仿生合成梯度含锶磷酸钙骨水泥的体外细胞生物学性能检测☆

岳进1，毛天球1，雷德林1，郭大刚2

课题背景：大量研究表明，锶取代钙掺入磷灰石后对其性能产生重要影响，不仅改善了生物相容性、生物活性、骨传导性，还协同提高了其降解速率与力学性能。此外，低剂量锶还具有促进骨形成、抑制骨吸收等生物学效能。最近，西安交通大学发明了由磷酸氢锶、磷酸四钙、磷酸氢钙组成的掺锶磷灰石骨水泥，并对其微观结构、理化性能等方面进行了系统深入的研究。作为合作项目，本文系统考察掺锶磷灰石骨水泥水化产物的体外细胞毒性以及成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与表达等一系列体外细胞生物学性能，并探讨了掺锶量对这些性能的影响规律，为今后材料的进一步改进并应用于医学领域奠定基础。

应用要点：本实验作为含锶羟基磷灰石生物相容性测试的基础部分，观察了含锶羟基磷灰石的体外细胞生物学行为，完成了对材料的基本细胞生物学行为的评价。根据实验结果判断，含锶羟基磷灰石的细胞生物相容性良好，其他测试结果（实验未完全结束，未在本文中体现）也提示含锶羟基磷灰石可能是一种有广泛临床应用前景的生物材料。

同行评价：在仿生理条件下合成了梯度含锶磷酸钙骨水泥，并采用成纤维细胞和成骨细胞研究了材料的生物相容性。实验表明含锶磷酸钙骨水泥具有较好的细胞相容性，锶的含量与材料的降解性能、细胞毒性有一定的关系。其新颖性在于该材料未经过高温煅烧，可能更接近生理条件下的骨材料。

1解放军第四军医大学口腔医院颌面外科，陕西省西安市710032；2西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西省西安市 710049

岳进☆，男，1973年生，吉林省扶余县人，汉族，解放军第四军医大学在读博士，主治医师，主要从事骨组织工程支架材料的研究。
jinrey@sina.com

通讯作者: 毛天球，教授，博士生导师，解放军第四军医大学口腔医院颌面外科，陕西省西安市710032
maotian-qiu@hotmail.com

摘要
目的：通过在仿生理条件下构建梯度含锶磷酸钙骨水泥，并应用L-929成纤维细胞和幼兔成骨细胞检测含锶磷酸钙骨水泥的体外生物学性能。
方法：实验于2006-11/2007-04在解放军第四军医大学口腔医院颌面外科和西安交通大学金属材料强度国家重点实验室完成。①实验材料：仿生理条件下合成梯度含锶磷酸钙骨水泥。②实验方法：应用了L-929成纤维细胞和成骨细胞两种细胞，将不同浓度的梯度含锶磷酸钙骨水泥分别与两种细胞接触。③评估指标：采用MTT检测法，对细胞增殖活性进行检测，计算细胞相对增殖率，用6级毒性分类法评级；并应用相差显微镜、扫描电镜进行形态学观察。用碱性磷酸酶测定试剂盒检测浸提液对兔成骨细胞功能表达的影响；检测其细胞毒性、促成骨细胞黏附、增殖及表达能力以及生物降解潜能。
结果：仿生理条件下合成的梯度含锶磷酸钙骨水泥无细胞毒性，表面成骨细胞的黏附性良好，增殖活跃，并显示出可能存在良好的生物降解能力。
结论：含锶磷酸钙骨水泥体外细胞生物相容性良好，是安全的新型骨组织工程支架材料。
关键词: 磷酸钙骨水泥；锶；生物相容性；成骨细胞；成纤维细胞

岳进，毛天球，雷德林，郭大刚．仿生合成梯度含锶磷酸钙骨水泥的体外细胞生物学性能检测[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):23-26 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-23(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00023-04

Biomimetic synthesis of gradient Sr-containing calcium phosphate cement and cytobiological performance assay in vitro

