鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉的制备及理化性质考察*★

谷东风1，曾抗1，李国锋2，史毓杰1，江中洪1，杨莉2

课题背景：课题由2007年广东省科技计划项目基金资助，2004年获全军医疗成果二等奖，2005年获广州市科技进步一等奖和南方医科大学南方医院医疗成果一等奖，2006年获广东省科技进步二等奖。国内外已上市的有鬼臼毒素酊剂、软膏和凝胶，本课题致力于鬼臼毒素固体脂质纳米粒的系列研究，具有重要的实际应用价值。

应用要点：①用毒性低、生物相容性好的固体脂质材料为载体，将药物吸附或包裹于其中，制备鬼臼毒素固体脂质纳米粒，是临床研究的新剂型。②合理的冻干条件增加了冻干工艺的科学性，恰当的冻干保护剂提高了冻干粉剂型的质量。③使用超速离心法结合高效液相检测包封率，增加了高科技含量。

同行评价：实验选用海藻糖、甘露醇为冻干保护剂，探索一种制备鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉的方法，并对其理化性质进行了考察。选题具有一定实际应用意义，实验设计合理，方法正确，其结果为下一步临床研究提供了可靠的参考数据。

南方医科大学南方医院，1皮肤科，2药学部，广东省广州市 510515

谷东风★，男，1979年生，汉族，河南省周口市人，南方医科大学在读硕士，主要从事皮肤性病学的研究。
dong-fenggu@126.com

通讯作者：曾抗，教授，博士生导师，南方医科大学南方医院皮肤科，广东省广州市 510515 npfk@fimmu.com

摘要
目的：制备含有不同冻干保护剂的鬼臼毒素固体脂质纳米粒(POD-SLN)冻干粉，并考察其理化性质，筛选出最佳配方。
方法：实验于2006-12/2007-11在南方医科大学药学部实验室完成。冻干配方为15%海藻糖、15％甘露醇和二者联用各取 5％，冷冻干燥制作冻干粉制剂。扫描电镜下观察冻干粉复溶后粒子形态，Image -Pro Plus 6.0软件计算粒径大小，高效液相考察固体脂质纳米粒的药物包封率，并考察冻干粉的外观、复溶和4 ℃保存对其影响，评价不同辅料对冻干品的影响。
结果：①外观和复溶情况：海藻糖冻干粉、海藻糖联用甘露醇冻干粉表面均松脆多孔，疏松，复溶较快，约需20 s，甘露醇冻干粉表面较光滑，结构致密，饼状，复溶较慢，需借助外力。冻干粉样品4 ℃冰箱放置24 h、1，3，6个月其外观和复溶均无明显变化。②电镜下粒子形态：呈圆形或椭圆形，分布较均匀，冻干前后无明显差异。③粒径：未加冻干保护剂时为（82.65± 18.43）nm，加入海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇后分别为（94.78±21.94），（109.26±16.15），（114.63±21.42）nm。④包封率：未加冻干保护剂时为 87.4%，加入海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇后分别为86.2%，80.3%，79.6%。
结论：以15%海藻糖为冻干保护剂制备的鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉粒径较小，包封率高，稳定性好，其制备工艺合理可行。
关键词: 鬼臼毒素；固体脂质纳米粒；冻干；海藻糖；生物材料；药物载体材料

谷东风，曾抗，李国锋，史毓杰，江中洪，杨莉.鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉的制备及理化性质考察[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1835-1838 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1835(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)10-1835-04

Preparation and physicochemical characteristics of podophyllotoxin loaded solid lipid nanoparticles

AIM:To prepare podophyllotoxin-loaded solid lipid nanoparticles (POD-SLN) powder containing different cryoprotectors, and study its physicochemical characteristics for searching the optimal prescription.
METHODS: The experiment was carried out in the laboratory, Department of Pharmacy, Nanfang Hospital of Southern Medical University from December 2006 to November 2007. Cryopreservation prescription consisted of 15% trehalose, 15% Mannitol and combination of the two ones (each 5%) as cryoprotectors to prepare POD-SLN powder. Transmission electron microscope, Image-Pro Plus 6.0 software, and high-performance of liquid chromatography were used to detect the particle diameter and entrapment efficiency, respectively. Powder appearance and dissolution, as well as the stability when stored at 4 ℃ were all investigated to evaluate the effect of different adjuvant on the powder.
RESULTS: ①Appearance and dissolution: The surface of POD-SLN powder contained 15% Trehalose or combination of 5% Trehalose and 5% Mannitol looked slake and porous, and the two kinds of POD-SLN powder dissolved in water rapidly, about 20 seconds. The surface of POD-SLN powder contained 15% Mannitol was smooth, dense, cake-shaped, and hard to dissolve. Ultrasonic oscillation could be conducted with assistance of external force. When stored at 4 ℃ for 24 hours, 1 month, 3 months and 6 months, the powder samples showed no significant differences of appearance and dissolution.②The particles of POD-SLN powder was round or ellipse, with even distributions. There was no significant difference before and after cryopreservation.③The particle diameter of POD-SLN powder without cryoprotectors and with Trehalose, Mannitol or combination of the two were (82.65±18.43) nm, (94.78±21.94) nm, (114.63±21.42) nm, (109.26±16.15) nm separately.④The entrapment efficiency of POD-SLN powder with cryoprotectors and with Trehalose, Mannitol or combination of the two were 87.4%, 86.2%, 79.6%, 80.3% separately.
CONCLUSION: The small particle diameter, high entrapment efficiency and good stability of POD-SLN powder contained 15% Trehalose are satisfying, and the preparation process is practical.

