课题背景：激素治疗瘢痕是常用和疗效较为肯定的方法，但存在很多缺点如常发生激素的副作用和瘢痕萎缩等。为了探索更好的应用激素，又能避免激素副作用的治疗方法，特设立本课题。

偏倚或不足：课题仅使用含有去炎松-A 1 mg/cm2的固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶，未设其他剂量组做对照；实验亦未涉及到与其他治疗方法的比较，没有设立更多的实验组作为多因素之间关系的分析。

同行评价：增生性瘢痕和瘢痕疙瘩由于其确切的发病机制不甚明确，尚没有金标准治疗方法。糖皮质激素治疗增生性瘢痕效果虽较好，但长期应用有一定的副作用。作者针对这一问题，在应用方法上作一些改进，对临床应用有一定帮助。

1甘肃省人民医院烧伤整形科，甘肃省兰州市 730000；2兰州大学，甘肃省兰州市 730000；3解放军兰州军区总医院烧伤治疗中心，甘肃省兰州市 730050

郭庆民★，男，1968年生，山东省济宁市人，汉族，兰州大学在读硕士，主治医师，主要从事瘢痕及其治疗研究。
Guoqingmin.cool
@163.com

摘要
目的：为克服目前瘢痕非手术治疗中糖皮质激素治疗的副作用，尝试应用去炎松-A固体脂质纳米颗粒经透皮吸收技术治疗瘢痕，观察其效果。
方法: 实验于2007-04/08在解放军兰州军区总医院动物实验中心实验室进行。①造模：选用新西兰白兔16只，每个兔耳上将全层皮肤切除，形成1 cm×1 cm上、下两个创面，术后30 d上皮化生逐渐形成病理性瘢痕。②分组干预：造模成功后随机分为对照组和实验组，每组8只。对照组不干预，实验组于术后30 d起应用含有去炎松-A 1 mg/cm2 的固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶覆于已形成的瘢痕上透皮吸收。③观察指标：分别于模型形成后第30，60，90和120天时依次取每只大白兔左耳上、下，右耳上、下的病理性瘢痕作为标本来源进行组织病理学观察，同时采用免疫组化检测组织中的ki-67表达和羟脯氨酸含量，并抽静脉血测血中皮质醇浓度。
结果：16只白兔均进入结果分析。①实验组做模型后第30天时ki-67表达及羟脯氨酸含量与对照组比较无明显差异（P > 0.05），但第60，90和120天实验组瘢痕组织中表达及羟脯氨酸含量较对照组明显减少（P < 0.01）。②实验组及对照组各时段血中的皮质醇浓度比较无明显差异（P > 0.05）。③实验组造模后120 d病理性瘢痕中成纤维细胞的数量少于对照组。
结论：含有去炎松-A 1 mg/cm2 的固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶透皮吸收对瘢痕有治疗作用，且长期应用血液中的皮质醇浓度不升高，能预防糖皮质激素治疗瘢痕的副作用。
关键词：固体脂质纳米颗粒；病理性瘢痕；去炎松-A；透皮吸收技术；卡波姆凝胶；ki-67；羟脯氨酸；皮肤组织构建

郭庆民，薛晓东，吴建，蒋丽媛， 樊芙蓉.去炎松-A固体脂质纳米颗粒透皮吸收在瘢痕治疗中的效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):35-38 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-35(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00035-04

收稿日期：2007-10-10
修回日期：2007-12-14
(07-50-10-5466/N·Y)

Triamcinolone acetonide acetate-loaded solid lipid nanoparticles of transdermal drug delivery in treatment of scars

Abstract

AIM:In order to conquer the side-effects of glucocorticoid in non-operative treatment of the pathological scar, this study investigated the therapeutic effect of triamcinolone acetonide acetate (TAA)-loaded solid lipid nanoparticles (SLN) of transdermal drug delivery for treating the scar.
METHODS: From April to August in 2007, the experiment was carried out in the Animal Central Laboratory of the General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA.①Sixteen New Zealand white rabbits, subjected to cutting the full skin on the ears and formed two 1×1 cm2 injures, were used in the study, then the pathological scar model was gradually conducted after epithelization at 30 days postoperatively.②The successful models were randomly divided into control (C) group and treatment (T) group, each containing 8 animals. No treatment was given in C group after modeling, while T group was treated with transdermal drug delivery of TAA-loaded SLN (1 mg/cm2) carbomer gel for 90 days since the 30th day after modeling.③The cutaneous tissue samples from rabbit ear scar in each group were harvested on the 30th, 60th, 90th and 120th days after modeling for the pathomorphological examination. Hydroxyproline (Hyp) content and ki-67 expression were determined by immunohistochemical technique. Meanwhile the quantity of corticosteroid in venous blood was also detected.
RESULTS: All the 16 rabbits were involved in the result analysis.①Content of the Hyp and the expression of ki-67 were no remarkably significant between C group and T group (P > 0.05), but higher in the scar of rabbits in C group on the 60th, 90th, 120th days after modeling compared with T group (P < 0.01).②There was no significant difference in the quantity of corticosteroid between C group and T group (P > 0.05).③The fibroblasts in the pathological scar was reduced in T group than in C group at 120 days postoperatively.
CONCLUSION: Treatment with transdermal drug delivery of TAA-loaded SLN (1 mg/cm2) carbomer gel is beneficial to the treatment of pathological scar, and it would be significant to maintain quantity of corticosteroid and prevent side-effects of glucocorticoid.