AIM:This study constructed novel gradient Sr-containing calcium phosphate cement (CPC) by means of biomimetic synthesis and investigated the biocompatibility of this material using L-929 fibroblasts and young rabbit osteoblasts.
METHODS: From November 2006 to April 2007, the experiment was carried out in the Department of Oral-Maxillofacial Surgery, Stomatological College at the Fourth Military Medical University of Chinese PLA and the State Key Laboratory for Mechanical Behavior of Materials at Xi'an Jiaotong University.①Novel gradient Sr-containing CPCs were biomimetic synthesized.②The new biomaterials were contacted with L-929 fibroblast cells and rabbit's osteoblasts in different situations.③MTT assay was used to detect the cell proliferation activity, and relative proliferation rate was calculated and graded according to 6-level toxicity classification. Morphology of cells was determined by using contrast phase microscope and scanning electron microscope. Alkaline phosphatase assay was applied for the influence of leaching liquor on the rabbit osteoblast function. Cytotoxicity, capacity of promoting the adhesion, proliferation and expression of osteoblasts as well as biodegradable potential were all detected.
RESULTS: No cytotoxicity, good adhesion and proliferation of osteoblasts to the surface were detected in Sr-containing CPC by means of biomimetic synthesis, indicating active biodegradation might occur in Sr-containing CPC.
CONCLUSION: The gradient Sr-containing CPC synthesized biomimetically shows good biocompatibility in vitro, and can be used safely in tissue engineering bone scaffold.

Yue J, Mao TQ, Lei DL, Guo DG. Biomimetic synthesis of gradient Sr-containing calcium phosphate cement and cytobiological performance assay in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):23-26(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-23(ps).pdf]

磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement，CPC)属多孔结构材料，最终固化产物是羟基磷灰石，具有良好的生物相容性和骨传导性。因其可处理成浆料形式直接注入骨缺损并能原位固化，在骨科、修复重建外科及牙科骨替代矫正及重建外科中得到广泛应用[1-5]，由于机械性能低、降解速度慢等缺点又使其应用受到一定限制[6]。为提高材料的性能，国内外的学者做了许多有益的探讨[7-8]。据报道低剂量锶（Sr）（一般低于10%）置换磷灰石中部分钙而获得的含锶磷酸钙骨水泥（Sr-CPC）不仅改变了其溶解动力学[9]，提高了生物降解性，而且还具有比纯羟基磷灰石更好的生物相容性、骨传导性，甚至一定程度上的骨诱导能力[10-11]，但有报道显示不同方法合成的Sr-CPC生物学性能差异较大[12]，在其应用于临床前必须进行严格的生物学性能检测[13]。本文通过在仿生理条件下构建了梯度Sr-CPC，并应用L-929成纤维细胞及幼兔成骨细胞检测了Sr-CPC的体外生物学性能。

