壳多糖与外源性碱性成纤维细胞生长因子联合应用修复创面愈合的评估

仇树林，冯敏，张培培，赵伟，朱昊

课题背景：碱性成纤维细胞生长因子能诱导微血管的形成、增殖、分化，促进毛细血管内皮细胞及血管周围的细胞增殖，从而加速创面愈合。壳多糖在抗菌、消炎、降血糖、止血以及抗肿瘤等方面都发挥着生物活性作用。两者促进创面愈合作用机制存在互补性，为两者的联合应用提供了依据。

创新要点：实验应用利用基因重组技术制备的外源性成纤维细胞生长因子，其结构和生物学活性与人体内源性成纤维细胞生长因子高度一致。尝试将其与壳多糖联合应用，增加了其与创面接触的时间和面积，使其处于缓释状态，更有助于促进创面愈合。

相关链接：碱性成纤维细胞生长因子可促进各种组织损伤尤其是难愈合创面和大面积烧伤创面的修复。壳多糖对多种细菌的生长具有抑制作用。已有研究表明壳多糖可使表皮生长因子处于缓释状态，使其最大限度的发挥功效，协同促进伤口愈合。但如何更好地发挥碱性成纤维细胞生长因子的药理作用，还有待于进一步的深入研究。

仇树林，男，1952年生，河北省石家庄市人，汉族，1976年河北医科大学毕业，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事烧伤整形外科的研究。
qiushulin8229@
sina.com

通讯作者：冯敏，硕士，河北省人民医院整形外科，河北省石家庄市 050051

摘要
目的：壳多糖具有抗菌消炎和收敛作用。碱性成纤维细胞生长因子具有促进血管生成、促进神经生长等功能，是创伤愈合和上皮形成的重要调节物。实验联合应用壳多糖和碱性成纤维细胞生长因子，观察其对创面愈合的影响。
方法：实验于2006-04/2007-01在河北省人民医院实验室及河北医科大学第四附属医院实验室完成。实验室标准均为生物安全二级(BSL-2)。①实验材料：48只雄性健康Wistar大鼠由河北医科大学实验动物中心提供，体质量200~250 g，清洁级，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：以切割法制备大鼠创伤模型，造成全层皮肤创面。将48只Wistar大鼠随机分为对照组、壳多糖组、生长因子组、壳多糖+生长因子组,并分别给予蒸馏水、100 g/L壳多糖、1 000 IU/mL碱性成纤维细胞生长因子、100 g/L壳多糖+1 000 IU/mL碱性成纤维细胞生长因子药液治疗，每组12只。③实验评估：以创面愈合时间和速率、新生毛细血管、炎症细胞和细胞渗出的变化以及血管内皮生长因子在创面组织中的表达来评价修复效果。
结果： 48只大鼠全部进入结果分析。①壳多糖+生长因子组创面愈合时间最快（P < 0.01）。②与其他3组比较，壳多糖+生长因子组第3天有较多毛细血管生成，第14天成纤维细胞排列整齐。③壳多糖+生长因子组血管内皮生长因子表达在术后第10天达到最高峰，至伤后第14天仍保持高水平，且明显高于其他3组（P < 0.01）。
结论：壳多糖+碱性成纤维细胞生长因子促进伤口愈合，缩短愈合过程，提高愈合质量，两者联合应用可更大限度发挥各自功效。
关键词：创伤愈合；动物创伤模型；壳多糖；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子

仇树林，冯敏，张培培，赵伟，朱昊.壳多糖与外源性碱性成纤维细胞生长因子联合应用修复创面愈合的评估 [J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1823-1826 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1823(ps).pdf]

AIM:Chitosan can resiste bacteria, and eliminate inflammation and astriction. Basic fibroblast growth factor (bFGF) can promote angiogenesis and accelerate nerve growth, which has been recognized as an important modifier in the process of wound healing and epithelization. This study observed the effects of chitosan mixed with bFGF on wound healing.
METHODS: The experiment was performed in the Clinical Medical Research Center of Hebei Provincial People's Hospital and the Fourth Hospital of Hebei Medical University between April 2006 and January 2007. Both laboratories were of Class Ⅱ Biosafety. ①Forty-eight healthy male adult Wistar rats of clean grade and 200-250 g were provided by the Experimental Animal Center of Hebei Medical University. Treatment of animals was accroded with Animal Ethics standards.②Rat full-thickness dermal wounds model was set up by cutting method. Forty-eight Wistar rats were randomly divided into control group, chitosan group, bFGF group, and chitosan + bFGF group (n =12), and treated with distilled water, 100 g/L chitosan, 1 000 IU/mL bFGF, and 100 g/L chitosan + 1 000 IU/mL bFGF, respectively. ③The wound healing time and rate, the changes in new capillary vessel, inflammatory cells and cell infiltration, and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) were used to evaluate the repair effects.
RESULTS: All 48 rats were involved in the result analysis. ①The healing rate of chitosan + bFGF group was the fastest (P < 0.01). ②chitosan +bFGF group showed more angiogenesis at the 3rd day compared with the others, and the fibroblasts arranged orderly at the 14th day. ③The expression of VEGF in chitosan +bFGF group achieved peak on day 10 and maintained a high level until day 14, which was obviously higher than the others (P < 0.01).
CONCLUSION: Chitosan and bFGF can promote and accelerate wound healing, and enhance the qualities of wound healing. The combination of chitosan and bFGF can maximize each efficiency.

