静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维的细胞相容性****★

王培伟1，陈宗刚1，王红声1，何创龙1，莫秀梅1，2

课题背景：课题研究方向为生物材料用于组织工程支架的制备；支架材料的细胞毒性及安全性评价；利用支架、种子细胞和生长因子三要素，研究体外组织构建的规律，并最终体内再建缺损组织；利用静电纺丝技术，制备具有仿生天然细胞外基质的纳米结构的组织工程支架。

术语解析：静电纺丝是一种使带电荷的聚合物溶液或熔体在静电场中射流来制备聚合物超细纤维的加工方法。由于静电纺丝技术制得的纤维的直径可达纳米级，因此电纺丝纤维应用广泛。以此技术制备的纳米纤维支架，具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，在组织再生与修复领域具有相当广阔的应用前景。

同行评价：应用静电纺丝法制备具有生物学性能的纳米纤维支架，是目前国内外相关领域的研究热门之一。实验围绕壳聚糖／胶原蛋白支架材料对细胞相容性影响做了全面的分析和评价，具有实际应用价值。

东华大学，1化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程实验室，2纤维材料改性国家重点实验室，上海市 201620

王培伟★，男，1982年生，山东省东平人，汉族，东华大学化学化工与生物工程学院在读硕士，主要从事生物和组织工程研究。
wangpeiwei@
yahoo.cn

通讯作者：莫秀梅1,2，东华大学，1化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程实验室，2纤维材料改性国家重点实验室，上海市 201620 xmm@dhu.edu.cn

国家自然科学基金资助项目（30570503）*；2005上海市浦江人才计划（05PJ14013）*；上海市2005年重大基础研究课题（05DJ14006）*；高等学校学科创新引智计划(又称“111计划”，b07024)*

摘要
目的：静电纺是一种使带电荷的聚合物溶液或熔体在静电场中射流来制备聚合物纳米级纤维的加工方法，采用此种技术制备壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维，并观察其细胞相容性。
方法：实验于2006-11/2007-10在东华大学化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程实验室完成。①支架材料制备：以六氟异丙醇/三氟乙酸为溶剂体系，采用静电纺制备复合纳米纤维，其中壳聚糖/胶原蛋白的质量比分别为100∶0，80∶20，50∶50，20∶80与0∶100。②细胞相容性观察：体外接种猪髋动脉内皮细胞，苏木精-伊红染色法观察细胞形态，MTT法检测细胞黏附和增殖情况。
结果：猪髋动脉内皮细胞在壳聚糖/胶原蛋白复合纤维表面贴附牢固，外形饱满，多呈长梭形，具有良好的生长形态；MTT法结果显示纳米纤维能够有效地促进内皮细胞在材料表面的黏附和增殖，质量比为20∶80材料组细胞黏附、增殖能力最强，其次为50∶50组。
结论：静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维具有良好的细胞相容性，可望成为一种新型的组织工程支架材料。
关键词：静电纺丝；壳聚糖；胶原蛋白；纳米纤维；细胞相容性

王培伟，陈宗刚，王红声，何创龙，莫秀梅.静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维的细胞相容性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(1):5-9 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-5(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)01-00005-05

AIM:Electrospunning is a process that the charged polymer solution or melt jet efflux in the electrostatic field to prepare the polymer nanofibers. This study aimed to prepare electrospun chitosan/collagen composite nanofibers and evaluate their cell biocompatibility.
METHODS: The experiment was carried out in the Laboratory of Biomaterials and Tissue Engineering, College of Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology at Donghua University between November 2006 and October 2007.①Taking hexafluoroisopropanol/trifluoroacetic acid as solvent, the composite nanofibers were prepared by electrospunning according to the mass ratio of chitosan/collagen as 100:0, 80:20, 50:50, 20:80 and 0:100.②The composite nanofibers were inoculated with porcine iliac artery endothelial cells in vitro. The cell adhesion and proliferation as well as cell morphologies were evaluated by MTT method and HE stain, respectively.
RESULTS: The porcine iliac artery endothelial cells adhered tightly on surface of electrospun chitosan/collagen composite nanofibers, exhibited plump and fusiform shape, as well as good growth. MTT results showed that nanofibers could obviously enhance the adhesion and proliferation of endothelial cells on the surface of materials, and the cells had the best spreading and attachment on the composite nanofibers with a ratio of 20:80, then 50:50.
CONCLUSION: The electrospun chitosan/collagen composite nanofibers hold great potential for tissue engineering application due to their good cell biocompatibility.

