新型MR特异性对比剂Gd-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒的合成及其肝脏靶向性作用☆

吕国士1，许乙凯2

1解放军第二五一医院影像中心,河北省张家口市 075000；2南方医科大学附属南方医院影像中心，广东省广州市 510515

吕国士☆，男，1970年生，内蒙古自治区集宁市人，汉族，2006年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事CT、MRI诊断的研究。
lament-378@163.
com

通讯作者：许乙凯，博士，教授，博士生导师，南方医科大学附属南方医院影像中心，广东省广州市 510515 yikai@fimmu.com

摘要
目的：选择积聚于特定组织或器官的MRI靶向对比剂是提高MRI诊断准确性、敏感性的有效方法。尝试制备Gd-DTPA聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒（Gd-PBCA-NP）肝脏靶向性对比剂，在动物实验中考察其肝脏靶向强化效果，并探讨其潜在的应用价值。
方法：实验于2004-09/2005-01在南方医院影像中心实验室完成。①采用阴离子乳化聚合法制备Gd-PBCA-NP。②用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布。③采用高频电感耦合等离子发射光谱法（ICP-AES）测定透析液中Gd离子浓度，计算Gd-PBCA-NP的包封率及载药量。④透射电镜观察Gd-PBCA-NP的形态。⑤Gd-PBCA-NP肝脏靶向性实验：选择清洁级Wistar大鼠18只，采用随机数字法分为3组，Gd-DTPA对照组、PBCA-NP组、Gd-PBCA-NP组，每组6只。MRI扫描采用头部线圈，冠状及横断面扫描，平扫后，各组分别于注药后5，15，30 min，1，2 h增强扫描，扫描参数同平扫。计算肝脏各时间点强化率。
结果：①透射电镜观察Gd-PBCA-NP呈类圆形，大小均匀，表面平滑完整，粒子之间无粘连，具有明显的核-壳结构。②Gd-PBCA-NP平均粒径65.7 nm，粒径分布为0.09。③Gd-PBCA-NP平均包封率和载药量分别为81.97%，51.23%。④Gd-DTPA对照组大鼠注射后5，15 min肝实质强化程度平均为35.2%，48.6%，同时可见肾实质也明显强化；注射30 min肝实质信号强度恢复到平扫前水平。Gd-PBCA-NP组注射后5 min，肝实质强化程度平均为3.4%；注射15，30 min，1，2 h肝实质强化程度平均为22.7%，36.1%，56.4%，24.8%。PBCA-NP组肝实质无强化。Gd-PBCA-NP组与Gd-DTPA组、PBCA-NP组肝实质强化方式明显不同。
结论：Gd-PBCA-NP是一种有效的肝实质特异性对比剂，能够靶向强化肝组织，提高了MRI诊断的准确性。
关键词：纳米微粒；磁共振；对比剂；聚氰基丙烯酸正丁酯；生物材料

吕国士，许乙凯.新型MR特异性对比剂Gd-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒的合成及其肝脏靶向性作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):43-46 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-43(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00043-04

Gd-polybutylcyanoacrylate nanoparticle as a novel MR specific contrast agent: Synthesis and target for the liver

