骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙人工骨的研制及释放实验*★

王玮1，2，章莹1，吴文1

课题背景：课题属2005广东省科技三项经费计划项目(No. 2005B34001008)，项目名称：组织工程骨复合骨唾液酸蛋白的基础与临床研究。课题已取得的成果：成功将人骨唾液酸蛋白基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，以融合蛋白的形式表达重组骨唾液酸蛋白。

相关链接：骨唾液酸蛋白是骨发生过程中的关键因子之一，广泛参与骨形成和骨重建的诸多环节。从目前研究情况看，骨唾液酸蛋白有良好的成骨效应，在组织工程骨成为研究热点的今天，完全可以成为一种新的骨生长因子应用于组织工程骨修复骨缺损。目前关于骨唾液酸蛋白成骨的动物实验较少，且缺乏系统性，尚有许多工作要完成。

应用要点：实验证实了骨唾液酸蛋白在骨缺损内的成骨活性。与目前惟一应用于临床的骨生长因子骨形态发生蛋白对比，骨唾液酸蛋白来源方便，造价低廉，且由于其具多重成骨效应，有可能成为一种新型的与组织工程骨复合的生长因子，组织工程骨与骨唾液酸蛋白复合体的产业化将具有很好的应用前景。

1解放军广州军区广州总医院骨科，广东省广州市 510010；2广州医学院，广东省广州市 510182

王玮★，男，1982年生，江西省德兴市人，汉族，2007年广州医学院毕业，硕士，医师，主要从事骨组织工程研究。
myemail306@
tom.com

通讯作者：章莹，博士，副主任医师，解放军广州军区广州总医院骨科，广东省广州市 510010
zhangying-doc@
yahoo.com.cn

摘要
目的：研制骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙（BSP-β-TCP）人工骨并观察BSP-β-TCP中骨唾液酸蛋白的释放规律。
方法：实验于2006-12/2007-07在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。①BSP-β-TCP人工骨制备：采用低温负压冻干的方法将骨唾液酸蛋白复合于β-磷酸三钙中，按骨唾液酸蛋白含量不同制备两种样品：A样品含骨唾液酸蛋白1﹪， B样品含骨唾液酸蛋白2﹪。②观察指标：两种样品分别在恒温空气浴振荡器内(37±1)℃持续振荡。试验开始2 周内每24 h，以后每72 h时分别吸出浸泡液100 μL / 次,共观察4 周。用考马斯亮蓝法测定各个时间点溶液中蛋白质含量；绘制出蛋白质释放量和时间关系的散点图，再将散点图的曲线直线化，分析BSP-β-TCP人工骨中骨唾液酸蛋白的释放动力学。
结果：①骨唾液酸蛋白释放率：72 h内有一个爆发性的释放，释放率A样品为25.44﹪，B样品为35.11﹪；10 d内的释放速度较快，A样品为39.76﹪，B样品为44.13﹪；持续4周仍有缓慢释放，A样品为55.43﹪，B样品为56.82﹪。②骨唾液酸蛋白的释放动力学：将散点图曲线进行拟和后可见释放量与时间（h）平方根成线性关系，两者的关系符合Higuchi方程。
结论：骨唾液酸蛋白以扩散方式释放，β-磷酸三钙可作为良好的载体与BSP共同形成缓释系统。
关键词：骨唾液酸蛋白；β-磷酸三钙；释放动力学；组织工程骨

王玮，章莹，吴文，骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙人工骨的研制及释放实验[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):27-30
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-27(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00027-04

Preparation and protein release of bone sialoprotein-beta-tricalcium phosphate artificial bone

AIM:To prepare bone sialoprotein-β-tricalcium phosphate (BSP-β-TCP) artificial bone and observe releasing rule of BSP in the artificial bone.
METHODS: The experiment was carried out in the Medical Laboratory of Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA between December 2006 and July 2007.①BSP in combination with β-TCP was conducted by using low temperature, negative pressure and freeze-dried device, to prepare BSP-β-TCP artificial bone. Two kinds of BSP-β-TCP artificial bone were produced according to the content of BSP: A sample (containing 1% BSP) and B sample (containing 2% BSP).②The two samples were persis0 tently oscillated in constant temperature air bath (37±1) ℃. The soak was inhausted 100 μL per time every 24 hours within two weeks after experiment, and then every 72 hours later, the observation lasted 4 weeks. Coomassie brilliant blue method was used to determine the protein content in solution at every time point. The scatterplot of relation between protein releasing amount and time was drawn, then lined curve of scatterplot was conducted to analyze releasing kinetics of BSP in BSP-β-TCP artificial bone.
RESULTS: ①BSP had an breaking out delivery in 72 hours, and the BSP release rate of A sample was 25.44% while that of B sample was 35.11%; BSP kept a high releasing rate in 10 days, 39.76% in A sample and 44.13% in B sample; slow releasing still remained for 4 weeks, the BSP release rate of A sample was 55.43%, and that of B sample was 56.82%.②After making the curve fitting of scatterplot, the linear correlation relationship between the release amount of BSP and the square root of time (hour) was found, in agreement with Higuchi equation.
CONCLUSION: BSP release from BSP-β-TCP artificial bone in a diffuse manner. As a carrier, β-TCP can form slow-release system with BSP.

