掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响**★

冯婷，顾志鹏，任大伟，张小华，万昌秀，余喜讯

课题背景：课题受两项国家自然科学基金资助，分别为“可降解生物材料与内皮细胞界面反应对细胞功能蛋白表达的影响及机理研究”（30370411）和“分子自组RAD16-RGD/CPP纳米仿生基质骨修复材料的研究”（50472091）。课题从新型骨修复材料聚磷酸钙出发，将锶元素掺入其中，与破骨细胞复合培养，观察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的形貌及生理功能的影响。

应用要点：①课题研究内容聚磷酸钙属于国际先进的新型生物材料。②课题组将锶元素掺入聚磷酸钙进行相关研究，国内属首次。③本实验为治疗骨组织缺损、缺失材料的研制提供新的思路及参考。

同行评价：文章观察了掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响，属于生物材料领域一个比较新颖的研究课题。作者采用了同聚磷酸钙作对比的方法，从细胞的形态和生理功能两方面进行了考察，结果表明锶元素的掺入能通过降低破骨细胞的活性，阻碍其增殖分化，从而显著地抑制其骨吸收能力。讨论参考了大量的国外文献，有一定的针对性，具有较高的科研和应用价值。

冯婷★，女，1984年生，四川省眉山市人，汉族，四川大学高分子科学与工程学院在读硕士，主要从事生物材料的研究。
leceline@163. com

通讯作者：余喜讯, 副教授，博士, 硕士生导师, 四川大学高分子科学与工程学院医用高分子与人工器官系,四川省成都市 610065
yuxixun@163.com

万昌秀，教授，博士生导师，四川大学高分子科学与工程学院医用高分子与人工器官系,四川省成都市 610065
wanchangxiu@ 163.com

摘要
目的：已有研究表明新型生物材料聚磷酸钙掺锶后能明显促进成骨细胞的增殖和分化。实验将掺锶聚磷酸钙与破骨细胞于体外复合培养，进一步从细胞的形态和生理功能两方面考察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响。
方法：实验于2006-10/2007-01在四川大学组织工程支架材料研究室及四川大学华西医学院生物医学工程重点实验室完成。将机械分离法获得的新生兔长骨破骨细胞分别种植于1 cm×1 cm×80 μm的骨片及由“湿式法”溶液反应法制备的φ2 mm×10 mm的掺锶聚磷酸钙样品上，以聚磷酸钙为对照，复合培养于24孔培养板中。复合培养7 d后，采用特异性抗酒石酸酸性磷酸酶染色方法鉴定实验细胞，通过扫描电镜观察骨片和掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙材料表面破骨细胞的形貌及骨吸收陷窝的形成情况。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
结果：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示试验细胞呈阳性。②骨片上形成的骨吸收陷窝多呈不规则形状，陷窝边界清晰，底面粗糙。证实所培养的细胞为破骨细胞。③复合培养7 d后，掺锶聚磷酸钙组材料表面陷窝形成的数量明显少于聚磷酸钙组材料。④复合培养7 d后，掺锶聚磷酸钙组材料表面破骨细胞的增殖度明显低于聚磷酸钙组材料。
结论：掺锶聚磷酸钙由于锶元素的掺入能通过降低破骨细胞的活性，阻碍破骨细胞的增殖分化，从而显著地抑制其骨吸收能力。
关键词：掺锶聚磷酸钙；破骨细胞；骨吸收；生物材料；组织工程

冯婷，顾志鹏，任大伟，张小华，万昌秀，余喜讯．掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):19-22 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-19(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00019-04

AIM:Calcium polyphosphate as a new biomaterial can enhance the replication and differentiation of osteoblasts after being incorporated strontium. In this report, we will conduct a complex culture of strontium-doped calcium polyphosphate (SCPP) with osteoclasts in vitro, and further observe the effect of SCPP on figuration and physiological function of osteoclasts.
METHODS: The experiment was performed at the Tissue Engineering Scaffold Materials Laboratory and Huaxi Biomedical Engineering Laboratory of Sichuan University from October 2006 to January 2007. Osteoclasts obtained from new-laid rabbits by mechanical separation were compounded with 1 cm×1 cm×80 μm bone slices and φ2 mm×10 mm SCPP sample, which was prepared with solution reaction method, in 24-hole culture plate. CPP was used as the control. SCPP and CPP were produced by 'wet process'. Seven days after culture, tartrate-resistant acid phosphatase staining was applied to identify the cells. Osteoclast figuration and resorptive pits on bone slice, SCPP and CPP were viewed by scanning electron microscopy.
RESULTS: ①Cells presented masculine after tartrate-resistant acid phosphatase staining.②Resorptive pits with clear edge and rough undersurface appeared irregular shape on bone slices. Osteoclasts were identified.③Seven days after co-culture, the number of the resorptive pits on surface of SCPP was much smaller than that of CPP. ④Seven days after co-culture, the proliferation of osteoclasts on surface of SCPP was obviously lower than that of CPP.
CONCLUSION: SCPP can remarkably inhibit the osteoclastic bone resorption by reducing its activity, proliferation and differentiation because of the addition of strontium.

