静压力对碱性成纤维生长因子-聚乳酸-羟基乙酸缓释微球降解的影响★

李萍1，段宏2，邹远文1

课题背景：四川大学生物力学实验室在国家自然科学基金项目(29970747)的资助下,完成了bFGF微球制备过程的优化以及相关的细胞实验和动物实验。在此基础上,国家自然科学基金项目(30100190)资助本实验室体外模拟膝关节的压力环境,考察微球在静压力下降解的情况。

应用要点：近年来由于聚乳酸类高分子聚合物良好的生物相容性,其作为缓释药物载体的研究越来越受到重视,可以利用此类材料的降解特性和化学构成特点,制备可控制的,靶向性治疗的缓释微球。当药物缓释微球应用于膝关节这样的关节腔时,必然考虑关节腔内压力对微球降解的影响。

偏倚或不足：本实验设计压力装置,在实验过程中压力值保持恒定不变。而实际膝关节内的压力,随着人体姿势的不同和屈膝角度的不同发生很大的变化。因而,可以在接下来的工作中设计人工膝关节,将bFGF-PLGA缓释微球注入其中,考察在人工膝关节模拟人体膝关节运动过程中的降解情况,可以更加全面的考察膝关节内部的物理因素(包括应力因素)对药物微球的影响。

1四川大学建筑与环境学院生物力学研究所，四川省成都市 610041； 2四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610031

李萍★，女，1981年生，山东省新泰市人，汉族，四川大学在读硕士，主要从事生物医学信息与仪器的研究。
lipingscu@yahoo.
com.cn

通讯作者：邹远文，博士，副教授，四川大学建筑与环境学院生物力学研究所，四川省成都市 610041

摘要
目的：体外模拟膝关节腔的静压力环境,观察静压力是否对碱性成纤维生长因子-聚乳酸-羟基乙酸(bFGF-PLGA)缓释微球的降解规律产生影响。
方法：实验于2006-06/2007-05在四川大学生物力学实验室完成。①实验材料：采用复乳法制作bFGF-PLGA缓释微球，冷冻离心，干燥后保存备用。自行研制压力加载装置，分别可以提供0.065 MPa和5.0 MPa的大气压力，保压效果良好。②实验方法：将微球分为0.065 MPa实验组，5.0 MPa实验组和常压对照组进行实验。37 ℃恒温下，以磷酸盐缓冲液作为缓释微球降解和释药介质，分析静压力对bFGF-PLGA缓释微球降解规律的影响。
结果：①0.065 MPa和5.0 MPa实验组, bFGF-PLGA缓释微球未发生突然性的变形破裂，微球表面光滑，球形良好。②0.065 MPa实验组与常压对照组体外聚合物重均分子质下降和质量丧失趋势一致。③5.0 MPa实验组与常压对照组相比，聚合物重均分子质量下降、质量丧失均加快。
结论：静压力对bFGF-PLGA缓释微球体外降解的各项指标产生较大影响,以5.0 MPa的静压力下效果最明显。bFGF-PLGA缓释微球在临床上直接用于膝关节腔给药时,必须考虑关节腔压力值的影响。
关键词：静压力；缓释微球；降解；碱性成纤维细胞生长因子；聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物；生物材料

李萍，段宏，邹远文.静压力对碱性成纤维生长因子-聚乳酸-羟基乙酸缓释微球降解的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1819-1822 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1819(ps).pdf]

Effect of static pressure on degradation of basic fibroblast growth factor-polylactic-co-glycolic acid controlled release microspheres

AIM:To simulate static pressure environment of knee joint cavity in vitro, observe the effect of static pressure on the degradation of basic fibroblast growth factor-polylactic-co-glycolic acid (bFGF-PLGA) controlled release microsphere (MS).
METHODS: The experiment was performed at the biomechanics laboratory, Sichuan University from June 2006 to May 2007.①The bFGF-PLGA MS was prepared by double emulsion method, then frozen, centrifuged, and dried for using. The self-made compressive instruments was used to maintain the static pressure of 0.065 MPa and 5.0 MPa, separately.②MS were divided into 0.065 MPa experimental group, 5.0 MPa experimental group and normal pressure (control) group. At the constant temperature of 37 ℃, phosphate buffer solution was used as the medium of degradation and release, then the effect of static pressure on the degradation of bFGF-PLGA MS was analyzed.
RESULTS: ①Under static pressure of 0.065 MPa and 5.0 MPa, the sudden rupture of MS was not found, with even and smooth surface of MS.②Under the pressure of 0.065 MPa, the trend of molecular weight (Mw) loss and quality loss of the polymer was consistent with the control group in vitro.③Compared with the control group, the rate of Mw loss and quality loss were obviously quicker under the pressure of 5.0 MPa.
CONCLUSION: Static pressure has a conspicuous influence on the indicators of degradation in vitro of bFGF-PLGA controlled release MS, especially at the pressure of 5.0 MPa. Once bFGF-PLGA MS is injected into the knee joint cavity, the pressure of joint cavity should be considered cautiously.