Wang W, Zhang Y, Wu W.Preparation and protein release of bone sialoprotein-beta-tricalcium phosphate artificial bone.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):27-30(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-27(ps).pdf]

磷酸钙骨水泥(Calcium Phosphate Cement，CPC)属多孔结构材料，最终固化产物是羟基磷灰石，具有良好的生物相容性和骨传导性。因其可处理成浆料形式直接注入骨缺损并能原位固化，在骨科、修复重建外科及牙科骨替代矫正及重建外科中得到广泛应用[1-5]，由于机械性能低、降解速度慢等缺点又使其应用受到一定限制[6]。为提高材料的性能，国内外的学者做了许多有益的探讨[7-8]。据报道低剂量锶（Sr）（一般低于10%）置换磷灰石中部分钙而获得的含锶磷酸钙骨水泥（Sr-CPC）不仅改变了其溶解动力学[9]，提高了生物降解性，而且还具有比纯羟基磷灰石更好的生物相容性、骨传导性，甚至一定程度上的骨诱导能力[10-11]，但有报道显示不同方法合成的Sr-CPC生物学性能差异较大[12]，在其应用于临床前必须进行严格的生物学性能检测[13]。本文通过在仿生理条件下构建了梯度Sr-CPC，并应用L-929成纤维细胞及幼兔成骨细胞检测了Sr-CPC的体外生物学性能。

设计：开放性实验。
单位：解放军第四军医大学口腔医院颌面外科。
材料：实验于2006-11/2007-04在解放军第四军医大学口腔医院颌面外科和西安交通大学金属材料强度国家重点实验室完成。选择出生1个月的新西兰幼兔1只（由解放军第四军医大学口腔动物中心提供），雄性，体质量0.3 kg，动物合格证号：0207282，饲养温度：23~25 ℃ ，相对湿度：44%。
主要仪器与材料：超净台（苏州医疗设备厂）；相差显微镜(Olympus)；酶联免疫检测仪（华东电子管厂）；DMEM(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青，经灭活后使用)；噻唑蓝、二甲基亚砜、谷胺酰胺、胰蛋白酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C（Sigma)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；苯酚 (西安化学制剂有限公司，分析纯)。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者。
方法：
Sr-CPC样品制备：本实验试样是Sr-HAC水化产物，为白色粉末（过100目ASTM筛），由西安交通大学金属材料强度国家重点实验室提供，制备方法见文后参考文献[14]。
L-929成纤维细胞检测梯度含锶磷酸钙骨水泥的细胞毒性[15]：
浸提液的制备：将制备的4组水泥试样烘干、研磨成白色粉状分别编为0%Sr-CPC、1%Sr-CPC 、5%Sr-CPC和10%Sr-CPC，每组取6个平行试样紫外线照射灭菌3 h备用。浸提递质为含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液（新鲜配制，pH=7.2）。按照Sr-CPC粉末重量：浸提递质=1 g∶10 mL比例配制，37 ℃，体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱中浸提48 h待用。
细胞培养：选用生长旺盛的L-929成纤维细胞(小鼠成纤维细胞，第四军医大学口腔医学院生物学教研室提供)：用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养，2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中止消化，稀释，将细胞按浓度1×107 L-1接种到96孔板中，每孔重复5遍，共接种细胞悬液200 μL。
浸提液作用培养细胞：将浸提液按1 000，500，250，100 g/L浓度稀释，阳性对照为6.4 mL/L 苯酚，阴性对照为细胞培养液。细胞贴壁24 h后，移去上清。取浸提液及苯酚、细胞培养液分别加入96孔板中，每孔200 μL， 37 ℃，体积分数为0.05的CO2环境中培养。
MTT检测法：细胞培养1，3，5 d后，取浸提液与细胞作用的培养板，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃，体积分数为0.05的CO2 饱和湿度环境下继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，酶联免疫检测仪570 nm波长下测定各孔光吸收值（A值，用单纯培养液调零），取平均值。计算细胞相对增殖率。