Feng T, Gu ZP, Ren DW, Zhang XH, Wan CX, Yu XX.Effects of strontium-doped calcium polyphosphate on osteoclast.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):19-22(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-19(ps).pdf]

近年来，聚磷酸钙作为骨缺损修复材料、置换材料以及填充材料研究的一种无机聚合物，因具有可控降解速率、生物相容性好和足够的机械强度，越来越受到人们的重视[1－6]。本实验室将锶元素掺入聚磷酸钙中，制备一种新型的骨修复材料。实验表明掺锶后材料的力学性能得到了提高，并且促进了成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的合成[7-8]。骨组织的改建是通过成骨细胞和破骨细胞这一对矛盾统一体共同作用实现的，是一个骨形成的同时伴随着骨吸收的动态过程。新骨形成时骨形成大于骨吸收，而破骨细胞是骨吸收的功能细胞[9]。如果一种材料在促进成骨细胞增殖的同时又能抑制破骨细胞的骨吸收，则说明其具有很强的成骨能力，不仅是优良的骨修复材料，并且还能协助治疗因破骨细胞分化或功能的改变而导致的多种代谢性骨病如骨质疏松症、骨硬化症、Paget's骨病等[10－11]。本文在已有的研究成果基础上，将掺锶聚磷酸钙同聚磷酸钙作对比，与破骨细胞于体外复合培养，从细胞的形态和生理功能两方面考察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响。

1 材料和方法

设计：对比观察。
单位：四川大学高分子科学与工程学院医用高分子及人工器官系。
材料：实验于2006-10/2007-01在四川大学组织工程支架材料研究室及四川大学华西医学院生物医学工程重点实验室完成。实验用仪器：JSM-5900LV 型扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；MCO-18AIC 型二氧化碳恒温培养箱 (日本三洋公司)；IX2-SL 倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；实验用试剂：碳酸锶(分析纯)；碳酸钙(分析纯)；磷酸(分析纯)；新生兔3只（四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室）。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第四作者。
方法：
材料制备：称取1.8 g用“湿式法”溶液反应法制备的、保温5 h的掺锶聚磷酸钙[n（Sr）∶n（Ca）=1∶99]和聚磷酸钙烧料进行研磨筛分，并加入适量致孔剂硬脂酸和粘合剂，混合均匀后压制成直径 10 mm，高2 mm 的型胚，800 ℃下煅烧，γ射线消毒备用。
骨片制备：将新鲜牛股骨用锯式切片机将皮质骨切成1 cm×1 cm×80 μm的薄片，将骨片浸入蒸馏水中，超声清洗3次，紫外线照射20 min浸泡在生理盐水中，置于4 ℃冰箱中备用。分离破骨细胞前，取出骨片，浸泡于含抗生素的α-MEM培养液中，换液3次备用。
破骨细胞的培养：将新生兔断颈处死，体积分数为0.75乙醇浸泡5 min，无菌条件下取四肢长骨，在D-Hank’s平衡盐溶液中清除骨表面的软骨组织及骨膜，去除骨骺，用α-MEM培养液清洗骨干2次，然后在α-MEM全培养液内，将骨干纵行剖开，轻刮骨髓腔至颜色变白，用尖吸管吸取培养液反复冲洗骨髓腔面，收集冲洗液，用细胞筛网过滤，去掉骨碎片，1 000 r/min离心5 min，沉淀物加10 mL培养液悬浮，按1×109 L-1 接种于玻片、骨片和材料上，120 min后换α-MEM全培养诱导液，继续培养备用。
破骨细胞鉴定：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色：将细胞爬片置37 ℃烘箱中5 min烘干，再于体积分数为0.025戊二醛4 ℃固定10 min，同时温育孵育液至37 ℃。取出细胞爬片，双蒸水清洗3次，苏木精复染2 min，蒸馏水洗至核成蓝色，晾干，二甲苯处理，DPX封固。②破骨细胞形态观察：经破骨细胞培养至7 d的骨片用PBS浸洗3次，体积分数为0.025戊二醛4 ℃固定，乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金扫描电镜观察。③骨吸收陷窝观察：经破骨细胞培养至7 d的骨片用0.25 mol/L氢氧化铵超声处理10 min，以清除骨片上的破骨细胞，再以体积分数为0.025戊二醛4 ℃固定，乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金扫描电镜观察。
掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙对破骨细胞的形貌和骨吸收活性的影响：以掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙支架材料替代骨片，操作同破骨细胞鉴定的②和③。
主要观察指标：①骨片上破骨细胞的形貌及骨吸收陷窝的形成。②掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙支架材料上破骨细胞的形貌及骨吸收陷窝的数量。

