抵抗外界的干扰，保持细胞的长期稳定生存。
羟基磷灰石与组成人体硬组织的无机成分相似，与骨组织及软组织具有良好的结合性能，作为替代骨组织的生物活性材料，具有很大的潜力和应用前景[10]。而本研究已证明了羟基磷灰石的纳米颗粒对DNA有明显的损伤。因此当生物性良好的生物材料达到纳米级尺寸时，其比表面积大、表面能高，因而具有很高活性，而这些都将影响到材料与细胞的相互作用。所以说，纳米颗粒的应用风险不能简单地通过选用具有良好生物相容性的材料去制取的方法得以避免。同时，逐步建立适合纳米颗粒的安全性评价体系也是亟待解决的问题之一。
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