按GB/T16886.5-2003/ISO 10993-5:1999规定的6级毒性分级法[16]，确定材料毒性并进行形态学观察。
幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达[17]:
通过相差显微镜，扫描电镜观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附情况。幼兔成骨细胞的表达采用碱性磷酸酶活性检测法检测。
细胞培养：选用幼兔成骨细胞，选择出生1个月的新西兰幼兔1只。消毒后颈椎脱臼法处死，取四肢浸于75%乙醇溶液5 min消毒后移入超净台。取四肢长骨骨髓细胞，用 DMEM 培养液冲洗骨髓腔，取上清进行培养，培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，待细胞汇合成单层后，2.5 g/L的胰蛋白酶常规消化、传代。将传代细胞加入条件培养基（DMEM完全培养基中加入地塞米松1×10-8 moL/L，β－甘油磷酸钠10 mmoL/L、维生素C 50 mg/L）继续培养，使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。
材料的制备及细胞接种：将材料制成大小为4 mm× 4 mm×2 mm 的圆片状，超声波清洗后烘干、灭菌，DMEM 完全培养基预湿备用。将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×104/孔)种植后置于6孔板培养皿培养。以不加材料、放置盖玻片后种植的成骨细胞作为对照，并对此5组分别进行相差显微镜及扫描电镜观察。另将第3代幼兔成骨细胞(种植密度5×104/孔)与4种材料复合置于24孔板中培养作为实验组，以单独培养的成骨细胞作为对照，对此5组进行细胞增殖与碱性磷酸酶活性检测。
培养细胞的形态学观察：通过相差显微镜(Olympus IX70)逐日观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附情况。扫描电镜观察：成骨细胞/材料复合后第5天取出，用2.5%冷戊二醛固定、系列丙酮脱水、乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。
碱性磷酸酶活性检测法：采用碱性磷酸酶测定试剂盒，分别在细胞培养1，3，5 d后取样，按照测定孔、标准孔、空白孔分组，按照试剂盒说明书操作，酶联免疫检测仪520 nm波长下测定各孔光吸收值（A值，用空白管调零）。
主要观察指标：①检测L-929细胞的增殖活性。②观察幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖情况，检测碱性磷酸酶活性。
统计学分析：采用SPSS 11.0由解放军第四军医大学统计学教研室进行数据统计分析，行t检验。

2.1 梯度含锶磷酸钙骨水泥的体外细胞毒性评价见图1。
进行细胞毒性实验的每一天均在相差显微镜下观察两种细胞，细胞形态基本正常。对于毒性评级为1级者，均由两名实验人员再次镜下观察、讨论，均认为细胞形态无明显变化。
2.2 幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达见图2。

图2a，b显示，材料表面成骨细胞数量较少，部分贴壁生长、分泌基质，并开始侵蚀、破坏材料，破坏范围小，程度轻。
图2c，d显示，材料表面成骨细胞数量多，有分泌功能并分泌多量基质，细胞数量及功能与0% Sr-CPC、1% Sr-CPC组有差别。Sr-CPC表面可见较多细胞侵蚀破坏。
从表1可以看出，随着培养时间的延长，5组细胞碱性磷酸酶含量都有所增加。材料表面成骨细胞碱性磷酸酶活性由高到低的顺序为5%Sr-CPC> 10%Sr-CPC>1%Sr-CPC>0%Sr-CPC，比较相同时间点5组间碱性磷酸酶含量，统计学无显著意义(P > 0.05)。

3 讨论

应用仿生理条件成功合成梯度Sr-CPC，反应在常温下进行，符合临床要求，有利于尽早开发出可应用于临床实际的骨水泥产品。
实验首先选用GB/T16886.5-2003/ISO 10993-5:1999[16]推荐的L-929成纤维细胞对含锶0%、1%、5% 及10%Sr-CPC的浸提液进行了细胞毒性研究结果发现不同含锶量CPC的细胞毒性评级均为0或1级，Sr-CPC无细胞毒性，各组之间细胞毒性差异无显著性意义（P > 0.05）。该结论与陈德敏等[18]实验结论相类似。本文中毒性为0级即相对增殖率≥100%的浸提液数量较多，说明仿生理条件下形成的Sr-CPC产物细胞毒性低。
对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指标之一[19]。Sr-CPC浸提液作用于成骨细胞的实验中可以看到其细胞毒性评级也为0～1级，Sr-CPC无成骨细胞毒性，各组之间细胞毒性差异无显著意义（P > 0.05）。分析发现随着浸提液浓度升高、作用时间延长，细胞毒性似有增大的趋势，但统计学分析显示并无明显相关性。材料的细胞毒性与材料含锶量呈现出一种5%Sr-CPC<10%Sr-CPC≈1%Sr-CPC<0% Sr-CPC趋势，即5%Sr-CPC细胞毒性最低，0%Sr-CPC细胞毒性相对略高，统计学分析差异并无显著性意义。
综合分析幼兔成骨细胞在梯度含锶磷酸钙骨水泥表面的黏附、增殖与表达实验结果可知：成骨细胞在4种不同骨水泥材料表面均有黏附、增殖及表达，但程度有所不同。5%Sr-CPC、10%Sr-CPC更加适合成骨细胞的黏附与增殖，碱性磷酸酶表达也更加明显，二者镜下差异不明显。0%Sr-CPC、1%Sr-CPC表面成骨细胞黏附较少，增殖不活跃。电镜照片显示5%Sr-CPC、10%Sr-CPC材料表面较多的陷窝、小颗粒提示细胞数量多，材料溶解、破坏重，提示加入适量(5%～10%)Sr可以改善CPC的溶解动力学，提高其生物降解性。但目前尚缺乏有关的远期实验结果。
结论：①仿生理条件下可以制备出梯度含锶磷酸钙骨水泥，反应在常温下进行，符合临床应用需要。②不同含锶量CPC的细胞毒性评级均为0或1级，各试样的细胞毒性与其含锶量、作用时间、浸提液浓度有一定关联性。③适量锶元素的加入可以促进成骨细胞的黏附、增殖及表达，改善材料的溶解动力学，提高其生物降解性，更加符合临床要求。

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