2.1 破骨细胞的鉴定
2.1.1 抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察经7 d培养的破骨细胞，通过特异的抗酒石酸酸性磷
酸酶染色后，酶活性部位呈红色颗粒，分布于破骨细胞胞浆内，核为阴性。见图1。

2.1.2 破骨细胞形态观察培养7 d后骨片表面破骨细胞的扫描电镜照片见图2。从图中可以看出破骨细胞较其他细胞大，形态不规则，呈油煎蛋形、长条形、腊肠形等，细胞边缘有细小丝状伪足伸出，直径为30～50 μm。

2.1.3 骨吸收陷窝观察培养24 h左右的骨片上可见骨吸收陷窝形成，多为圆形或椭圆形，随着培养时间的延长，骨吸收陷窝的数量不断增多，面积不断扩大，还可见吸收陷窝呈贝壳行弯曲或不规则形状，有时成串出现，陷窝边界清晰，底面粗糙。扫描电镜观察经7 d培养后的破骨细胞在骨片上形成的骨吸收陷窝，见图3。
2.2 掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙对破骨细胞的影响
2.2.1 对骨吸收活性的影响培养7 d后掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙材料表面骨吸收陷窝的扫描电镜照片见图4。从图中可以看出掺锶聚磷酸钙材料表面的陷窝数明显少于聚磷酸钙材料表面的陷窝数。
2.2.2 对破骨细胞形貌的影响培养7 d后掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙材料表面的破骨细胞的扫描电镜照片见图5。从图中可以看出，材料上的破骨细胞形态多样，大多呈现不规则形态，低倍镜下可见聚磷酸钙材料表面的细胞数量明显多于掺锶聚磷酸钙。

3 讨论

破骨细胞的典型特征为多核，富含抗酒石酸酸性磷酸酶，有丰富的降钙素受体以及在骨薄片上可以形成骨吸收陷窝等[12－13]。破骨细胞鉴定的一个重要指标是抗酒石酸酸性磷酸酶染色，由于抗酒石酸酸性磷酸酶为破骨细胞胞浆中所特有的酸性磷酸酶，多核巨噬细胞中没有，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色是破骨细胞的特异性鉴定方法。破骨细胞的重要功能是骨吸收，在骨片上形成骨吸收陷窝是也是破骨细胞鉴定的重要标准。本实验采用新生兔长骨机械分离方法，并通过贴壁细胞抗酒石酸酸性磷酸酶特异性染色以及典型骨吸收陷窝的形成，证实所培养的细胞具有明显的破骨细胞特征。
锶是人体必需的微量元素之一，实验证明锶可促进骨骼生长，并具有防龋的作用[14－15]。本实验将锶元素掺入聚磷酸钙骨修复材料中，与破骨细胞于体外复合培养，观察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的形貌和生理功能的影响。有研究表明锶通过直接和/或基质介导的对破骨细胞活性和分化的抑制作用能明显抑制骨吸收[16]。骨组织的破坏主要包括有机质的破坏和无机质的溶解。Violette等[17]研究显示无机质的溶解先于有机质的破坏，且吸收陷窝形成过程中，破骨细胞呈边脱矿边运动，其脱矿能力表现为间隙性爆发状态。破骨细胞的破骨途径可能包括：①摄取矿化组织的基质、无机盐复合物和细胞周围的基质，并在细胞内消化。②分泌水解酶、溶酶体酶，导致矿化组织结构溶解。③分泌酸，促进矿化组织的脱矿作用。④产生超氧化物，降解骨组织。从掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙材料的扫描电镜照片中可以看出，两种材料表面均出现了边界清晰的可测深度的凹陷，但是聚磷酸钙表面的凹陷明显多于掺锶聚磷酸钙，说明锶元素的掺入抑制了破骨细胞的活性，推测是由于锶阻碍了破骨细胞的增殖分化所致。
聚磷酸钙和掺锶聚磷酸钙材料表面破骨细胞形貌的扫描电镜图证实了聚磷酸钙中锶的掺入，阻碍了破骨细胞的增殖分化。锶降低破骨细胞的活性，减少破骨细胞的数量，降低骨吸收速率[18]。
理想骨修复材料的最重要的一个因素就是必须要具有很好的生物相容性和促成骨的能力。骨修复材料在掺入适量锶后，各方面性能都有所改善，不仅提高了材料的力学性能，而且与成骨的主要功能细胞成骨细胞具有良好的相容性，同时还能抑制破骨细胞的骨吸收活性，这为骨修复过程的顺利进行创造了条件。
结论：本文将锶元素掺入聚磷酸钙，并同破骨细胞于体外复合培养，观察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的形貌和生理功能的影响。结果表明锶元素的掺入能通过降低破骨细胞的活性，阻碍其增殖分化，从而显著地抑制其骨吸收能力。
致谢：感谢四川大学分析测试中心王辉老师协助完成扫描电镜分析。

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