重要的概念:关节软骨缺损的修复是近年组织工程涉及到软骨和软骨下骨的双重修复，众多研究者从支架设计和种子细胞选择方面都进行了研究，重点在于选择合适的细胞载体解决长期修复缺损时的双层明显分层及断裂的难题，选择合适的种子细胞来匹配双层不同组织结构的需求问题。

应用要点：实验采用单个整体层状修复体模拟正常的关节软骨结构，修复体的上层可以接种软骨细胞，下层可接种成骨细胞；或整体接种骨髓间充质干细胞然后使其再分别诱导分化为软骨细胞和成骨细胞，在体外或体内共培养形成组织工程骨软骨复合物，以达到修复关节软骨的目的。

偏倚或不足：实验中发现修复体表面细胞数明显多于内部细胞数，原因可能是修复体表面的氧气和营养比内部更充足，使细胞有一种向外贴附生长的倾向性，此情况可望经过微重力旋转仪培养或灌注培养来解决。

1南方医科大学珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282；2南方医科大学临床解剖研究所，广东省组织工程构建与检测重点实验室，广东省广州市 510515；3华南理工大学材料科学和工程学院，广东省广州市 510640

朱书涛★，男，1980年生，河南省项城市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事骨和软骨组织工程研究。
zsthw@126.com

通讯作者：朱立新，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，南方医科大学珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282
zhulixin1966@
163.com

广东省科技计划项目基金资助
2003C34002*﹚

摘要
目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。
方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行。①实验方法：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm；体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3 周，经检测诱导成功后，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周。②观察指标：通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响。
结果：①骨髓间充质干细胞经成骨诱导，检测碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，证实诱导成功。②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好，经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24 h后,顺孔隙迁徙至支架内部，倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔壁贴附良好。③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定，能分泌细胞外基质，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。　
结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好，为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。
关键词：胶原；壳聚糖；磷酸三钙；关节软骨；细胞相容性；组织工程；生物材料

朱书涛，朱立新，余磊，严乐平，于巧莲，黄锐，张世浩，王九限胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1815-1818
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1815(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)10-01815-04

收稿日期：2007-12-28
修回日期：2008-02-26 (07-50-12-7246/N·Y)

In vitro culture of bone mesenchymal stem cells on the layered collagen-chitosan-beta-tricalcium phosphate composite scaffold

Abstract

AIM:To evaluate the feasibility of the layered cylindric collagen-chitosan-β-tricalcium phosphate composite as a scaffold for the articular cartilage tissue engineering after an observation of how it absorbs the induced bone mesenchymal stem cells and affects the cell biological behaviors.
METHODS: The experiment was carried out in the Key Laboratory of Tissue Construction and Detection of Guangdong Province from September 2007 to March 2008.①The collagen-chitosan-β-tricalcium phosphate composite was prepared in a pore diameter of 100 μm and porosity ≥ 90%. Rabbit bone mesenchymal stem cells were cultured and induced in vitro, then the cells were seeded onto the porous collagen-chitosan-β-tricalcium phosphate composite scaffold and were cultured in a three-dimensional environment for 4 weeks.②The effects of the composite scaffold on the phenotype, proliferation, and function of osteoblasts were observed by the inverted phase contrast microscopy, histology, scanning electron microscopy, and immunohistochemistry.
RESULTS: ①The induced bone mesenchymal stem cells were positive for both alkaline phosphatase stain and calcification tubercles stain, which all indicated successful induction.②Due to good hydrophilicity of collagen-chitosan-β-tricalcium phosphate composite scaffold, the induced bone mesenchymal stem cells adhered to the surface of the scaffold by the inverted phase contrast microscopy and scanning electron microscopy, then cells migrated into the scaffold 24 hours later.③The results of histology and immunohistochemistry revealed that osteoblasts proliferated on the composite scaffold, maintained a rounded morphology and could secrete the extracellular matrix. The immunohistochemistry stain of collagen Ⅰ was positive.
CONCLUSION: The layered cylindric collagen-chitosan-β-tricalcium phosphate composite scaffold has a good compatibility with the induced bone mesenchymal stem cells, and it will provide experimental evidences for the further study of article cartilage repair.

Zhu ST, Zhu LX, Yu L, Yan LP, Yu QL, Huang R, Zhang SH, Wang JX. In vitro culture of bone mesenchymal stem cells on the layered collagen-chitosan-beta-tricalcium phosphate composite scaffold.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1815-1818 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1815(ps).pdf]

0 引言

组织工程方法为修复关节软骨缺损提供了新的方法和途径，但从众多组织工程研究结果来看，虽然研究者们应用了多种生物材料、种子细胞和修复方法，但修复的长期效果不令人满意，存在着组织工程软骨难以和宿主正常软骨整合的问题，软骨和软骨下骨的断裂分层问题，支架材料植入后的力学强度难题[1-4]。本实验希望通过将软骨组织工程中应用广泛的胶原、壳聚糖与β-磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）有机复合，模仿体内关节软骨的分层结构，增加支架材料的力学强度，构建层状梯度复合材料。并将扩增的经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)植入其中体外培养，观察成骨细胞在胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体中的黏附、增殖、生长情况及生物学性状变化, 以评价该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性。