Wang PW, Chen ZG, Wang HS, He CL, Mo XM.Cell biocompatibility of electrospun chitosan/collagen composite nanofibers.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(1):5-9(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-1/1k-5(ps).pdf]

如何构建具有仿生天然细胞外基质(ECM)结构和功能的组织工程支架材料，从而为种子细胞提供良好的生长、增殖和功能表达环境，一直是组织工程及再生医学研究的热点。静电纺丝技术最早由Formhals 等[1-3]在1934 年实现。区别于传统纺丝，静电纺是一种使带电荷的聚合物溶液或熔体在静电场中射流来制备聚合物纳米级纤维的加工方法。以此技术制备的纳米纤维支架，具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，相对于传统技术制备的材料支架能够更好地模拟天然细胞外基质的结构特点，为种子细胞的生长提供良好的微环境，在组织再生与修复领域具有相当广阔的应用前景[4-5]。
壳聚糖是一种结构与细胞外基质中的主要成分糖胺聚糖(GAGs)十分类似的优良天然生物材料，也是现今所发现的惟一具有明显碱性、带有正电荷的天然多糖。壳聚糖成膜性好，机械强度高，具有良好的生物可降解性、生物相容性以及可利用的活性基团，使其在组织工程中得到广泛的应用[6-7]。由于单纯的壳聚糖亲水性较差、降解速率慢等原因，需要对其改性或与其他材料复合来加以改善。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，具有低抗原性、可被人体吸收、体内降解产物无毒副作用的优点，在作为生物材料方面的应用受到广泛关注[8-9]。然而作为一种天然高分子，其机械性能不佳，特别是在水溶液中的降解速度太快，从而限制了它的应用。因此，采用静电纺丝技术将壳聚糖与胶原蛋白共混，将两者的优势结合起来以实现性能互补，在结构和功能上仿生细胞外基质。有关壳聚糖/胶原蛋白复合材料作为生物细胞外基质的潜在用途已经为许多研究工作者所认识[10-12]。本实验通过静电纺丝技术制备壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维，体外接种猪髋动脉内皮细胞(PIECs)，对支架材料的细胞相容性进行初步研究，探讨了其在组织工程支架材料领域应用的潜力。