设计：开放性实验。
单位：解放军第四军医大学口腔医院颌面外科。
材料：实验于2006-11/2007-04在解放军第四军医大学口腔医院颌面外科和西安交通大学金属材料强度国家重点实验室完成。选择出生1个月的新西兰幼兔1只（由解放军第四军医大学口腔动物中心提供），雄性，体质量0.3 kg，动物合格证号：0207282，饲养温度：23~25 ℃ ，相对湿度：44%。
主要仪器与材料：超净台（苏州医疗设备厂）；相差显微镜(Olympus)；酶联免疫检测仪（华东电子管厂）；DMEM(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青，经灭活后使用)；噻唑蓝、二甲基亚砜、谷胺酰胺、胰蛋白酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C（Sigma)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；苯酚 (西安化学制剂有限公司，分析纯)。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者。
方法：
Sr-CPC样品制备：本实验试样是Sr-HAC水化产物，为白色粉末（过100目ASTM筛），由西安交通大学金属材料强度国家重点实验室提供，制备方法见文后参考文献[14]。
L-929成纤维细胞检测梯度含锶磷酸钙骨水泥的细胞毒性[15]：
浸提液的制备：将制备的4组水泥试样烘干、研磨成白色粉状分别编为0%Sr-CPC、1%Sr-CPC 、5%Sr-CPC和10%Sr-CPC，每组取6个平行试样紫外线照射灭菌3 h备用。浸提递质为含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液（新鲜配制，pH=7.2）。按照Sr-CPC粉末重量：浸提递质=1 g∶10 mL比例配制，37 ℃，体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱中浸提48 h待用。
细胞培养：选用生长旺盛的L-929成纤维细胞(小鼠成纤维细胞，第四军医大学口腔医学院生物学教研室提供)：用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养，2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中止消化，稀释，将细胞按浓度1×107 L-1接种到96孔板中，每孔重复5遍，共接种细胞悬液200 μL。
浸提液作用培养细胞：将浸提液按1 000，500，250，100 g/L浓度稀释，阳性对照为6.4 mL/L 苯酚，阴性对照为细胞培养液。细胞贴壁24 h后，移去上清。取浸提液及苯酚、细胞培养液分别加入96孔板中，每孔200 μL， 37 ℃，体积分数为0.05的CO2环境中培养。
MTT检测法：细胞培养1，3，5 d后，取浸提液与细胞作用的培养板，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃，体积分数为0.05的CO2 饱和湿度环境下继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，酶联免疫检测仪570 nm波长下测定各孔光吸收值（A值，用单纯培养液调零），取平均值。计算细胞相对增殖率。

按GB/T16886.5-2003/ISO 10993-5:1999规定的6级毒性分级法[16]，确定材料毒性并进行形态学观察。
幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达[17]:
通过相差显微镜，扫描电镜观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附情况。幼兔成骨细胞的表达采用碱性磷酸酶活性检测法检测。
细胞培养：选用幼兔成骨细胞，选择出生1个月的新西兰幼兔1只。消毒后颈椎脱臼法处死，取四肢浸于75%乙醇溶液5 min消毒后移入超净台。取四肢长骨骨髓细胞，用 DMEM 培养液冲洗骨髓腔，取上清进行培养，培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，待细胞汇合成单层后，2.5 g/L的胰蛋白酶常规消化、传代。将传代细胞加入条件培养基（DMEM完全培养基中加入地塞米松1×10-8 moL/L，β－甘油磷酸钠10 mmoL/L、维生素C 50 mg/L）继续培养，使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。
材料的制备及细胞接种：将材料制成大小为4 mm× 4 mm×2 mm 的圆片状，超声波清洗后烘干、灭菌，DMEM 完全培养基预湿备用。将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×104/孔)种植后置于6孔板培养皿培养。以不加材料、放置盖玻片后种植的成骨细胞作为对照，并对此5组分别进行相差显微镜及扫描电镜观察。另将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×104/孔)与4种材料复合置于24孔板中培养作为实验组，以单独培养的成骨细胞作为对照，对此5组进行细胞增殖与碱性磷酸酶活性检测。
培养细胞的形态学观察：通过相差显微镜(Olympus IX70)逐日观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附情况。扫描电镜观察：成骨细胞/材料复合后第5天取出，用2.5%冷戊二醛固定、系列丙酮脱水、乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。
碱性磷酸酶活性检测法：采用碱性磷酸酶测定试剂盒，分别在细胞培养1，3，5 d后取样，按照测定孔、标准孔、空白孔分组，按照试剂盒说明书操作，酶联免疫检测仪520 nm波长下测定各孔光吸收值（A值，用空白管调零）。
主要观察指标：①检测L-929细胞的增殖活性。②观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖情况，检测碱性磷酸酶活性。
统计学分析：采用SPSS 11.0由解放军第四军医大学统计学教研室进行数据统计分析，行t检验。

2.1 梯度含锶磷酸钙骨水泥的体外细胞毒性评价见图1。
进行细胞毒性实验的每一天均在相差显微镜下观察两种细胞，细胞形态基本正常。对于毒性评级为1级者，均由两名实验人员再次镜下观察、讨论，均认为细胞形态无明显变化。
2.2 幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达见图2。