Li P, Duan H, Zou YW.Effect of static pressure on degradation characteristics of basic fibroblast growth factor-polylactic-co-glycolic acid controlled release microspheres.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1819-1822(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1819(ps).pdf]

关节软骨损伤是临床骨科常见的一类创伤，病损的组织中缺乏未分化的软骨细胞，自身修复能力较差[1-2]。因此，应用外源性生长因子促进软骨缺损的修复是一个重要的研究方向[3]。研究表明，碱性成纤维细胞生长因子可以有效促进软骨等多种创伤组织再生及功能修复[4-5]。聚乳酸-羟基乙酸在体内最终转化为水和二氧化碳,具有良好的生物相容性[6]。微球的降解速度不仅与其相对分子质量及其微观结构、形态及结晶度等材料本身性质密切相关,还受化学、生化和物理因素影响[7-8]。物理因素主要是指外在应力环境[9]。目前,静压力下药物缓释微球的降解情况的研究很少,但是,实验证明应力因素可以加快聚乳酸泡沫衬垫降解的速度[10]。膝关节是人体最复杂的关节,其内部的静压力值受多种因素的影响:无外伤的正常膝关节内,最高压力值达到0.065 MPa[11];膝关节损伤术后(如关节韧带重建手术)的膝关节中,压力值会有不同程度的增加,最高可以达到4.8~5.3 MPa[12]。本实验选取 0.065 MPa和5.0 MPa作为典型压力值,施加在碱性成纤维生长因子-聚乳酸-羟基乙酸（bFGF－PLGA）药物缓释微球上,观察不同静压力状态下聚乳酸药物载体的降解情况,从而为体内该药物微球的降解机制和行为研究及将来该类药物微球用于临床的研发提供依据。

设计：对比观察。
单位：四川大学生物力学研究所。
材料：实验于2006-06/2007-05在四川大学生物力学实验室完成。bFGF冻干粉（暨南大学医药生物技术研究开发中心），聚乳酸－羟基乙酸共聚物（PLGA，50∶50，Mr 20 000,中国科学院成都有机化学研究所）, span80以及其他试剂均为分析纯, pHs-25型酸度计（上海雷磁仪器厂）, Sartorious1721型电子天平（德国）,79-HW1型恒温磁力搅拌器（浙江乐成电器厂）,AMRAY电子扫描显微镜（美国）, 凝胶渗透色谱仪150CALC/ GPC（Waters）等。
设计、实施、评估者：设计为第一作者,实施为全部作者,评估为第四作者。
方法：
降解实验：37 ℃恒定室温下进行，观察微球在常压、0.065 MPa和5.0 MPa 3种不同静压力下的降解差异,各组样本数均为3。具体过程如下：①准确称取360 mg的bFGF-PLGA微球加入已经编号的降解管中（分为3组，分别编号为1a~24a、1b~24b、1c~24c，每个样品组做3次平行降解实验）。②每个降解管中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH值为7.4），1a~24a常压下静置，1b~24b置入气压为0.065 MPa的低压装置，1c~24c置入气压为5.0 MPa的高压装置中。③此后每隔5 d定时取样，每次3组，每组3管，至第8次取样完毕为止，取样后在低速离心机上分离上清液和固体样本。将冻干后的样本溶于四氢呋喃,用凝胶渗透色谱仪测定其分子质量，重均分子质量校正物质采用聚苯乙烯。
主要观察指标:①降解过程中微球表面形态的变化情况。②聚合物重均分子质量的变化情况。③样品失重率。④降解介质的pH变化情况。
统计学方法: 由第一作者采用SPSS 12.0进行数据处理,数据以_x±s表示,两组均数间的比较采用配对t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。

2.1 微球表面形态变化由图1中可以看出：在降解前,微球的球形好,大多数微球表面光滑无孔。5.0 MPa高压下未见微球变形破碎,最早出现形态变化,降解10 d后,微球表面出现凹陷和小的孔洞;降解25 d后,微球表面的孔洞增多,微球各个部分逐渐溶蚀;降解40 d后,微球表面出现贯穿孔,球形基本消失。0.065 MPa实验组的微球形态变化与5.0 MPa组相似,只是同时期的降解程度较轻。由图2中可以看出:在常压下降解到第25天时,微球表面才出现数量不多的孔洞;降解至第40天时,微球表面的孔洞显著增多,球形变差。
2.2 PLGA聚合物重均分子质量变化由图3中可以看出:随着降解的进行,重均分子质量不断降低。降解过程明显的分为两个阶段:第一阶段聚合物重均分子质量的降低较为缓慢,第二阶段下降明显加速。其中, 0.065 MPa实验组与常压组质重均分子量变化趋势一致(配对t检验，P > 0.05),到实验末下降了65%。5.0 MPa实验组聚合物重均分子质量下降速度比其他两组快,在降解的第二阶段更加明显,到实验末期, 重均分子质量降低了大约78%。