AIM:It is selecting MRI targeted contrast agent accumulated on certain tissues or organs that contributes to increase the accuracy and sensitivity of MRI diagnosis. This study prepared polybutylcyanoacrylate nanoparticles (PBCA-NP) loaded with Gd-DTPA as targeted contrast agents, investigated the enhancement for the liver in animal experiment, and debated the potential value of its application.
METHODS: The experiment was finished in the Imaging Center of Nanfang Hospital between September 2004 and January 2005.①Gd-PBCA-NP were prepared by anionic emulsion polymerization.②The size and distribution of Gd-PBCA-NP were measured by Malvern-3000HS laser analyzer.③High-frequency inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry was used to detect Gd ionic concentration in the dialysate, and then the encapsulation efficiency and loading capacity of Gd-PBCA-NP were calculated.④The morphology of Gd-PBCA-NP was examined by transmission electron microscopy.⑤Targeting for the liver by Gd-PBCA-NP: Eighteen clean Wistar rats were divided into 3 groups (n=6) at random: Gd-DTPA control group, PBCA-NP group, Gd-PBCA-NP group. All MRI scanning in the coronal, transverse and plain plates were performed with a head coil. Immediately after contrast medium injection, dynamic enhanced MR images were obtained at 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, and 2 hours using the same imaging parameters as for the plain scanning. Enhancement ratio of liver was calculated in three groups.
RESULTS: ①The morphology of Gd-PBCA-NP was spherical with well-distributed size, intact surface and core-shell structure but without adherence between particles observed by transmission electron microscopy.②The average size of Gd-PBCA-NP was 65.7 nm and the index of size distribution was 0.09.③The average encapsulation efficiency and loading capacity of Gd-PBCA-NP were respectively 81.97% and 51.23%.④After injection of Gd-DTPA, the percentage of enhanced liver parenchyma was 35.2% and 48.6% at 5 and 15 minutes, respectively, and the kidney was obviously enhanced simultaneously; at 30 minutes, the enhancement of liver recovered to normal. After injection of Gd-PBCA-NP, the percentage of enhanced liver parenchyma was 3.4%, 22.7%, 36.1%, 56.4% and 24.8%, respectively. There were significant differences in the enhancement among Gd-PBCA-NP group, Gd-DTPA group and PBCA-NP group.
CONCLUSION: Gd-PBCA-NP is an effective contrast agent targeted for liver, and can be used for the enhanced liver tissues and increase the accuracy of MRI diagnosis.

Lü GS, Xu YK.Gd-polybutylcyanoacrylate nanoparticle as a novel MR specific contrast agent: Synthesis and target for the liver.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):43-46(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-43(ps).pdf]

近年来，纳米靶向给药系统已成为药剂学研究的热点，制备纳米微粒载体的材料一般都是高分子化合物，以合成的可生物降解的聚合物体系（如聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸聚乙醇酸共聚物等）和天然的大分子体系为主（如天然蛋白、明胶、多糖等）,其中聚氰基丙烯酸正丁酯（polybutylcyanoacrylate,PBCA）由于可生物降解及其在外科临床应用中的安全性而成为较有前景的纳米合成材料，大量研究证实其可作为药物、核苷酸的载体，用于疾病的诊断与治疗[1-2]。因此，本实验以PBCA合成材料，尝试制备Gd-DTPA聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒（Gd-PBCA-NP），考察其肝脏靶向强化效果。