Gu DF, Zeng K, Li GF, Shi YJ, Jiang ZH, Yang L.Preparation and physicochemical characteristics of podophyllotoxin loaded solid lipid nanoparticles.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1835-1838(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1835 (ps).pdf]

鬼臼毒素是从鬼臼树脂类木脂素中提取的一种具有细胞毒性的天然活性物质。0.5%鬼臼毒素酊剂是世界卫生组织推荐使用治疗尖锐湿疣的一线药物[1-2]，然而酊剂具有系统吸收毒性，因此作者研制了鬼臼毒素固体脂质纳米粒(podophyllotoxin power loaded solid lipid nanopraticles，POD-SLN)混悬液，利用新型载体来提高药物的皮肤靶向性，避免系统吸收毒性。本实验考察POD-SLN冻干粉的制备，以期改善新型制剂的稳定性，提高药物贮存效果。

设计：多样本研究。
单位：南方医科大学南方医院皮肤科和药学部。
材料：实验于2006-12/2007-11在南方医科大学药学部实验室完成。①试剂：硬脂酸（上海永华精细化学品有限公司），卵磷脂（上海太伟药业有限公司），Brij78（P4019Sigma公司），十八烷酰胺（Lot GB01东京华成工业株式会社），二氯甲烷（汕头市光华化学品厂，分析醇），无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂，分析醇），海藻糖（Alfa Aesar A Johnson Matthey Company），甘露醇（青岛明月海藻集团有限公司），鬼臼毒素标准品（Sigma公司，纯度99%），甲醇（Tedia 公司，色谱醇），冰醋酸（广州化学试剂厂），鱼精蛋白、PBS液(南方医院药学部提供)。②仪器：JB-3A型定时恒温磁力搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司），TMP-1型电子天平（德国制造），KQ3200E型医用超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司），冷冻干燥机（美国Labconco公司），Waters 515型高效液相色谱分析仪（美国），H-600型透射电镜（日本日立公司）。
设计、实施、评估者：设计及实施为第一作者和通讯作者，评估为全部作者，均经过专业培训。
技术路线：
SLN 的制备[3]：精密称取50 mg卵磷脂溶于10 mL无水乙醇中，超声30 min使其充分溶解，另取50 mg鬼臼毒素、70 mg硬脂酸和30 mg十八烷酰胺溶于10 mL二氯甲烷中，将所得乙醇溶液与二氯甲烷溶液混合构成油相。精密称取450 mg Brij78加入50 mL双蒸水中，超声10 min使其充分溶解，构成水相。将油相加热5~7 min，至 (75±2)℃后缓慢注入1 000 r/min搅拌的相同温度的恒温水相中，继续搅拌3.0~4.0 h，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5 mL形成纳米乳。将所得的半透明乳状液快速混于另一 0 ℃的5 mL冰水中，并在冰水浴超声0.5 h，即得鬼臼毒素浓度为0.5%的SLN混悬液。
SLN冻干粉的制备：冻干保护剂选择为海藻糖、甘露醇，各取浓度为15%，和二者联合使用为各取5%，与SLN混悬液以1∶1（mL）的比例各取2 mL分装入7 mL西林瓶中。
冻干条件设置：将备好的西林瓶放入冷冻干燥机，按照0.5 ℃/min 降温至-34 ℃并维持24 h，在冷凝器低温、干燥箱保持一定真空度条件下，按照0.07，0.04，0.07℃/min 三阶段升温至25 ℃，保温10 h，取出样品，氮气封口，制得POD-SLN冻干粉。
SLN冻干粉的性质考察：观察样品的外观、复溶速度和复溶后颜色变化，及4 ℃冰箱放置24 h、1，3，6个月外观和复溶情况。
扫描电镜图及其可视化定量分析：取POD-SLN混悬液和复溶后得冻干粉加双蒸水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2%的磷钨酸钠液复染，在透射电镜下观察并拍照，并利用专业图像处理软件Image-Pro Plus 6.0 对图像进行定量分析。
包封率测定：标准品溶液的制备：精密称取鬼臼毒素标准品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加乙醇稀释定容，摇匀，滤过，精密量取滤液0.2，1，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入乙醇至刻度定容，配成不同浓度的标准品溶液系列。精密称取0.5%POD-SLN混悬液1 mL，置入真空干燥器内干燥，取干燥品用乙醇超声提取30 min×3次，合并提取液，放置至室温，置于8 mL容量瓶中，摇匀，加乙醇稀释定容至8 mL；精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，滤过后作为样品准备检测。取1 mL0.5%POD-SLN混悬液，加入1 mL鱼精蛋白，置于4 ℃超速离心机中，以16 000 r/min，离心30 min，取上清液在真空干燥器中干燥，重复上述步骤操作。计算公示：包封率=（药物总量-游离药物的量）/药物总量×100%。每个试样取3份，高效液相测定 4批POD-SLN混悬液的包封率。
主要观察指标：POD-SLN冻干后外观和复溶，POD-SLN混悬液和冻干粉透射电镜扫描图下的形态和粒径，三批冻干粉的包封率。

