聚乳酸乙醇酸/ RNA Ⅲ抑制肽缓释微球组织相容性评价*☆

张小斌，郝立波，王继芳，姚琦，梁茂华

课题背景：课题为国家自然科学基金资助项目（30640088）。葡萄球菌生物被膜引起的人工关节感染治疗棘手，最新的研究表明RNA Ⅲ抑制肽可以是葡萄球菌一种有效的全面抑制剂，其作用机制与传统抗生素明显不同。本课题组在国内首次合成RNA Ⅲ抑制肽，并对其作用机制和防治葡萄球菌感染的能力进行了初步的研究。

应用要点：实验在前期研究的基础之上，制备PLGA/RNA Ⅲ抑制肽缓释微球，选择急性全身毒性实验、MTT细胞毒性实验、肌肉内植入实验、过敏实验和热源实验, 对PLGA/RNA Ⅲ抑制肽的组织容性和安全性进行初步评价，为其应用于临床奠定基础。

同行评价：实验将可防治葡萄球菌引起的感染的RNA Ⅲ抑制肽包载于PLGA微球中，并根据国际标准化组织(ISO)和国家标准GB/T16886-1规定的实验考察了PLGA/RIP微球的组织相容性，研究表明材料具有良好的组织相容性。该研究可为材料的进一步动物实验，甚至临床实验提供依据。

张小斌☆，男，1972年生，陕西省汉中市人，汉族，解放军总医院骨科在读博士，主治医师，主要从事关节外科研究。Xjtubin2@163.com

通讯作者：郝立波，博士，副主任医师，解放军总医院骨科，北京市 100853

摘要
目的：在前期实验证实可防治葡萄球菌感染的RNA Ⅲ抑制肽（RNAⅢ inhibiting peptide, RIP）具有良好的组织相容性和安全性的基础上，进一步评价聚乳酸乙醇酸/ RIP(PLGA/ RIP)缓释微球的组织相容性。
方法: 实验于2005-10/2007-10在解放军总医院骨科研究所、临床药理研究所及医学动物实验中心完成。①PLGA/RIP微球制备：采用Fmoc法由C端至N端先合成粗品肽；采用反相液相色谱法对RIP粗品进行纯化分析,按紫外吸收峰收集组分,冷冻干燥,得到RIP纯品。再采用液相复乳法制备直径50~70 μm的PLGA/RIP微球。②组织相容性实验：以急性全身毒性实验观察 PLGA/RIP的全身毒性反应；MTT细胞毒性实验观察PLGA/RIP对细胞增殖的影响；肌肉内植入实验观察材料有无肌肉刺激反应；过敏实验观察PLGA/RIP的致敏情况；热原实验观察材料对体温的影响。
结果：①急性全身毒性实验结果：腹腔注射PLGA/RIP洗提原液和50%的PLGA/RIP洗提液后动物无中毒反应，无死亡，体质量无明显变化。②MTT细胞毒性实验结果：两种洗提液的平均细胞增殖率均大于85%，细胞毒等级1级，不具有细胞毒性。③肌肉内植入实验结果：RIP和PLGA/RIP植入4 周后，组织未见明显充血、变性或坏死。材料周围未见明显炎症细胞浸润, 材料已被纤维囊包裹。④过敏实验结果：3组动物的平均原发刺激指数分别为0.38，0.33和0.31，3组间无显著差别。⑤热原实验结果：各组动物体温升高均在0.5 ℃以下, 证实材料无热源性，符合热原实验的评价标准。
结论: PLGA/RIP不引起全身毒性反应，无细胞毒性，未见免疫排斥，不引起过敏反应，无热源性，具有良好的组织相容性和安全性。
关键词：PLGA/RIP微球；组织相容性；动物实验；生物材料

张小斌，郝立波，王继芳，姚琦，梁茂华. 聚乳酸乙醇酸/RNA Ⅲ抑制肽缓释微球组织相容性评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):39-42 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-39(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00039-04

Histocompatibility of polyaiticglycolic acid/RNAⅢ inhibiting peptide sustained release microspheres