设计：随机分组设计、对照动物实验。
单位：解放军第二五一医院影像中心。
材料：实验于2004-09/2005-01在南方医院影像中心实验室（BSL-3，ABSL-3）完成。选择清洁级Wistar大鼠18只，雌雄不拘，体质量（167.5±18.7）g，由南方医院动物中心提供。试剂：Gd-DTPA（广州康臣制药厂）；Dextran-70（美国Sigma公司）；PBCA单体（广州白云医用胶公司）；盐酸、氢氧化钠（广州市试剂公司）。仪器：90-2型定时恒温磁力搅拌器（上海精科实业有限公司）；TG328 A型加码分析天平（上海医用激光仪器厂）；0.45 μm微孔滤膜（德国Satoris公司）；H-600透射电镜（日立）；Zetasizer 3000HS激光粒度分析仪（英国Malvern instruments GB）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
Gd-PBCA-NP的制备方法：参照文后参考文献[3]，采用阴离子乳化聚合法，精密称取一定量Gd-DTPA、Dextran-70，溶于双蒸水中，用0.1 mol/L HCl调节pH 于酸性状态，在磁力搅拌器下缓慢加入一定量PBCA单体，搅拌4 h，然后加入一定量1 mol/L NaOH调节pH于7.0，反应终止，随后用0.45 μm微孔滤膜过滤，将滤液存于4 ℃ 冰箱内备用。
Gd-PBCA-NP粒径及其分布的测定：用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布，测试结果分别给出体均粒径和多分散度。
透视电镜观察Gd-PBCA-NP大体形态：取少量上述混合液放置透析袋（截留Mr1 000 000）内，用体积分数为0.05的葡萄糖溶液透析48 h，每隔8 h换透析液，除去游离Gd-DTPA，Dextran-70及无机离子。纯净Gd-PBCA-NP液体1份，蒸馏水4份稀释后，取1滴放在镀膜铜网上，滤纸吸去多余液体，加入体积分数为0.02的磷钨酸染30 s，干燥后电镜下观察。
Gd-PBCA-NP包封率及载药量的测定：取 5 mL制备的混合液按上述方法透析，透析液总量为2 000 mL。取20 mL透析液（含游离Gd-DTPA）送交广州科学院分析测试中心，采用高频电感耦合等离子发射光谱法（ICP-AES）测定透析液中Gd离子浓度，按下式计算Gd-PBCA-NP的包封率及载药量：包封率=（Ca-Cs）/Ca×100%；载药量=（Ca-Cs）/CPBCA×100%。Ca：母液Gd-DTPA浓度，Cs：透析液Gd-DTPA量 CPBCA：母液PBCA浓度。
Gd-PBCA-NP肝脏靶向性实验：18只大鼠采用随机数字法分为3组：Gd-DTPA对照组（0.1 mmol/kg）、PBCA-NP组（10 mL/kg）、Gd-PBCA-NP组（10 mL/kg），每组6只。大鼠麻醉后，尾静脉穿刺并留置导管作为给药途径。MRI扫描（Siemens Magnetom Vision Plus 1.5 T）采用头部线圈，冠状及横断面扫描，扫描参数为Turbo-SE T1WI（TR/TE=500 ms/15 ms）和T2WI（TR/TE= 2 000 ms/90 ms）。平扫后，各组分别于静脉注射后5，15，30 min，1，2 h增强扫描，扫描参数同平扫。
测量增强前、后3组实验动物各时间点T1WI像上肝脏、肌肉信号强度，测量时尽量避免血管影的干扰。计算肝脏各时间点的信噪比（Signal to noise ratio，SNR）和强化率（Enhanced rate，En%），公式如下：SNR=SIL/SDN；En%=SNRenhanced-SNRunenhanced/ SNRunenhanced×100%。上述公式中SIL代表肝脏的信号强度，SDN代表背景噪声的标准差，SNRunenhanced、SNRenhanced分别代表平扫、增强后各时间点肝脏的SNR。
主要观察指标：Gd-PBCA-NP的形态；Gd-PBCA-NP粒径及其分布；包封率和载药量；Gd-PBCA-NP肝脏靶向性实验结果。

2.1 Gd-PBCA-NP的形态观察按照最佳制
备条件制备的纳米微粒，透射电镜观察Gd-PBCA-NP呈类圆形，大小均匀，表面平滑完整，粒子之间无粘连，具有明显的核-壳结构，即Gd-DTPA被白色聚合物包裹（图1）。

2.2 Gd-PBCA-NP粒径及其分布用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定的Gd-NP平均粒径65.7 nm，粒径分布为0.09（图2）。

2.3 包封率和载药量测定平均包封率为81.97%，平均载药量为51.23%。
2.4 Gd-PBCA-NP肝脏靶向性实验静脉注射Gd-DTPA后5 min，与平扫相比，肝实质强化程度平均为35.2%，同时可见肾实质也明显强化（图3）；15 min，肝实质强化程度平均为48.6%，肌肉为6.3%；30 min，肝实质信号强度恢复到平扫前水平。静注Gd-PBCA-NP后5 min，肝实质强化程度平均为3.4%，15 min，肝实质开始出现强化，肝实质强化程度平均为22.7%；30 min，肝实质信号强度继续上升，其平均强化程度为36.1%；1 h达到高峰，平均为56.4%；2 h信号强度下降，但与平扫相比，肝实质仍强化，平均为24.8%，与Gd-DTPA组、PBCA-NP组明显不同（图4），同时肾盂内可见代谢的对比剂（图5）。静脉注射空白纳米微粒后，肝实质各时间均未见强化。