Guo QM, Xue XD, Wu J, Jiang LY, Fan FR.Triamcinolone acetonide acetate-loaded solid lipid nanoparticles of transdermal drug delivery in treatment of scars.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):35-38(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-35(ps).pdf]

0 引言

在病理性瘢痕治疗方法中有手术和非手术治疗两种。非手术治疗包括药物治疗、压迫治疗、放疗、激光治疗、冷冻疗法等，在各种非手术治疗中以糖皮质激素最常用并疗效肯定。但是口服糖皮质激素全身副作用明显，疗效差；局部注射只能用于小面积范围并且局部疼痛明显，注射药物不均匀，易产生并发症等缺点；局部外涂激素类药物对深部瘢痕疗效差，需每日涂抹多次，临床疗效不确定[1]。去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶稳定性好，可延长药物的释放时间，相对于普通的水性凝胶，去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶有较高皮肤渗透性，使用皮肤促透剂月桂氮酮渗透性更强，被认为是一个公认的透皮吸收载体。本实验为克服现阶段激素治疗的各种缺点，应用去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶透皮吸收治疗病理性瘢痕，观察其效果及副作用。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：甘肃省人民医院，解放军兰州军区总医院。
材料：实验于2007-04/08在解放军兰州军区总医院动物实验中心实验室进行。
动物：选用健康成年新西兰大白兔16只，购自解放军兰州军区总医院动物实验（许可证号：SYXK（军）2002-026）中心，兔耳健全，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，分笼饲养。饲养条件：温度25 ℃，湿度50%。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
药品和试剂：去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶购自华中科技大学化学系和武汉生科院医学材料研究所。羟脯氨酸标准品购于中国科学院上海生物化学研究所。
设计、实施、评估者: 为所有作者，均经过培训。
技术路线：
动物模型的制作：动物瘢痕模型的制作参照Morris等[2]方法并加以改良。用30 g/L戊巴比妥钠1.5 mg/kg做耳缘静脉麻醉，严格无菌操作技术下，在兔耳腹侧作 1 cm×1 cm大小创面，去掉兔耳全层皮肤，每只兔耳做上、下2个相同创面（图1），共64个创面，术后创面暴露带创面自行愈合可逐渐形成病理性瘢痕（图2）。
分组处理：兔耳创面30 d上皮化生后将16只大白兔随机分成两组，每组8只。一组为对照组，另一组为实验组。对照组仅做模型不干预，实验组模型成功后用含有去炎松-A（1 mg/cm2）固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶覆于已形成的瘢痕上。

病理性瘢痕组织中ki-67表达：分别于模型形成后第30，60，90和120天时依次取每只大白兔左耳上、下，右耳上、下的病理性瘢痕作为标本来源，所取标本均经体积分数0.1的中性甲醛固定，组织常规包埋。蜡块存档备用。所有蜡块作4.0~5.0 μm连续切片，每例切2张，取一张作苏木精-伊红染色作病理学检查，其余行免疫组化染色。每一批染色均用已知阳性片作阳性对照，用PBS液代替一抗，作空白对照。Ki-67阳性反应为棕黄色颗粒，定位于细胞核[3]。按文后参考文献[4]方法，于高倍镜下（×400）选择5个连续不间断视野，计数500个细胞中阳性细胞数，计算每100个细胞中阳性细胞数作为ki-67标记指数（ki-67 LI）。
羟脯氨酸测定：①标准曲线的绘制： 用羟脯氨酸标准品（中国科学院上海生物化学研究所）。按文后参考文献[5]制作标准曲线。②样品测定：分别于模型形成后第30，60，90和120天时依次取每只大白兔左耳上、下，右耳上、下的病理性瘢痕作为标本来源。称取瘢痕组织块20 mg，剪成1 mm ×1 mm ×1 mm大小后装于安瓿中，加入6 mol/L HCl 1 mL,酒精灯封口，130 ℃烤箱内烤3 h。冷却后加入10 mol/L NaOH 0.55 mL,调节pH值至5～7。样品定容于5 mL，吸样品0.1 mL稀释成1 mL，取0.2 mL稀释液加入试管中，标准管加入0.2 mL浓度为10 mg/L羟脯氨酸标准液，空白管加0.2 mL蒸馏水代替。按文后参考文献[5]测量样品羟脯氨酸含量，根据公式羟脯氨酸含量（mg/g）=样品吸光度/标准管吸光度×10×50÷20，计算羟脯氨酸在1 g组织中（湿重）中的含量。
血液中皮质醇浓度测定：分别于模型形成后第30，60，90和120天时早上8点抽兔耳血1 mL测血液中皮质醇的含量。测定方法为RIA法。
主要观察指标：病理性瘢痕组织中ki-67表达、羟脯氨酸含量和血液中皮质醇的浓度。
统计学分析：实验数据用_x±s表示。用SPSS10.0统计软件处理。两组资料的比较用配对资料的t检验。检验水准α＝0.05，由兰州大学医学部统计学教研室主任丁建生教授进行统计学处理。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验过程中无动物死亡，2组16只大白兔均进入结果分析。
2.2 病理性瘢痕组织中ki-67表达 见表1。