2.3 样品失重率图4可以看出,随着降解时间的延长,微球的质量越来越小,失重率逐渐增加。其原因可以归结如下: 最初阶段微球的失重，可归因于较低分子质量的聚合物在降解介质中的溶解；随后阶段微球的失重，可归因于大量较高分子质量的聚合物水解为低聚物。降解40 d后,5.0 MPa实验组药物微球的失重率为60.78%,大于0.065 MPa实验组(49.61%)和常压对照组(46.57%)。

2.4 降解介质pH值的变化图5可以看出,随着降解时间的延长,pH值不断的降低。前20 d,pH的降低比较缓慢,这主要因为低聚物溶解和高聚物降解为低聚物时形成的酸性环境;后20 d,pH的降低速度加快,主要是因为,随着降解的进行,产生大量的低聚物,乳酸以及一些酸性小分子。

成人关节软骨缺少血运,损伤后依靠自身修复能力较差[13]。在诸多生长因子中,碱性成纤维细胞因子是一种具有广泛生物活性的肽类生长因子[14],对于软骨细胞既是丝裂原又是形态发生因子,具有强大的促进细胞分裂增殖的作用[15]。Fujisato等[16]研究发现软骨细胞与经过碱性成纤维细胞因子处理后的胶原海绵支架复合后,软骨细胞的再生速度明显加快。Kotev-Emeth等[17]用地塞米松和碱性成纤维细胞因子共同处理成骨细胞,发现成骨细胞数量明显增多,且细胞表型特征明显。因此, 碱性成纤维细胞因子对软骨组织的修复有着重要的生理功能。
但是, 碱性成纤维细胞因子在体内的半衰期很短,难以长期在创伤局部形成有效的药物浓度。因此,有学者开始研究碱性成纤维细胞因子微球等缓释制剂 [18]。通过筛选,最后选择聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体材料。聚乳酸-羟基乙酸共聚物是FDA批准的可以应用于人体的合成高分子材料。因其具有低毒性,良好的生物相容性,可生物降解性等优点成为理想的微球制备材料[17]。
通常认为, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物在用作微球的基质材料时，其降解包括两个阶段。在第一阶段（降解过程）主要是酯键的断裂，产生低聚物和单体，多聚物的分子质量呈总体下降,而微球的质量下降并不明显；第二阶段（侵蚀过程）中，由于酸性代谢产物的自身催化作用，酯键的断裂将加速并导致微球质量的下降[18]。本实验结果表明,3组的体外降解模式均呈两相型。降解初期，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子质量减小较慢，质量和形态变化相对滞后，降解介质的pH值变化不明显，此时降解主要是大分子链的断裂，降解产物的分子质量仍较大且不能溶于磷酸盐缓冲液。当降解到一定程度时，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子质量降低的速度加快，质量和形态发生显著变化，降解介质的pH值开始下降，降解过程自动加速，材料很快溶蚀，直到微球的形态基本消失。所以说,不同大小的静压力虽然会影响微球降解的速率，但不会造成其水解机制的改变。同时,可以看出,5.0 MPa的静压力可以加快聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解，特别在第二阶段，其聚合物分子质量、质量和pH值的下降均常压组和0.065 MPa组明显加快。这可能从以下两个方面解释：①静压力对材料施加各向应力使得材料发生形变，产生应变能。外在的应变能虽不足以破坏共价键，但能促进分子链运动。②静压力能使聚合物发生构象的变化，引起分子重排和分子链段的移动，即转化为化学键能，降低了水解障碍。当分子链运动时，水分子能更容易进入无定形聚合物，增加与材料发生反应的速率和机会, 从而加速PLGA水分吸收和水化降解。这结果讨论与樊瑜波等[10]研究结论一致。
本实验比较了相同温度、液体环境、采样周期和样本数的情况下,不同的静压力对bFGF-PLGA药物缓释微球降解的影响,可以看出静压力对该微球体外降解的各项指标均产生较大影响,以5.0 MPa的静压力下效果最明显。由此可知, bFGF-PLGA药物缓释微球在注射入膝关节后不仅受到局部液体环境影响,还将受到周围静压力环境影响。聚乳酸载体材料在设计和选择时必须考虑膝关节内的压力环境,这对生物医用材料的制备及其临床应用具有重要的参考价值。

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