课题背景：基因治疗的重要目标是获得遗传物质在转导细胞中的持久整合及稳定的表达，因此载体的选择是关键问题。由于传统病毒载体和非病毒载体的各种不足，因此，越来越多的人把目光转向了新型载体的开发和应用，自纳米技术产生以后，用纳米颗粒作为基因转移载体，已引起医学界的广泛重视。

应用要点：实验发现聚酰胺较脂质体的粒径小、zeta电位高，具有较高的转染效率，对负载的基因有缓慢释放的效应，并能通过survivin反义寡核苷酸更有效地下调survivin基因的表达，诱导人脐血管内皮细胞凋亡增加。因此，利用聚酰胺作为Survivin-反义寡核苷酸转染载体作用人脐血管内皮细胞可获得良好的疗效。

同行评价：文章以新型的纳米材料聚酰胺树形分子高聚合物为载体，递送survivin反义寡核苷酸，观察其特性、转染活性及其转染survivin-反义寡核苷酸对人脐血管内皮细胞的体外诱导凋亡作用。国内外均有用该种载体传递不同基因的类似文献，但尚未见用该种载体进行survivin反义寡核苷酸基因治疗的文献，因此，文章具有较好的创新性和学术意义。

1镇江市第三人民医院普外科，江苏省镇江市 212003；2上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室，上海市 200030

姚 航☆，男， 1966年生，江苏省镇江市人，汉族，副主任医师，2007年解放军第一军医大学（现南方医科大学）毕业，博士，主要从事纳米材料在基因治疗中的应用研究。
yaohang84@
yahoo.com.cn

镇江市科技计划基金资助项目（SH2006045）*

摘要
目的：观察聚酰胺树形分子高聚合物作为survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，asODN）传递系统的可行性以及对人脐血管内皮细胞的survivin表达、细胞生长的影响。
方法：实验于2005-05/2006-03在上海交通大学微纳米科学技术研究院微纳制造技术国家重点实验室完成。①将200 μg/L surviving-asODN和3.66 μg/L 聚酰胺制备聚酰胺反义基因复合物，同时制备阳离子脂质体反义基因复合物作为对照。②透射电镜观察复合物的形态、粒径，zeta电位分析仪测定复合物的zeta电位，离心法和紫外分光分度仪测定复合物的包封率、载药率和体外DNA释放速度。③将上述两种基因载体复合物转染人脐血管内皮细胞，测定其转染效率；Western blotting检测转染后细胞中survivin蛋白的表达；流式细胞术检测两组细胞的凋亡率。
结果：①成功制备聚酰胺反义基因载体系统聚酰胺-survivin-asODN。该复合物的粒径小于脂质体-survivin-asODN复合物 (P < 0.01)，但zeta电位高于后者（P < 0.05）；两者基因载药率、包封率无显著差异（P > 0.05）；聚酰胺对DNA持续释放14 d，但脂质体只持续5 d。②聚酰胺-survivin-asODN 转染人脐血管内皮细胞的效果强于脂质体-survivin-asODN（P < 0.05），转染后人脐血管内皮细胞siurvivin蛋白的表达低于脂质体复合物（P < 0.05），该细胞的凋亡率高于脂质体复合物（P < 0.05）。
结论：聚酰胺能将Survivin-asODN高效递送到人脐血管内皮细胞，降低survivin蛋白的表达并诱导血管内皮细胞凋亡。
关键词：聚酰胺树枝状高聚合物；反义寡核苷酸；血管内皮细胞；Survivin；生物材料

姚航，岳燧岩 ，金跃明，潘碧峰，高峰，崔大祥.聚酰胺树形分子高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸诱导血管内皮细胞凋亡[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1827-1830
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1827(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)10-01827-04

收稿日期：2007-12-04 修回日期：2008-02-15 (07-50-12-6738/N·Y)

Survivin antisense oligonucleotide mediated by polyamidoamine dendrimer induces apoptosis of vascular endothelial cells