1 材料和方法

设计：以细胞和支架材料为实验对象，以自身对照验证实验。
单位：南方医科大学珠江医院骨科中心，南方医科大学临床解剖研究所，广东省组织工程构建与检测重点实验室，华南理工大学材料科学和工程学院。
材料：实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室（千级）进行。DMEM/F12、D-Hank＇s、胰蛋白酶、EDTA (Sigma公司，美国)；胎牛血清（杭州四季青公司）；地塞米松、抗坏血酸、β－甘油磷酸钠、碱性磷酸酶染色试剂盒（广州威佳科技有限公司）；Ⅰ型胶原抗体、SABC试剂盒（武汉博士德公司）；CO2培养箱（Heraers Hera cell，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体由华南理工大学材料学院制作提供，直径7 mm，高8 mm，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm左右。2周龄新西兰大白兔1只，体质量0.5 kg。
设计、实施、评估者：设计、实施为第一、二、四作者，实施为全部作者。
技术路线：
兔BMSCs体外原代培养：10%水合氯醛静脉注射麻醉新西兰兔, 无菌条件下取四肢骨，在超净台内剔去附着的肌肉和筋膜，剪开各关节端，用注射器反复冲洗骨两端，悬液经200目金属滤网滤过并移至离心管内，1 000 r/min离心 10 min，沉淀加入DMEM/F12充分吹打成细胞悬液。细胞计数板计数，锥虫蓝拒染检测细胞活性。
体外诱导培养：将细胞按4×105/cm2接种于培养瓶，加入4 mL DMEM/ F12 完全培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清,青霉素100 U/mL, 链霉素100 U/mL) ，置于体积分数为0.05的CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱内培养，隔日换液，倒置显微镜下观察细胞的生长情况，当细胞融合成片时进行传代。选生长状态良好的 3代细胞加入诱导成骨条件培养液（含体积分数为0.1的胎牛血清、50 mg/L 抗坏血酸, 1×10-8 mol/L 地塞米松, 10-3 mol/L β-甘油磷酸钠），诱导2周行碱性磷酸酶检测，3周后进行钙结节染色，以未诱导细胞作为对照组。
修复体预处理：胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体经环氧乙烷消毒备用，实验前取12个置于12孔培养板, D-Hank＇s洗3遍，20 min/次， 再用DMEM/F12 液浸泡过夜。
细胞和支架复合培养：将诱导3周的细胞消化离心，用DMEM/F-12完全培养基配制浓度为 5×1010 L-1，每个预湿的复合支架中滴加300 μL，将培养板放入培养箱内30 min，然后每孔加入1.0 mL DMEM/F-12诱导培养基继续培养。隔日换液，7 d后2.5%戊二醛固定，系列脱水，乙酸异丙酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。培养4周后，脱钙、石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色。
主要观察指标：①BMSCs生长状态。②诱导成骨后细胞的碱性磷酸酶和钙结节染色。③细胞和支架复合后光镜下及扫描电镜观察。④细胞和支架的组织学和免疫组织化学检测。

2 结果

2.1 BMSCs形态 体外单层培养的BMSCs刚接种时呈球形，悬浮在培养液中，24 h后开始贴壁，细胞呈长梭形，少量多角形，约1周后细胞铺满培养瓶瓶壁,可进行传代，见图1。在加入诱导液后细胞生长相对缓慢，其形态发生了改变，细胞逐渐增大，细胞逐渐汇合呈铺路石样分布，符合成骨细胞形态。进而出现重叠生长，其间可见圆形或卵圆形的钙化结节，结节周围细胞呈放射状分布。

2.2 诱导成骨后细胞形态 碱性磷酸酶染色显示诱导的细胞胞浆内出现紫红色物质，阳性率80%左右，对照组细胞胞浆内无紫红色物质出现。见图2a。钙结节染色细胞间出现黑色沉淀，呈颗粒状或大块状，细胞环绕周围，对照组则无黑色沉淀，见图2b。

2.3 成骨细胞/支架镜下观察 细胞悬液滴加于经预湿处理的复合支架材料上，支架材料迅速膨胀，证明细胞扩散到支架内，接种24 h后, 倒置显微镜下见材料不透明, 无法观察其内细胞生长情况, 但可见大量细胞贴附在材料旁孔壁，见图3。

2.4 成骨细胞/支架扫描电镜观察结果 培养7 d 后, 细胞成团地吸附于支架表面及孔隙侧壁, 并可见细胞间通过突起相互连接, 或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上；从复合支架材料中间切开，见其内部有少量细胞贴附于孔隙侧壁，见图4。

2.5 成骨细胞/支架苏木精-伊红染色和免疫组化结果
培养4 周后，材料表面可见大量细胞黏附成层状，内部亦可见细胞聚集成团，细胞呈长梭形, 细胞团中有基质分泌，沉积于细胞周围，见图5a；Ⅰ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应，见图5b。