图2a，b显示，材料表面成骨细胞数量较少，部分贴壁生长、分泌基质，并开始侵蚀、破坏材料，破坏范围小，程度轻。
图2c，d显示，材料表面成骨细胞数量多，有分泌功能并分泌多量基质，细胞数量及功能与0% Sr-CPC、1% Sr-CPC组有差别。Sr-CPC表面可见较多细胞侵蚀破坏。
从表1可以看出，随着培养时间的延长，5组细胞碱性磷酸酶含量都有所增加。材料表面成骨细胞碱性磷酸酶活性由高到低的顺序为5%Sr-CPC> 10%Sr-CPC>1%Sr-CPC>0%Sr-CPC，比较相同时间点5组间碱性磷酸酶含量，统计学无显著意义(P > 0.05)。

3 讨论

应用仿生理条件成功合成梯度Sr-CPC，反应在常温下进行，符合临床要求，有利于尽早开发出可应用于临床实际的骨水泥产品。
实验首先选用GB/T16886.5-2003/ISO 10993-5:1999[16]推荐的L-929成纤维细胞对含锶0%、1%、5% 及10%Sr-CPC的浸提液进行了细胞毒性研究结果发现不同含锶量CPC的细胞毒性评级均为0或1级，Sr-CPC无细胞毒性，各组之间细胞毒性差异无显著性意义（P > 0.05）。该结论与陈德敏等[18]实验结论相类似。本文中毒性为0级即相对增殖率≥100%的浸提液数量较多，说明仿生理条件下形成的Sr-CPC产物细胞毒性低。
对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指标之一[19]。Sr-CPC浸提液作用于成骨细胞的实验中可以看到其细胞毒性评级也为0～1级，Sr-CPC无成骨细胞毒性，各组之间细胞毒性差异无显著意义（P > 0.05）。分析发现随着浸提液浓度升高、作用时间延长，细胞毒性似有增大的趋势，但统计学分析显示并无明显相关性。材料的细胞毒性与材料含锶量呈现出一种5%Sr-CPC<10%Sr-CPC≈1%Sr-CPC<0% Sr-CPC趋势，即5%Sr-CPC细胞毒性最低，0%Sr-CPC细胞毒性相对略高，统计学分析差异并无显著性意义。
综合分析幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达实验结果可知：成骨细胞在4种不同骨水泥材料表面均有黏附、增殖及表达，但程度有所不同。5%Sr-CPC、10%Sr-CPC更加适合成骨细胞的黏附与增殖，碱性磷酸酶表达也更加明显，二者镜下差异不明显。0%Sr-CPC、1%Sr-CPC表面成骨细胞黏附较少，增殖不活跃。电镜照片显示5%Sr-CPC、10%Sr-CPC材料表面较多的陷窝、小颗粒提示细胞数量多，材料溶解、破坏重，提示加入适量(5%～10%)Sr可以改善CPC的溶解动力学，提高其生物降解性。但目前尚缺乏有关的远期实验结果。
结论：①仿生理条件下可以制备出梯度含锶磷酸钙骨水泥，反应在常温下进行，符合临床应用需要。②不同含锶量CPC的细胞毒性评级均为0或1级，各试样的细胞毒性与其含锶量、作用时间、浸提液浓度有一定关联性。③适量锶元素的加入可以促进成骨细胞的黏附、增殖及表达，改善材料的溶解动力学，提高其生物降解性，更加符合临床要求。