Abstract

AIM:To investigate the possibility of polyamidoamine (PAMAM) dendrimer as survivin antisense oligonucleotide (ASODN) delivery system and explore the effects of PAMAM dendrimer-survivin ASODN on the survivin expression and the growth of human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs).
METHODS: The experiment was carried out in the National Key Laboratory of Nano/Micro Fabrication Technology, Research Institute of Micro/nanometer Science & Technology, Shanghai Jiao Tong University from May 2005 to March 2006.①PAMAM anti-sense gene transfection complex was generated by mixing 3.66 μg/L PAMAM dendrimer and 200 μg/L survivin ASODN, while the liposome anti-sense gene transfection complex was manufactured as controls.②The shape and size of the complex were observed by transmission electron microscope, and the zeta potential was measured by analytical tool. The encapsulating efficiency, DNA loading level, and release progress in vitro of the compound were determined by ultraviolet spectrophotometer in centrifuging method.③The transfection efficiency of survivin-ASODN in HUVECs was measured. The protein expression of survivin was measured by Western blotting analysis, and the apoptosis rate of HUVECs was assessed by flow cytometry.
RESULTS: ①The PAMAM-survivin-ASODN complex was successfully prepared and its diameter was less than that of liposome-survivin-ASODN complex (P < 0.01), but the zeta potential was higher than that of liposome-survivin-ASODN complex (P < 0.05). There was no significant difference between two groups for envelopment ratio and loaded rate (P > 0.05). The PAMAM released for 14 days and the liposome only for 5 days.②The transfection efficiency for PAMAM-survivin-ASODN was higher than that for liposome-survivin-ASODN (P < 0.05). The expression of survivin protein for PAMAM-survivin-ASODN was less than that for liposome-survivin-ASODN (P < 0.05), and the cell apoptosis rate was higher than that for liposome-survivin-ASODN (P < 0.05).
CONCLUSION: The PAMAM dendrimer can delivery survivin-ASODN into HUVECs effectively, reduce the expression of survivin and induce HUVEC apoptosis.

Yao H, Yue SY, Jin YM, Pan BF, Gao F, Cui DX.Survivin antisense oligonucleotide mediated by polyamidoamine dendrimer induces apoptosis of vascular endothelial cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1827-1830(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1827(ps).pdf]

0 引言

传统的病毒载体转基因效率高，但具有免疫原性和细胞毒性，而非病毒载体的转染效率低[1-2]，因此，寻找新的载体是基因治疗得以进一步发展的关键。近年来纳米载体已被视为突破基因转移瓶颈最有前途的技术之一[3]。纳米载体无免疫原性和细胞毒性，具有很高的基因转移效率，可浓缩、保护和缓释所载基因，在体内可生物降解[4-8]。聚酰胺树形分子高聚合物为放射状球形纳米级大分子，转染效率比其他阳离子载体的基因高，而且细胞毒性低[10-11]，具有潜在的应用价值[9]。本实验以聚酰胺为载体，递送survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，asODN），观察聚酰胺的特性、转染活性及其转染survivin-asODN对人脐血管内皮细胞的体外诱导凋亡作用。