3 讨论

BMSCs在特定培养条件下可向骨、软骨、神经胶质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和网状细胞等间叶组织细胞转化[5-7]。本实验中，用成骨细胞诱导液培养的BMSCs呈成纤维细胞集落方式生长，易于贴壁，分裂增殖速度快，各代细胞生长情况稳定，短时间内能够大量扩增，是良好的种子细胞来源。
胶原和壳聚糖与细胞外基质的结构相似，具有良好的生物相容性，均适合作为组织和器官再生的细胞模板材料[8-9]。但胶原存在加工性能差、缺乏柔韧性、抗拉强度低、降解过快等缺点，壳聚糖的细胞亲和力不够理想，单独用作基质材料都难以达到理想的要求。而胶原的纤维强度和降解速度可通过与其他材料组合而得以控制[10]；壳聚糖可通过改性或与其他材料复合来改善对细胞的黏附与增殖[11]。将胶原与壳聚糖复合，使得制备的壳聚糖复合支架上分布有大量的胶原纤维丝构成的网，很容易黏附细胞生长，复合使支架对细胞的亲和力得到了改善。而且，复合时壳聚糖的游离氨基还可以和胶原的羟基之间发生交联反应，使支架的强度提高，同时，壳聚糖带正电荷，胶原带负电荷，两者可自然地通过静电相互作用，胶原的降解也因此得到延缓[12]。SHI De-hai等[13]用冷冻干燥法制备Ⅱ型胶原和壳聚糖复合材料，通过新西兰兔体内种植及结合软骨细胞体外培养，结果显示该复合材料具有较好的力学性能和生物相容性。
临床上软骨缺损常伴有软骨下骨损伤，使其正常结构受到破坏,导致软骨力学性能的改变,最终使修复组织早期愈合率降低并出现退变。因此，在修复软骨缺损的同时需修复软骨下骨，将骨与软骨组织工程结合起来，构建骨软骨双层支架，或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨具有更现实的意义[14]。将生物降解陶瓷材料β-TCP引入支架，利用其较强的力学性能，可以有效解决以上难题。
β-TCP主要成分与人骨的无机成分相似，具有骨诱导作用和良好的生物相容性；其轻度溶解所形成的高钙离子层及微碱性环境，可有效促进成骨细胞的黏附、增殖及分泌基质。β-TCP/胶原复合物是骨组织工程较为理想的支架材料之一，并且因其具有骨诱导性，具有比常规支架材料更优越的成骨能力[15]。BMP-2 是目前研究较为成熟的骨诱导促进因子，单一材料如β-TCP 或胶原在用于骨质再生时，一般需要生物调节因子的参与，才可达到良好的诱导成骨效果[16-17]，而这种复合物可以不需要生物调节因子参与。Vicente 等[18]的实验发现β-TCP/胶原复合物的吸收更完全，虽然成骨能力与β-TCP 相当，但吸收速度却更快。
基于以上认识，作者首次构建了模拟体内关节软骨分层结构的胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体，修复体上层的胶原与壳聚糖均有良好的生物相容性以及生物活性, 将会有效地促进软骨细胞的黏附与增殖；下层复合了高生物活性无机粉体β-TCP，该粉体具有良好的骨传导功能，并能诱导成骨细胞转化为骨细胞，形成骨组织和软骨下骨紧密结合，对软骨下骨的修复起到承上启下的作用，为软骨提供良好的力学环境，更好的起到原位修复的效果。
体外实验结果显示胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体亲水性良好；具有三维多孔立体结构，有可塑性，能被加工成所需的形状；扫描电镜结果显示修复体上层以胶原/壳聚糖为主，下层以胶原/壳聚糖/ β-TCP为主，层与层之间没有明显界面，连成一个整体，平均孔径为100 μm，孔隙率≥90%，达到了关节软骨组织工程所需的载体条件。经诱导成功的成骨细胞接种后，细胞不仅能在其中黏附和生长，分泌Ⅰ型胶原，且能从表层伸出多个伪足样突起，紧密贴附于材料表面，沿材料的孔隙迁徙到内部生长，说明修复体具有良好的生物相容性和细胞亲和性。组织学及免疫组织化学检测表明细胞可以在其中保持其正常功能和稳定的表型表达，为进一步的组织修复提供了实验依据。但实验中也发现修复体表面细胞数比明显多于内部细胞数，这种现象和其他研究结果相似，原因是修复体表面的氧气和营养比内部更充足，使细胞有一种向外贴附生长的倾向性，此情况可望经过微重力旋转仪培养或灌注培养来解决。此外，该材料对软骨细胞的生物学性状的影响，单个分层材料结合软骨细胞和成骨细胞的接种培养技术，在体内降解情况及修复关节软骨缺损效果尚需进行进一步的实验研究。
综上所述, 胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体模拟了正常关节软骨分层结构,体外实验证实能促进经诱导的BMSCs在材料表面黏附，并维持了细胞正常形态和功能,为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。

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