设计：对比观察。
单位：东华大学化学化工与生物工程学院。
材料：实验于2006-11/2007-10在东华大学化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程实验室完成。猪髋动脉内皮细胞（PIECs），由中国科学院细胞库提供。
主要仪器与材料：壳聚糖，粘均分子质量Mη≈106，脱乙酰度85%，济南海得贝海洋生物工程有限公司；Ⅰ型胶原蛋白，相对分子质量为（0.8~1.0）×105，四川铭让生物科技有限公司；六氟异丙醇，英国Fluorochem Ltd.；三氟乙酸、25%戊二醛水溶液、乙醇、二甲亚砜，国药集团；DMEM细胞培养基、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清，杭州吉诺生物医药技术有限公司；MTT试剂，美国Sigma；苏木精-伊红染色试剂盒，海门市碧云天生物技术研究所；血细胞计数板，上海求精生化试剂仪器有限公司；MK3酶标仪、二氧化碳培养箱，美国热电集团；倒置荧光显微镜，奥林巴斯公司；S-2700型扫描电镜，日立公司。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第三和第五作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维与支架预处理：参考文后参考文献[13]报道的方法，以六氟异丙醇/三氟乙酸为混合溶剂，配制质量分数为0.06的壳聚糖和质量分数为0.08的胶原蛋白溶液，制备壳聚糖∶胶原蛋白质量比依次为100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100的混合溶液。电纺过程中采用钝口22G医用针头，溶液置于2.5 mL医用注射器中，控制电压为20 kV、接收装置距离为12 cm、供液速率为0.8 mL/h，制备壳聚糖/胶原蛋白复合纤维。制备好的支架材料在室温下经25%戊二醛蒸气交联12 h后真空充分干燥。支架材料置于24孔细胞培养板里，体积分数为0.75的乙醇浸泡4 h，换PBS浸泡4 h，PBS冲洗3遍，每孔滴加100 μL DMEM细胞培养基（以刚覆盖材料为宜），于37 ℃ 二氧化碳培养箱烘干备用。
SEM观察：将支架材料使用导电胶固定在样品台上，表面喷金后在扫描电镜下观察，采用图像分析软件Image J 测定电镜照片中的纤维直径分布范围。
细胞培养与接种：猪髋动脉内皮细胞（PIECs）用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、含体积分数为0.05的CO2培养箱中常规方法培养，每24 h更换培养液，分离传代备用。2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，离心、悬浮、血细胞计数板计数，将细胞悬浮液接种至24孔细胞培养板的壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维上，继续培养。
细胞形态学观察：苏木精-伊红染色法观察支架材料细胞形态。具体步骤，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，蒸馏水洗涤2 min，换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 min。苏木精染色5 min，浸入自来水中冲洗去多余的染色液，约10 min。蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)，体积分数为0.95的乙醇5 s。伊红染色液染色30 s，体积分数为0.7的乙醇洗涤2次，显微镜下观察。
MTT法检测细胞黏附与增殖：将单层培养细胞分别以6×108 L-1和 7×107 L-1的密度接种于24孔细胞培养板的支架材料上，通过MTT法检测PIECs在壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维上的黏附与增殖情况。每孔200 μL细胞悬浮液，再加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基200 μL于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。分别于时间点为2，4，8 h以及1，2，3 d检测细胞黏附和细胞增殖情况。在每个时间点将培养液小心吸出，PBS洗3遍，为防止血清影响，换用400 μL新鲜无血清培养基，加入MTT40 μL（5 g/L）继续培养4 h，弃上清，每孔加入400 μL二甲基亚砜，振荡10 min，在492 nm波长下用酶标仪测定各孔的A值。以细胞培养板作为对照组，每实验组支架材料设3复孔，并重复实验3次。
主要观察指标：壳聚糖/胶原蛋白复合支架材料微观形貌，苏木精-伊红染色细胞形态，内皮细胞在支架材料上的黏附与增殖情况。
统计学分析: 采用OriginPro 7.5软件（美国OriginLab公司），数据以_x±s表示，应用ANOVA分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 SEM观察结果见图 1。SEM图片显示，含不同质量比的壳聚糖/胶原蛋白共混纺丝溶液都可以得到较好的静电纺纤维，纤维呈现相互连通的三维网络状结构；纤维的直径大小与分布范围有些差异，随着壳聚糖含量的增加，纤维直径呈略微的下降趋势。这可能是因为三氟乙酸易与壳聚糖的氨基形成有机盐，随着混合体系中壳聚糖的增加，有机盐的含量增加导致溶液体系中电荷密度增加，也导致静电纺溶液射流的拉伸强度增加所致。
2.2 壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维上细胞形态观察倒置荧光显微镜可以比较清晰地观察壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维上内皮细胞形态（见图2）。苏木精-伊红染色时，壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维上的细胞密集区细胞核呈椭圆形，染淡蓝色，胞质染淡红色；密集区边缘和稀疏区的梭形细胞胞核着色深，呈紫蓝色，胞质粉红色。PIECs在静电纺壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维表面贴附牢固，外形饱满，具有良好的生长形态。细胞与纤维之间、细胞与细胞之间均有较多突起相互交连。

2.3 细胞黏附情况壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维上内皮细胞的黏附情况见图3。图3结果表明共培养2，4和8 h后，MTT检测细胞黏附情况随时间没有明显变化；在各检测时间点，壳聚糖/胶原蛋白质量比为20∶80材料组细胞黏附与细胞培养板相比无显著性差异，其A值大于其他不同质量比的壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维组。