Qiu SL, Feng M, Zhang PP, Zhao W, Zhu H.Influence of chitosan and basic fibroblast growth factor on wound healing.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1823-1826(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1823(ps).pdf]

20世纪80年代以来，由于基因工程技术的发展，使人们可以从体外获取多种生长因子并用于体表创面修复研究，其中碱性成纤维细胞生长因子最受关注、研究最深入且极具有临床应用前景。

设计：随机对照动物实验。
单位：河北省人民医院整形外科。
材料：实验于2006-04/2007-01在河北省人民医院实验室及河北医科大学第四附属医院实验室完成。实验室标准均为生物安全二级(BSL-2)。48只雄性健康Wistar大鼠，体质量200~250 g，由河北医科大学实验动物中心提供（动物（饲料）许可证号SCXK－(冀)2003-1-003）。实验前1周购入，单笼饲养，自由饮水与摄食，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。壳多糖（平均分子质量10 000），由武汉大学环境资源研究所提供。
设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第二作者，评估为第二、三作者。
方法：
实验分组及模型制备：将大鼠随机分为4组：对照组、壳多糖组、生长因子组、壳多糖+生长因子组，每组12只。在麻醉条件下（10%水合氯醛30 mg/kg），8%硫化钠背部脱毛备皮,面积为4 cm×5 cm。次日，麻醉成功后，将大鼠固定于手术台上。在背部脊柱两侧旁开0.9 cm，头尾两端平行于脊柱各标记一直径1.8 cm，面积2.54 cm2的圆形切口线。经消毒铺巾后，用手术刀沿标记线切除全层皮肤至深筋膜，形成4个圆形创面。
给药方法：壳多糖组为用蒸馏水100 mL将10 g壳多糖稀释成100 g/L，生长因子组稀释成1 000 IU/mL。壳多糖+生长因子组为将壳多糖10 g加入已配好的100 mL碱性成纤维细胞生长因子药液内，该药液内壳多糖浓度为100 g/L，碱性成纤维细胞生长因子浓度为1 000 IU/mL。4组分别用蒸馏水、壳多糖、碱性成纤维细胞生长因子、壳多糖+碱性成纤维细胞生长因子药液浸透双层纱布覆盖创面，再盖以凡士林油砂，无菌纱布包扎，绷带固定，每日换药1次。
每组动物分为4组，每组3只，分别于术后第3，7，10，14天用0.25 cm×0.25 cm的透明方格纸测定伤口面积,用德国产ASM-68K半自动图像分析仪计算伤口面积。伤口愈合速率=愈合面积/原伤口面积×100%。并切取原创伤范围内组织，经4%多聚甲醛固定后苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色。
主要观察指标：各组创面肉芽组织生长以及血管内皮生长因子表达情况。
统计学方法：实验数据以_x±s表示，由第一作者应用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，行两样本均数t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.1 实验动物数量分析 48只大鼠均进入结果分析。
2.2 创面愈合时间及愈合率以创面面积小于总面积的5%或愈合面积大于95%为完全愈合。创面愈合时间统计结果显示：对照组、壳多糖组、生长因子组和壳多糖+生长因子组分别为（15.28±0.641 9），（14.02±0.481 7），（12.50±0.624 5），（10.24±0.482 7） d。4组差异非常显著（F =74.23，P < 0.01）。壳多糖+生长因子组愈合天数明显短于壳多糖组、生长因子组和对照组（P < 0.01）。
创面愈合率统计结果，见表1。