AIM:RNAⅢ inhibiting peptide (RIP) has been previously proved to possess good histocompatibility and safety for preventing and curing staphylococcal infection, and this study evaluated histocompatibility of polyaiticglycolic acid/RIP (PLGA/RIP) sustained release microsphere.
METHODS: The experiment was performed in the Orthopedic Institute, Pharmacologic Research Institute and Animal Experimental Center of General Hospital of Chinese PLA from October 2005 to October 2007.①Preparation of PLGA/RIP: The solid-phase synthesis (Fmoc) method was used to synthesize RIP from C end to N end, then the synthesized peptide was purified by the reverse phase high performance liquid chromatography, and composition was collected by means of ultraviolet absorption peak. The purified RIP was obtained after freezing and drying. Liquid-phase multiple emulsion method was used to synthesize PLGA/RIP microsphere of 50-70 μm diameter.②Acute general toxicity test was studied in PLGA/RIP. Effect of PLGA/RIP on the cell proliferation was detected with cytotoxicity test by MTT method. Intramuscular implanting test was used to observe the irritation reaction of muscles by implantation materials. Sensitivity test was used to observe the sensitization of PLGA/RIP. Changes of animal's body temperature were determined with pyrogen test.
RESULTS: ①Acute general toxicity test: Neither toxicosis reaction nor animal death was found after animals were injected with 100% and 50% eluents of PLGA/RIP peritoneally. Animal's body weight was not changed significantly.②Cytotoxiciity test by MTT method: The average proliferation rate of cell in two kinds of eluents exceeded 85% and cytotoxicity was graded in 1 rank, indicating no cytotoxicity.③Intramuscular implanting test: At 4 weeks after RIP and PLGA/RIP were implanted into the animals, there was not obvious synathresis, denaturation or necrosis in tissues. No inflammatory cell infiltration occurred around the materials. There had been the fibrous capsules around the materials.④Sensitivity test: Average primary irritation index of three groups were 0.38, 0.33 and 0.31 respectively. There was no significant difference among three groups.⑤Pyrogen test: Fervescence of each animal in the experiment was under 0.5 ℃, confirming that the materials had no pyrogenic characteristics. This was in coincidence with evaluation criterion of pyrogen test.
CONCLUSION: PLGA/RIP has good histocompatibility and safety, without general toxic reaction, cytotoxicity, immunological rejection, hypersensitive response or pyrogenic characteristics.

Zhang XB, Hao LB, Wang JF, Yao Q, Liang MH.Blood compatibility of polyaiticglycolic acid/RNA Ⅲ inhibiting peptide microspheres.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):39-42(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-39(ps).pdf]

人工关节感染是一种灾难性的并发症，治疗棘手[1]，能产生生物被膜的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是引起人工关节感染反复发作、迁延难愈的主要病原菌[2-3]。研究证实RNA Ⅲ抑制肽(RNAⅢ inhibiting peptide,RIP)可防治包括甲氧西林耐药金葡菌和表皮葡萄球菌在内的迄今所有实验用葡萄球菌引起的感染[4]，是一种全面有效的葡萄球菌抑制剂[5]。本实验合成RIP，制备聚乳酸乙醇酸（PLGA）/RIP缓释微球，根据国际标准化组织(ISO)和国家标准GB/T16886-1[6-7], 选择急性全身毒性实验、MTT细胞毒性实验、肌肉内植入实验、过敏实验和热源实验, 对其组织相容性进行初步评价。