3.1 Gd-PBCA-NP的形成机制聚氰基丙烯酸烷酯具有在光、热、游离基引发剂、阴离子催化剂存在下聚合的性质，采用一定的方法通过控制其聚合反应速度可制备成纳米微粒。依据聚合反应的原理，聚氰基丙烯酸烷酯纳米微粒制备的方法主要有以下两种方法[4-6]：①乳化聚合法：在搅拌下，将聚氰基丙烯酸烷酯单体缓慢加入到含有药物及非离子表面活性剂（如Pluronic F68，Tween，Polomars，Dextran-70）的酸性水溶液中，氰基丙烯酸烷酯即可在水或催化剂的催化下发生聚合反应而形成纳米微粒，其反应机制是亲核基团OH-与聚氰基丙烯酸烷酯单体反应，导致多个寡单体聚合而形成均一骨架型纳米微粒，药物可吸附于纳米微粒表面或包封其内部。在这种情况下，包被的药物必须满足2个条件：一定的水溶性；在酸性条件下药物稳定，不会解离。DTPA作为一种八齿状螯合物，具有化学性质稳定及高度水溶性的特点，完全满足以上条件。②界面聚合法：将聚氰基丙烯酸烷酯单体和油溶于无水乙醇，缓慢搅拌下注入含非离子表面活性剂的连续水相中，旋转蒸发除去乙醇即可。该法适用于脂溶性药物的包封，所得纳米粒为内含油相的膜壳结构。
3.2 Gd-PBCA-NP的理化性质在MRI成像中，组织或细胞内必须有足够浓度的对比剂聚集来区分正常和病变组织。因此，Gd-PBCA-NP的包封率和载药量是评价MRI对比剂特性较为重要的指标。本实验结果表明其平均包封率和载药量分别为81.97%，51.23%。
纳米微粒为固态胶体颗粒，依据结构的不同，纳米微粒可以分为纳米微囊（nanocapsule）和纳米微球（nanosphere）[7]，纳米微球为骨架型结构，药物可包封在其内部或溶解在其中，如药物吸附在其表面，又称中心核纳米微球（Core-shell nanoshpere）。纳米微囊由聚合物材料构成的外壳及液状核（中心为油或水）组成，活性物质通常溶解在其中。本实验透射电镜观察Gd-PBCA-NP为核-壳结构，Gd-DTPA包封于纳米球内部（不透光，黑色物）。平均直径为65.7 nm，与激光粒度分析仪测定结果相符。
3.3 Gd-PBCA-NP强化原理 Gd-DTPA是目前应用最为广泛的非特异性MR对比剂，进入血液后迅速通过毛细血管床弥散到细胞外间隙。Gd-DTPA-NP与游离Gd-DTPA相比，分子直径显著增加，属于纳米级颗粒，不容易弥散到细胞外间隙，进入体内后主要被富含网状内皮细胞的器官如肝、脾所吞噬。Ghanem等[8]采用乳化聚合法，首次利用聚氰基丙烯酸异丁酯包裹放射性标记的111In，99Tcm-DTPA合成了放射性物质标记的纳米微粒，结果表明，纳米微粒的放射性标记率大于80%，在体内动物实验中60%～75%的放射性物质浓聚于肝、脾器官。另外，Shikata等[9]利用另外一种纳米合成材料（壳聚糖）包裹Gd-DTPA制成壳聚糖纳米微粒，其直径为（426±28）nm，并在体外实验中与不同类型细胞（L929 fibroblast cells，B16F10 melanoma cells，SCC-VII squamous cell carcinoma）孵育，结果表明含Gd-DTPA壳聚糖纳米微粒细胞吞噬量较游离Gd-DTPA高100～200倍。本实验结果表明， Gd-PBCA-NP进入血液循环15 min后，肝实质信号强度开始升高，1 h后仍维持较高水平，2 h后肝脏信号强度开始下降，并且在肾盂内可见排泄的Gd-DTPA，而PBCA-NP组肝实质始终无强化，说明Gd-PBCA-NP具有非常理想的缓释特点，能够靶向肝脏成像。
3.4 Gd-PBCA-NP潜在应用价值 ①网状内皮细胞对比剂：与经典网状内皮阴性对比剂SPIO相类似，静脉注后，PBCA纳米微粒进入体内主要被富含网状内皮细胞的肝脾器官所吞噬，利用这一特性，包被对比剂的PBCA纳米微粒可以用于肝脾疾病诊断和鉴别诊断，另外，皮下或组织间隙给药后，纳米微粒随淋巴引流至区域淋巴结，因此可用来淋巴管成像和鉴别良恶性淋巴结[10-11]。②组织或细胞靶向性对比剂：PBCA纳米微粒可进行亲水性表面修饰（如聚乙二醇），可以避免或减少网状内皮系统的吞噬，如在这种长循环纳米微粒表面再装载细胞特异性标志物（如肿瘤或炎症标志物），可靶向于特定组织或细胞成像[12-13]。

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