由表1 可见，实验组做模型后第30天时ki-67表达与对照组比较差异无显著性意义（P > 0.05），但第60，90和120天时实验组ki-67表达较对照组明显减少，差异有非常显著性意义（P < 0.01）。
2.3 病理性瘢痕组织中羟脯氨酸的含量 见表2。

 

由表2可见，实验组做模型后第30天时羟脯氨酸的含量与对照组比较差异无显著性意义（P > 0.05），但第60，90和120天时实验组羟脯氨酸的含量较对照组明显减少，差异有非常显著性意义（P < 0.01）。
2.4 血液中皮质醇浓度比较 见表3。

由表3可见，实验组做模型后第30，60，90和120天时血液中皮质醇浓度与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.5 组织病理学变化 对照组造模后30 d可见表皮角质化，无正常的皮肤结构，血管内皮细胞增生，淋巴细胞浸润，纤维细胞增生，细胞排列紊乱、水肿（图3）。对照组造模后120 d可见表皮角质化，瘢痕组织增厚，无正常的皮肤结构，血管内皮细胞增生，淋巴细胞浸润，纤维细胞增生，细胞排列紊乱（图4）。实验组造模后30 d可见表皮角质化，无正常的皮肤结构，血管内皮细胞增生，淋巴细胞浸润，纤维细胞增生，细胞排列紊乱、水肿（图5）。实验组造模后120 d表皮角质化，瘢痕变薄，皮肤结构接近正常，毛细血管减少，纤维细胞排列基本正常（图6）。

3 讨论

3.1 动物瘢痕模型 创伤后瘢痕愈合是人类特有的一种病理现象，瘢痕增生不仅影响外观，而且常导致功能障碍[6]。由于动物难以形成瘢痕的特性使瘢痕研究受到限制。1997年Muir等[7]发现兔耳创面有真皮过度增生现象，1998年国内学者报道建立兔耳增生性瘢痕模型的研究资料[8]，并证实兔耳增生性瘢痕与人类增生性瘢痕发生过程及其结构都很相似[9-10]。有研究表明创面做得越大创面组织增生越明显。在实验中观察到兔耳瘢痕增生在创面上皮化后（术后19 d左右），到上皮化后30 d增生达最高，可持续两三个月，以后逐渐软化，变薄，与人类增生性瘢痕变化相似[8，11-12]。
3.2 去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶 固体脂质纳米颗粒呈球形[13]，平均直径为95.5～186.2 nm，Zeta电位为-26.3～-15.7 mV；根据去炎松-A含量不同包埋率为67.4%～90.3%。去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶稳定性好，可延长药物的释放时间[14]，经皮释放速率符合Higuchi公式[15]。相对于普通的水性凝胶，该凝胶有较高皮肤渗透性，使用皮肤促透剂月桂氮酮渗透性更强[16]，被认为是一个公认的透皮吸收载体[17-18]。
3.3 去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶透皮吸收在瘢痕治疗中的作用 在实验组中经使用去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶治疗后，病理性瘢痕中成纤维细胞的数量、ki-67的表达、羟脯氨酸的含量均较对照组有明显下降，但血液中的皮质醇浓度两者无差异，说明去炎松-A透皮吸收在瘢痕治疗中有作用，同时又能预防激素治疗的副作用。由于本课题研究的范围较小，只限于用去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶透皮吸收的方法来代替传统的糖皮质激素治疗的方法，未设去炎松-A不同剂量组的比较，如通过以后设计几组实验组的研究，血中皮质醇浓度仍和对照组在统计学上无意义时，为去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶治疗大面积的病理性瘢痕提供实验依据。同时本实验也未涉及到其他治疗方法和去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶透皮吸收在瘢痕治疗之间的比较，没有设立更多的实验组作为多因素之间关系的分析。本实验仅起到证明去炎松-A固体脂质纳米颗粒卡波姆凝胶可有效治疗瘢痕组织的同时又可能有效预防应用糖皮质激素引起的副作用，可在以后的实验中再进行与本实验相关的实验来进行比较不同治疗方法的优缺点。

4 参考文献

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