2.2 POD-SLN冻干后外观和复溶等考察外观情况：①海藻糖冻干粉：表面松脆多孔，疏松，边缘有部分萎缩。②海藻糖联用甘露醇冻干粉：表面松脆多孔，疏松，边缘网格状。③甘露醇冻干粉：表面较光滑，结构致密，饼状。
复溶情况：海藻糖冻干粉及海藻糖联用甘露醇冻干粉复溶约需20 s，甘露醇冻干粉复溶较慢，需借助外力摇匀，甚至超声才能使之充分复溶；海藻糖冻干粉复溶后颜色较清亮，接近海藻糖溶液的颜色，甘露醇冻干粉颜色较白，海藻糖联用甘露醇冻干粉颜色介于二者之间。样品4 ℃冰箱放置24 h、1，3，6个月观察其外观和复溶，加有冻干保护剂的3种冻干粉均无明显变化。
2.3 POD-SLN混悬液和冻干后透射电镜扫描图见图2。

由图2可见，电镜下POD-SLN呈圆形或椭圆形，边界较清晰，分布较均匀，无明显团聚现象；冻干前后无明显差异。
2.4 粒径利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件的可以任意测量两点之间距离的功能来测量POD-SLN的粒径。根据图像自带的标尺每300 pixel相当于500 nm，经过转换的粒径值为：未加冻干保护剂POD-SLN为（82.65±18.43）nm，冻干保护剂为海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇的POD-SLN分别为（94.78±21.94），（109.26±16.15），（114.63±21.42）nm.
2.5 包封率未加冻干保护剂POD-SLN为 87.4%，冻干保护剂为海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇的POD-SLN分别为86.2%，80.3%，79.6%。