设计：随机对照动物实验。
单位：解放军总医院骨科。
材料：实验于2005-10/2007-10在解放军总医院骨科研究所、临床药理研究所及医学动物实验中心完成。成年健康新西兰大白兔44只，雌雄不限, 体质量2.5～3.0 kg, 由解放军总医院动物实验中心(动物中心许可证号: XYXK (军)2005-2007) 提供，采用随机数字法分组。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
药品及试剂: PLGA（山东省医疗器械研究所)，二甲基亚砜，MTT（Sigma公司），DMEM（Gibco公司），二硝基氟苯（军事医学科学院）。
设计、实施、评估者: 设计为第一、二作者, 实施为第一、二作者, 评估为全部作者。
技术路线：
PLGA/RIP微球制备：①采用有机化学固相合成Fmoc法合成RIP，由C端至N端，先合成粗品肽；采用反相液相色谱法，应用Waters600高效液相色谱仪（Waters公司，美国）对RIP粗品进行纯化分析, 214 nm处检测紫外吸收,按峰收集组分,冷冻干燥,即得到RIP纯品。②10 mg RIP溶于100 μL水中形成内水相，100 mg的PLGA 75/ 25 ,（η= 0.25，山东省医疗器械研究所）溶于0.7 mL二氯甲烷中形成油相，内水相加入油相中冰浴超声乳化，形成初乳，将初乳加入到10 mL外水相中（含1%PVA），700 r/min搅拌4 h，过滤，洗涤，真空冻干,即制成直径50~70 μm的PLGA/RIP微球, γ射线照射灭菌（剂量250 kGy）, 4~8 ℃储存备用。
洗提液制备：PLGA/RIP微球粉末，按1 g/L在37 ℃无菌条件下用生理盐水洗提72 h，制得洗提液原液；加入同体积的无菌生理盐水制得50%稀释液。
急性全身毒性实验：选取健康成年新西兰兔18只, 随机分为3组，每组6只。实验组按5 mL/kg剂量腹腔内分别注射PLGA/RIP洗提原液和50%的PLGA/RIP洗提液，空白对照组按5 mL/kg剂量腹腔内注射无菌生理盐水。分别于注射后当时及术后24，48，72 h观察动物饮食活动情况, 并记录各组动物全身有无不良反应或死亡。动物如出现中毒表现，则根据其症状程度记录：①无中毒: 动物反应良好，无任何中毒症状。②轻度中毒: 轻度异常，无运动减少、呼吸困难或腹部刺激症状。③明显中毒: 有腹部刺激症状、呼吸困难、运动减少、腹泻，体质量下降。④重度中毒：严重腹部刺激症状、发绀、震颤、衰竭、呼吸困难、体质量明显下降。⑤死亡。
MTT细胞毒性实验：①选择293T细胞株（解放军军事医学科学院提供），为传代48 h生长旺盛的细胞，以细胞培养液作为阴性对照。②用含体积分数为0.1的小牛血清的DMEM培养基配制3×108 L-1的细胞悬液，以2.5×104/孔的浓度接种于96孔板中，每孔体积200 μL，再分别加入20 μL洗提液原液和50%浓度洗提液；置于37 ℃，体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养72 h后，再于每孔中加入5 g/L MTT 20 μL，37 ℃下培养4 h，吸除培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL,振荡30 min。③用ELX800 μV型酶标仪（BIO-TEK公司）测定其吸光度（A值，实验波长500 nm）。重复3次，取平均值，计算相对增殖率（RGR）。相对增殖率=(实验组吸光度值/ 阴性对照组吸光度值) ×100%。最后转化为相应的细胞毒性等级。标准如下：RGR≥100%为0级， 75%~99%为1级，50%~74%为2级，25%~49%为3级，1%~24%为4级，RGR≤0为5级。
肌肉内植入实验：选取健康成年新西兰兔8只,随机分为2组, 每组4只。将动物用1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉麻醉后, 局部去毛、常规消毒铺巾，在动物脊柱两侧背部皮肤作长约1.5 cm 的2个小切口, 切开背部皮肤、皮下组织, 钝性分开脊柱两侧骶棘肌, 分别植入PLGA/RIP微球和RIP粉末10 mg，丝线缝合肌膜, 固定植入材料并作标记, 常规缝合切口。术后第1，2，4 周每次每组处死1只动物, 切下植入材料部分肌肉,体积分数为0.1的甲醛固定，常规组织切片，肉眼和苏木精-伊红染色切片观察有无肌肉刺激反应。
过敏实验：① 动物分组处理：12 只成年新西兰大白兔，随机分为实验组、阳性对照组和阴性对照组各4只。实验前24 h 剔除大白兔背部正中10 cm2皮毛。乙醇清洁暴露区域, 在每只新西兰大白兔去毛区作6 点对称的皮内注射, 各点相距约2 cm。实验组、阳性对照组和阴性对照组分别注射洗提液原液、2%二硝基氟苯、生理盐水。②观察指标：注射后即刻和注射后24，48和72 h观察局部皮肤反应，按照红斑、焦痂和水肿程度记分：无红斑、轻微红斑、中等红斑，清晰可见、较大红斑和严重红斑呈紫红色甚至形成焦痂依次计0~4分；无水肿、极轻微水肿、清晰水肿、较大水肿，轮廓清晰和严重水肿，高度>1 cm，向周围扩大依次计0~4分；刺激总评分为8分。计算平均原发刺激指数。原发刺激指数=红斑、水肿总分/注射点总数，平均原发刺激指数=所有动物原发刺激指数和/动物总数。0~0.4为无刺激，0.5~1.9为轻刺激，2.0~4.9为中度刺激，5.0~8.0为强刺激。
热原实验：①动物分组处理：新西兰兔实验前在同一环境条件下, 使用同一种饲料，连续测量7 d 体温, 均应在正常范围内，体质量不减轻, 精神、食欲、排泄等无异常。选用2 组( 每组3 只) 共6只符合要求的新西兰兔。每组的3只兔分别自耳缘静脉注射PLGA/RIP洗提液原液和50%稀释液，温度均为37 ℃，剂量为1 mL/kg, 2 次/周。②观察指标：注射后每隔1 h 测量一次体温, 共测3次, 以3次中体温最高的一次减去正常体温，即为该兔的体温升高度数。
主要观察指标：急性全身毒性实验、MTT细胞毒性实验、肌肉内植入实验、过敏实验和热原实验结果。
统计学分析：数据由第一作者采用SPSS 11.0 统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验；P < 0.05表示具有统计学意义。