1 材料和方法

设计：随机分组设计，对照实验。
单位：镇江市第三人民医院普外科，上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室。
对象：实验于2005-05/2006-03在上海交通大学微纳米科学技术研究院微纳制造技术国家重点实验室完成。
细胞与试剂：人脐血管内皮细胞株购自中科院上海细胞所，转染试剂脂质体LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），兔抗人survivin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），碘化丙啶（美国Sigma公司），Western blotting试剂盒（博士德公司）。Survivin-asODN由上海生工公司合成，序列为：5＇-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3＇，每端5个磷酸碱基采用硫代修饰，5'端以FAM标记，聚酰胺树形分子由上海交通大学微纳米研究院生物纳米工程研究室提供。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施和评估为全部作者，均接受过正规培训。
技术路线：
转染复合物的制备：根据预试验摸索出最佳条件，取Survivin-asODN加入不含血清的RPMI1640培养液中，配成200 μg/L的A溶液，混匀后置室温下孵育10 min；然后取等量无血清培养基，分别加入聚酰胺和脂质体，分别配成质量浓度为3.66 mg/L和1.83 mg/L的B液，将等量A溶液和B溶液混匀，得到聚酰胺-survivin-asODN和脂质 体-survivin-asODN转染复合物。
转染复合物的形态、粒径与zeta电位测定：取少量聚酰胺-survivin-asODN和脂质体-survivin-asODN转染复合物混悬液滴加在覆盖碳膜的铜网上，干燥后用2%磷钨酸负染2 min，于透射电子显微镜（H-300，日本HITACHI公司）下观察纳米粒形态并拍照。再取纳米粒混悬液适量，加双蒸水稀释后用动态激光散射仪（BI-MWA，美国BIC公司），测定各转染复合物的粒径，重复测定6次，用zeta电位分析仪（Delsa 440SX，美国 Beckman Coulter公司）测定zeta电位，重复6次。
复合物包封率测定：取脂质体-survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN转染复合物，4 ℃，23 000 r/min离心，吸取上清液，用紫外分光光度计于260 nm处测定吸光度，按1OD=33 mg/L计算溶液中DNA浓度，推算游离DNA 的含量，按下式计算包封率，包封率=(总DNA量－游离DNA量)/总DNA量×100%。
复合物载药率测定：取脂质体-survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN转染复合物各10 mg，加入三氯甲烷充分溶解后，再加入TE缓冲液，振荡混匀1 min，静置分层后，吸取上清液测吸光度，推测出DNA含量，方法同上。
转染复合物体外基因释放测定：取脂质体- survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN转染复合物各20 mg，2周内每24 h取样0.5 mL，再补加新鲜的PBS缓冲液0.5 mL，将取出样品15 000 r/min×3 min离心，测定上清液中DNA含量，算出释放百分率。
细胞基因转染及转染效率测定：将人脐血管内皮细胞按3×104/孔分别接种于6孔细胞培养板中，设置脂质体组和聚酰胺组，分别加入脂质体-survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN转染复合物200 μL。37 ℃，体积
分数为0.05的CO2中继续培养24 h后，倒置荧光显微镜定时观察细胞。48 h后收集细胞用冷PBS洗涤2次，制成单细胞悬液上流式细胞仪检测细胞染色率α和细胞内平均荧光强度X，计算细胞内荧光总强度N（N=α×X），
每份标本分析10 000个细胞，实验重复5次。
western bloting检测细胞转染后survivin蛋白的表达：将脂质体-survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN转染复合物分别转染人脐血管内皮细胞24 h，空白对照组加入血清培养基替代转染复合物，48 h后收集5×106个细胞，提取细胞胞浆蛋白，行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后加入1抗兔抗人survivin和2抗羊抗兔IgG/HRP并显色，凝胶图像分析仪分析图像。
流式细胞仪检测细胞转染后的凋亡率：分别以脂质体-survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN转染复合物处理人脐血管内皮细胞细胞24 h，空白对照组加入血清培养基，继续培养48 h，收集5×105个细胞制备单细胞悬液，加入体积分数为0.7的乙醇/PBS 0 ℃固定，检测前以PBS重悬并洗涤细胞，加入RNA酶I 37℃孵育1 h和碘化丙啶4℃染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
主要观察指标：①转染复合物的形态、粒径与zeta电位。②复合物包封率和载药率。③转染复合物体外基因释放、基因转染及转染效率。④人脐血管内皮细胞细胞转染基因后survivin蛋白表达和细胞凋亡率的变化。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件包进行数据处理，数据以_x±s表示，行t检验及单因素方差分析(组间多重比较应用LSD法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 转染复合物的形态 透射电镜观察脂质体-survivin-asODN和聚酰胺-survivin-asODN复合物呈圆形或类圆形颗粒，见图1。