2.4 细胞增殖情况共培养1，2和3 d后，静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维不同质量比各组与作为对照组的细胞培养板的吸光度A值都随共培养时间的增加而增大，3 d﹥2 d﹥1 d；在各检测时间点，对照组的A值均大于静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维不同质量比各组；在不同质量比各组中，20∶80材料组A值高于其他4组，相比较于吸光度最低的纯胶原蛋白组，差异有显著性意义（P < 0.05）。

在评价材料细胞相容性时通常采用体外细胞培养方法，将细胞种植在材料中观察细胞的黏附和生长情况并测定细胞的代谢功能[14]。文献报道多应用MTT法检测细胞的黏附和增殖功能。细胞在材料表面的黏附和铺展及细胞在材料表面的分裂和增殖，是评价生物材料性能的两个重要方面[15-17]。其实质上是材料与细胞相互作用的过程，一方面，细胞通过分泌如蛋白、胶原、多糖类等细胞外基质的手段改善材料表面的生物活性，另一方面，材料表面的理化性质能够作用于细胞微环境而影响其在材料上的贴壁生长[18]。一般说来，细胞的代谢状态、细胞与材料的接触时间、细胞的亲疏水性、细胞的表面电荷、细胞膜分子的侧向运动、细胞膜的柔韧性等可影响细胞在材料表面的黏附。由于细胞真正接触的是材料的表面，因此材料的表面性质对材料的细胞相容性有主要影响。材料表面的电荷性质与电荷密度对细胞生长有重要影响，材料表面的化学结构也有重要影响，引入胺基、酰胺基、羟基、羧基、磺酸基等基团有利于细胞的黏附和生长。材料的形态结构也有重要影响，多孔结构也有利于细胞黏附与生长，因为多孔结构有利于营养物质的渗透，有利于细胞的正常代谢。
众所周知，静电纺丝工艺现在是制备生物支架材料的最有效方法之一，静电纺纤维具有独特的微观结构和适当的力学性能，能够很好地模拟天然细胞外基质
的结构。本实验采用静电纺制备出壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维，由于分子间交互作用实现性能互补。混合体系中壳聚糖分子链上存在大量质子化的氨基，使之具有很强的吸附作用，容易与含两性基团的胶原蛋白分子产生分子间的静电吸引作用，形成聚电解质配合物网络；同时壳聚糖分子链上的羟基和氨基也与胶原蛋白分子中的羰基和氨基产生氢键作用，使混合体系中同时存在同种分子之间与异种分子之间的静电引力与氢键力。胶原纤维束由于壳聚糖分子的竞争吸引，侧向聚集变得松散，甚至解聚。网络结构的网孔变大，孔隙间由壳聚糖分子填充，随壳聚糖比例的增加这种结构上的改变更加明显，这是复合纤维性能优于单组分纤维的基础。壳聚糖荷正电，而大部分细胞表面存在一定的荷负电的位点，静电吸引使壳聚糖对细胞有固定作用。单一壳聚糖荷大量正电荷，对细胞增殖有一定影响。混合体系中壳聚糖与胶原异种分子之间的静电作用中和了部分电荷，使壳聚糖的吸附能力有一定程度的降低，既有利于细胞的黏附生长，又有利于细胞的迁移，保证了细胞的增殖能力。另一方面，壳聚糖分子链刚性较好，填充入胶原的网孔中可使复合纤维的力学性能得以改善。
本实验采用静电纺制备壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维，体外接种PIECs，苏木精-伊红染色法观察PIECs在复合纤维表面贴附牢固，外形饱满，多呈长梭形，具有良好的生长形态。说明制备的纳米纤维能够有效地促进内皮细胞在材料表面的黏附和增殖，质量比为20∶80材料组细胞黏附高于其他材料组，与细胞培养板相比无显著性差异。共培养1，2，3 d后MTT法检测细胞增殖结果显示，PIECs在壳聚糖/胶原蛋白质量比为20∶80组活性最高，增殖能力最强，其次为50∶50组。
综上所述，静电纺壳聚糖/胶原蛋白复合纳米纤维具有良好的细胞相容性，可望成为一种新型的组织工程支架材料。