2.1 急性毒性实验结果 3组新西兰兔行腹腔注射后，当时精神萎靡、活动稍迟缓, 未见惊厥、呼吸抑制等不良反应；24 h时各组动物活动良好, 饮食正常，无腹泻；实验期内，3 组动物未发现中毒反应, 未见动物死亡，体质量无明显变化。3 组间比较无明显差别。
2.2 MTT 细胞毒性实验结果见表1。两种洗提液的平均细胞增殖率均大于85%，细胞毒等级1级，不具有细胞毒性，与阴性对照组相比均差异无显著性意义（P > 0.05）。

2.3 肌肉内植入实验结果 RIP和PLGA/RIP植入4 周后, 肉眼观察:周围的肌肉紧密包裹, 肌肉剖面未见明显充血、变性或坏死。RIP完全降解，PLGA/RIP部分降解，呈不规则状，周围有纤维结缔组织包膜形成，纤维、血管等结缔组织长入未完全降解的材料之中，主要细胞成分为纤维母细胞, 此外尚可见少量淋巴细胞和巨噬细胞。苏木精-伊红染色结果显示两种材料周围未见中性粒细胞及多核巨细胞等炎症细胞浸润。见图1。

2.4 过敏实验结果注射洗提液的4只实验组新西兰大白兔在注射1 h后，均出现轻微红斑和轻微水肿，24 h后1只新西兰兔出现红斑和极轻微水肿, 其余3只新西兰大白兔的红斑和水肿基本消退； 48 h后4只新西兰大白兔的红斑和水肿全部消失。阴性对照组的4只新西兰大白兔在注射后1，24和48 h后的过敏情况与注射洗提液的4只新西兰大白兔基本相似。阳性对照组的新西兰大白兔致敏1 h 后, 均出现轻微红斑和轻微水肿，24 h消退。平均原发刺激指数分别为0.38，0.33和0.31，3组间无显著差别。
2.5 热原实验结果新西兰兔在实验前1周内体温平均为38.3~38.6 ℃,注射洗提液后体温变化如表2。测量结果表明, 每种材料测试的3 只新西兰兔中, 体温升高均在0.5 ℃以下,体温升高总度数在1.3 ℃以下, 符合热原实验的评价标准, 提示所制备的复合材料所含热原符合生物体的要求,具有良好的生物相容性。

生物材料必须有良好的生物相容性, 以确保临床应用的安全性[8]。目前, 对生物材料的生物相容性评价方法主要有两类: 血液相容性和组织相容性，前者表示材料与血液之间相互适应的程度,而后者表示材料与除血液之外的其他组织的相互适应程度[9]。PLA和PLGA 具有良好的生物相容性和安全性[10-11]，本文前期实验已验证单纯的RIP具有良好的组织相容性和安全性[12]，但是尚无实验证实PLGA/RIP对人体的毒性[13]。本实验通过体内实验评价PLGA/RIP的组织相容性,通过体外MTT实验来检测其细胞毒性。
全身毒性实验是测试生物材料或其洗提液被机体吸收后产生的中毒反应[14]，本实验中全身急性毒性实验显示材料种植到小鼠及兔子体内后, 动物一般情况良好, 未见动物有任何不良反应，体质量未见明显变化, 初步说明制备的PLGA/RIP无明显毒性和刺激性, 生物相容性良好。
MTT细胞毒性实验是生物材料安全性体外测试的代表，已成为生物材料和医疗器械生物评价体系中最重要的指标之一[15]，是各种受试品进入临床前的必行检测[16]。当浸出液或材料表面有毒性物质释放时, 就会影响细胞的生长[17]。通过动态观察细胞的形态变化和检测细胞数量的增减可准确判定细胞的毒性,受试材料的毒性越大,细胞的抑制就越大[18]。本实验对PLGA/RIP洗提液原液和50%浓度洗提液进行了细胞增殖率测定，所有样品的细胞毒性均在0级，说明样品无细胞毒性，具有很好的细胞相容性。
体内埋植实验是检测生物材料生物相容性必不可少的方法之一[19]，通过体内埋植实验可以直接观察动物机体对材料中的抗原或化学物质产生的免疫应答[20-21]。本实验中肌肉内植入实验结果显示两种材料埋植后局部未见红肿, 伤口愈合良好。植入机体4周后, 材料周围仅见少量的淋巴细胞和巨噬细胞，未见明显炎症细胞浸润, 材料已被纤维囊包裹。实验结果证实PLGA/RIP 基本不存在抗原性, 具有良好的组织相容性。
结论：本实验通过急性毒性实验、MTT细胞毒性实验、肌肉内植入实验、过敏实验及热原实验研究了PLGA/RIP 的生物学性能，证实了PLGA/RIP不引起全身毒性反应，无细胞毒性，未见免疫排斥，不引起过敏反应，无热源性，具有良好的组织相容性和安全性。

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