2.2 转染复合物的粒径、zeta电位包封率和载药率 见表1。
2.3 转染复合物体外释放基因特征 脂质体-survivin-asODN复合物24~48 h内有爆破释放，然后迅速，6 d时已检测不到DNA释放；聚酰胺- survivin-asODN复合物24~48 h内有爆破释放，然后缓慢下降，平稳持续14 d以上，表明聚酰胺对DNA具有缓释现象。见图2。

2.4 细胞转染及其转染效率 转染24 h后，荧光显微镜下观察两组细胞内均可见绿色荧光，聚酰胺转染的细胞内绿色荧光点与脂质体转染的细胞内绿色荧光点特征完全一致，见图3。随着细胞培养时间增加，发射绿色荧光的细胞数增加、强度增强，48 h可获得最高转染效率，流式细胞仪检测细胞内荧光强度，脂质体组低于聚酰胺组（44.78±9.15，62.90±9.49，P < 0.05）。

2.5 Survivin-asODN对人脐血管内皮细胞survivin蛋白表达的影响 脂质体组和聚酰胺组survivin蛋白表达低于空白对照组（35.72±7.97，23.58±6.13，73.22±7.86，P < 0.01）；聚酰胺组低于脂质体组（P < 0.05）。见图4。

2.6 Survivin-asODN对人脐血管内皮细胞凋亡率的影响 脂质体组和聚酰胺组细胞凋亡率高于空白对照组[(43.36±11.52)%，（60.06±11.43）%，（5.72±2.16）%，P < 0.01]；聚酰胺组细胞凋亡率高于脂质体组（P < 0.05）。

3 讨论

载体的选择是基因治疗的关键之一，聚酰胺-树形分子高聚合物是一种新型纳米材料，其树枝状结构可DNA分子形成复合物，然后再通过复合物表面的阳离子与细胞膜上带有负电荷的糖蛋白及磷脂相互作用，以胞吞方式进入细胞质[12-13]。本实验发现聚酰胺能有效地将survivin-asODN转运到靶细胞，在细胞内有标记survivin-asODN的绿色荧光出现。
体内外实验表明，聚酰胺比其他阳离子载体转染的效率高[14-15]。DNA纳米复合物的粒径和zeta电位是影响细胞摄入的两个重要因素，粒径小的纳米复合物更有利于进入细胞[16-17]；Zeta电位是粒子表面与电中性的分散介质之间的电势差，微粒正电性增高能够增强与负电性的细胞膜之间的相互作用，从而促进纳米复合物的摄入[18-19]。本研究制备的聚酰胺纳米复合物zeta电位高于脂质体转染复合物，而粒径低于脂质体组，通过流式细胞仪检测，发现聚酰胺组细胞对asODN的摄入量明显高于脂质体组。
从释放曲线图上可看到制备的载survivin-asODN的聚酰胺纳米粒子体外释放开始阶段存在明显的“突释效应”，然后稳定并持续释放14 d以上。由此可见实验中制备的载survivin-asODN的聚酰胺纳米粒子具有控释所载基因的效应，而脂质体则不具备控释所载基因的功能。
本实验发现聚酰胺和脂质体均具有携带survivin-asODN进入血管内皮细胞的能力，并能确实有效地封闭survivin蛋白的表达。聚酰胺纳米组的survivin蛋白表达明显低于脂质体组，这可能与纳米粒子对基因的转染效率高有关。由于两组蛋白表达的差异，致使聚酰胺组细胞凋亡率高于脂质体组。
本实验发现聚酰胺较脂质体的粒径小、zeta电位高，具有较高的转染效率，对负载的基因有缓慢释放的效应，并能通过survivin-asODN更有效地下调survivin基因的表达，诱导人脐血管内皮细胞凋亡增加。因此，利用聚酰胺作为Survivin-asODN转染载体作用人脐血管内皮细胞可获得良好的疗效。

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