壳多糖+生长因子组创面愈合率高于生长因子组、壳多糖组以及对照组，4组有差异显著（F =410.36，P < 0.05），两两比较差异非常显著（P < 0.01）；愈合率随时间推移明显升高（F =637.86，P < 0.01），4个时间点两两比较差异非常显著（P < 0.01）。组别与时间交互效效应有显著性差异（F =44.54，P < 0.05）。
2.3 苏木精-伊红染色光镜组织学观察壳多糖组成纤维细胞排列比较整齐，炎细胞浸润，毛细血管少见。对照组毛细血管数量减少，成纤维细胞增多，炎症细胞少。基底细胞增生，鳞状上皮覆盖，已基本愈合，见图1。生长因子组可见较多排列整齐的分泌型成纤维细胞，炎症细胞分布其间。毛细血管官腔阻塞，见图2。创伤后第3天，壳多糖+生长因子组有大量毛细血管生成，血管内皮细胞肥大，炎症细胞浸润较少。生长因子组和壳多糖组新生毛细血管生成较多，成纤维细胞数量较多，局部有炎症细胞聚集。对照组有新生毛细血管形成，幼稚肉芽组织增生，各种细胞均无明显增生。创伤后第7天，壳多糖+生长因子组有较多炎症细胞浸润，成纤维细胞数量多，毛细血管成分多。碱性成纤维细胞生长因子组成纤维细胞及炎症细胞数量进一步增多，生长活跃，毛细血管数量减少。壳多糖组表皮下可见大量肉芽组织增生，成纤维细胞及炎症细胞均比较多，毛细血管减少。对照组明显水肿及炎细胞浸润，有大量成纤维细胞，血管增生活跃。创伤后第10~14天，壳多糖+生长因子组新生毛细血管及炎症细胞数量减少，成熟的成纤维细胞增多，排列整齐，红染的基质成分均匀，见图3。

伤后4组大血管和新生毛细血管的内皮细胞均有阳性表达。图像定量分析显示，见表2，壳多糖+生长因子组和生长因子组在伤后第10天达到最高，至伤后第14天仍保持较高水平。对照组持续性增高。而壳多糖组在第7天达到高峰，之后缓慢下降。4组差异非常显著（F =1 217.35，P < 0.01），壳多糖+生长因子组明显高于其他3组（P < 0.01）；伤后3，7，10，14天之间，两两比较均有显著性差异（P < 0.05）；组别与时间之间交互效应有统计学意义（F =48.12，P < 0.05）。

生长因子参与了生物的胚胎发生、生长发育以及组织修复等诸多病理生理过程，在创伤修复中亦起着十分重要的作用[1-3]，其中碱性成纤维细胞生长因子作为创伤修复的重要生长因子得到了国内外相关学科的高度重视[4-6]。壳多糖也称甲壳胺，广泛存在于低等植物如菌类、藻类细胞，甲壳动物如虾、蟹、昆虫等的外壳以及高等植物的细胞壁中，是除纤维素外又一大类重要的多糖，具有抗菌消炎和收敛作用[7]。
3.1 碱性成纤维细胞生长因子与壳多糖在促进创伤修复方面具有不同的特征与规律实验表明在不同组织修复阶段其作用存在差异。碱性成纤维细胞生长因子在伤后中、后期诱导肉芽组织增生方面作用最强，效果最明显[8-10]，而壳多糖则在修复早期发挥抗菌、消炎、减少创面渗出作用，可使创面保持清洁，这一作用可为碱性成纤维细胞生长因子在创面修复的中、后期肉芽组织生长以及再上皮化等过程奠定了基础，对及早封闭创面，防止创面感染以及减少瘢痕形成等方面有重要影响[11-13]。
3.2 碱性成纤维细胞生长因子与壳多糖的生物学特性与作用机制碱性成纤维细胞生长因子是广泛存在于人体组织的一种微量活性蛋白。在室温下非常不稳定，直接应用于创面后创面的蛋白酶可对其产生降解作用，使其丧失生物活性[14]。壳多糖通过以下机制促进伤口愈合：壳多糖通过蛋白酶作用而释放N-乙酰葡糖胺（NAG），由NAG促进伤口愈合；壳多糖的主要成分葡糖胺烯糖对愈合中肉芽组织中的胶原结构形成和强度获得有着重要作用，能提供一个有利于胶原形成的环境；壳多糖对成纤维细胞的抑制作用[15]。碱性成纤维细胞生长因子对创面的作用机制：促进毛细血管内皮细胞及血管周围的细胞增殖，诱导微血管的形成、增殖、分化;能刺激成纤维细胞增殖、分化和合成新的细胞外基质，使胶原含量增高；刺激成纤维细胞、内皮细胞分泌胶原酶、纤维酶原激活酶分解胶原，通过胶原纤维的合成与分解使胶原含量在新生血管结缔组织中达到相对平衡[16-19]。

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