1 Markovic M, Takagi S, Kim D, et al. Effects of particle size and cement liquid composition on calcium phosphate cement properties. J Dent Res 1997；76(5): 2942-2946
2 Liu C, Shao H, Chen F, et al.Effects of the granularity of raw materials on the hydration and hardening process of calcium phosphate cement. Biomaterials 2003;24(23):4103-4113
3 Liao DP,Zhou ZY,Gu YF.Shanghai Kouqiang Yixue 2000;6(2):73-75
廖大鹏,周正炎,顾云峰. 锶磷灰石修复下颌骨缺损的实验研究[J].上海口腔医学，2000，6(2):73-75
4 Mainard D, Galois L. Treatment of a solitary calcaneal cyst with endoscopic curettage and percutaneous injection of calcium phosphate cement. J Foot Ankle Surg 2006;45(6):436-440
5 Neumann A, Reske T, Held M, et al.Comparative investigation of the biocompatibility of various silicon nitride ceramic qualities in vitro. J Mater Sci Mater Med 2004;15(10):1135-1140
6 Zhu JC,Chu CL,Yin ZD.Xiyou Jinshu Cailiao yu Gongcheng 2003;32(6):432-435
朱景川,储成林,尹钟大.羟基磷灰石/钛生物功能梯度材料种植体与骨的结合强度[J].稀有金属材料与工程，2003,32 (6):432-435
7 Bohner M, Gbureck U, Barralet JE. Technological issues for the development of more efficient calcium phosphate bone cements: a critical assessment. Biomaterials 2005;26(33):6423-6429
8 Nilsson M, Wang JS, Wielanek L, et al.Biodegradation and biocompatability of a calcium sulphate-hydroxyapatite bone substitute. J Bone Joint Surg Br 2004;86(1):120-125
9 Christoffersen J, Christoffersen MR, Kolthoff N, et al.Effects of strontium ions on growth and dissolution of hydroxyapatite and on bone mineral detection. Bone 1997;20(1):47-54
10 Grynpas MD, Hamilton E, Cheung R, et al.Strontium increases vertebral bone volume in rats at a low dose that does not induce detectable mineralization defect. Bone 1996;18(3):253-259
11 Johal KK, Mendoza-Suárez G, Escalante-García JI, et al.In vivo response of strontium and zinc-based ionomeric cement implants in bone. J Mater Sci Mater Med 2002;13(4):375-379
12 Guo DG,Xu KW,Yue J,et al.Wuji Cailiao Xuebao 2005;20(5):1159-1166
郭大刚,徐可为,岳进，等.含锶磷灰石骨水泥浆体的pH值及其固化体的体外细胞毒性评价[J].无机材料学报，2005,20(5):1159-1166
13 Yamada Y, Ueda M. Regenerative medicine for bone using mesenchymal stem cells. Nippon Ronen Igakkai Zasshi 2006;43(3):338-341
14 Zhao XY,Guo DG,Han Y,et al.Wuji Cailiao Xuebao 2005;20(5):1167-1173
赵晓云，郭大刚，憨勇，等.含锶磷酸钙骨水泥的制备及性能研究[J].无机材料学报，2005,20(5):1167-1173
15 Yue J,Lei DL,Guo DG,et al.Zhongguo Linchuang Kangfu 2005;9(2):32-33
岳进,雷德林,郭大刚，等.组织工程骨支架的材料学研究：短棒状纳米羟基磷灰石的细胞毒性检测[J].中国临床康复，2005,9(2):32-33
16 GB/T16886.Beijing:Zhongguo Biaozhun Chubanshe 2003:80-88
GB/T16886.5-2003医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验.医疗器械生物学评价标准汇编[M].北京：中国标准出版社，2003：80-88
17 Choong CS, Hutmacher DW, Triffitt JT. Co-culture of bone marrow fibroblasts and endothelial cells on modified polycaprolactone substrates for enhanced potentials in bone tissue engineering. Tissue Eng 2006;12(9):2521-2531
18 Chen DM,Fu YF.Xiandai Kouqiang Yixue Zazhi 2003;17(6):501-503
陈德敏,傅远飞.不同含锶量的掺锶羟基磷灰石细胞毒性评价[J].现代口腔医学杂志,2003,17(6):501-503
19 González-Carrasco JL, Ciapetti G, Montealegre MA, et al.Evaluation of mechanical properties and biological response of an alumina-forming Ni-free ferritic alloy. Biomaterials 2005;26(18):3861-3871