SLN是20世纪90年代发展起来的一种可替代乳剂、脂质体、聚合纳米粒的新型胶体给药系统[4]。SLN作为药物载体，可携带药物有效成分，载药量高，与口服药相比大大降低系统吸收毒性，在局部皮肤用药领域具有良好的开发前景[5]。包裹鬼臼毒素的SLN混悬液，可使药物主要作用于皮肤，小剂量局部使用没有系统吸收毒性，浓度为0.5 mg/L时仅有轻微的皮肤刺激性，避免了传统的鬼臼毒素酊剂的毒副作用，是治疗尖锐湿疣的新型制剂[6]。然而脂质体具有不稳定性，室温下长期保存会对药物粒径和包封率产生很大影响。四川大学成功制备了胰岛素固体脂质纳米粒，粒径为（114.7±4.68）nm，包封率为（97.78±0.37）％，4 ℃保存6个月考察粒径和包封率无明显变化，室温下的贮存稳定性未见报道[7]。因此作者利用低温冷冻干燥技术，研制了POD-SLN冻干粉制剂，以期得到稳定性更好的SLN制剂。
SLN的不稳定性主要是其成膜材料性质的不稳定性，膜材易氧化, 脂质体在以水分散系贮存时，会导致粒径增大，多分散存在。氧化可被氧化剂抑制，而水解是难以避免的。加入抗氧化剂和制成冻干粉理论上能够提高SLN稳定性。国外有学者报道脂质体以固体脂质纳米粒的形式存在，可提高SLN制剂的抗氧化作用[8]，但未对其机制进行详细的阐述，并且其制备的类姜黄素固体脂质纳米粒粒径较大，平均为447 nm。1978年Vanleberghe等[9]首次报道采用冷冻干燥法可提高脂质体得稳定性。冻干保护剂可以保持脂质体膜结构的稳定性，显著降低药物和脂质体的水解和氧化速度。同时保护剂在冷冻过程中能与水形成低共熔混合物或玻璃态物质，抑制冰晶的生长，使冰晶以无定形或微晶的状态存在，从而降低其对纳米粒的挤压和机械损伤作用[10]。冻干保护剂还可在干燥过程中起到支撑剂作用，避免纳米粒的相互聚集。冷冻干燥技术在真空条件下进行，氧气含量少，能够使药品中易氧化的物质得到保护，挥发性成分得以尽可能多的除去，利于室温或相对较高的温度下保存[11]。可见，制成冻干制剂是一种较成熟的提高
SLN制剂贮存稳定性的方法。
制备冻干粉前要考虑SLN制剂的组成成分，还要考虑到冻干过程中表面活性剂是否会聚集，冻干保护剂和SLN之间的相互作用，以及冻干过程中温度的选择，温度要逐渐下降，下降的速率对冻干过程影响较大，并且每个冻干阶段所持续的时间[12]。冻干条件有快速冻干和缓慢冻干，快速冻干是在液氮中进行，缓慢冻干是在较低的温度下进行，持续时间较长。国外学者研究不同冻干条件对冻干品理化性质的影响，发现缓慢冻干（温度为-50 ℃，速率为-10 ℃/h）制得的冻干品粒径稍微增大，有利于长期保存，并且缓慢冻干对辅料中含有阳离子脂质成分的冻干品效果更好[13]。POD-SLN带正电荷，制备时使用的辅料硬脂酸和十八烷酰胺构成阳离子脂质材料[3,14]，适合缓慢冻干。因此，根据文献报道，结合专业研究人员冻干粉制备经验，本实验所选冻干条件为低温-34 ℃，维持24 h后按照0.07，0.04，0.07 ℃/min 三阶段逐渐升温。
希腊学者Ntimenou等[15]报道加海藻糖和不加海藻糖的脂质体冻干制剂相比较，前者稳定性好，包封率较高，并且保护剂在脂质体制剂冻干后的稳定性方面起重要作用。Bridges等[16]报道蛋黄卵磷脂脂质体直接冻干会引起粒子聚集和直径增大，用海藻糖做冻干保护剂时复水后粒径无明显变化。吴燕等[17]将分别选取海藻糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、乳糖5种不同保护剂，每种保护剂浓度为5％，10％，15％，冻干后测定各种保护剂在冻干粉复水化后脂质体粒径的变化。结果表明所有保护剂浓度在15％时脂质体的粒径变化最小，而保护剂为海藻糖的脂质体粒径变化最小。本实验选用海藻糖、甘露醇及二者联用为冻干保护剂，通过处方筛选，发现海藻糖冻干保护效果较佳，与国内外研究报道相一致。
海藻糖为二糖，属非还原性糖，是常用的冻干保护剂。因其能够抗脂类食品氧化变质，而广泛用作含脂类食品的防腐剂。作者使用的为二结晶水海藻糖，为多羟基糖类物质，具有抗脂质氧化作用，国外学者研究了海藻糖在二棕榈酰磷脂酰胆碱脂质体制剂冻干过程中的保护作用，指出：冻干过程中二棕榈酰磷脂酰胆碱脂质体有多元相的脱水，海藻糖能够降低相变温度，限制相位分离，保护脂质体膜成分的稳定性[18]。Christensen等[19]考察了海藻糖和蔗糖在卡介苗脂质体冻干品中的作用，发现加海藻糖的卡介苗脂质体冻干制剂可以有效刺激免疫卡介苗小鼠产生较强的细胞免疫反应和抗体反应，研究认为等渗浓度的海藻糖可以保护冻干过程中阳离子脂质材料的稳定性，具体机制尚不清楚，可能与海藻糖直接和阳离子脂质材料起反应有关。Liao等[20]认为海藻糖含有多羟基，羟基在冷冻干燥过程中与纳米粒表面的基团形成氢键，从而代替水的作用，抑制纳米粒的聚集。另外，海藻糖具有其他冻干保护剂共同的优点。作者综合评价各种指标，发现浓度为15%的海藻糖作为冻干保护剂制备的冻干粉粒径变化较小，包封率高，稳定性好。因此，POD-SLN冻干粉的制备工艺合理可行。

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