可降解生物材料复合基因强化干细胞移植修复兔关节软骨缺损☆

丁幸坡1，金先庆2，王智勇1，付艳丽1

课题背景：经典的组织工程方法中最常使用的种子细胞是自体或同种异体来源的骨髓间充质干细胞，但其仍存在着不少局限性，如在体外培养中和软骨定向分化中对外源性生长引子的依赖性。本课题立足于此，通过前期实验，成功将hIGF-1基因导入兔骨髓间充质干细胞，对其进行了一定程度的基因改良，并将改良后的种子细胞与PLGA体外短暂复合培养后移植入缺损关节处以提高其修复效果。

同行评价：间充质干细胞与关节软骨缺损修复的研究是目前骨科领域的热点和难点之一，文章能紧贴此主题，追踪科技前沿进行实验，科研设计较合理，有一定临床实用价值。建议进一步增加实验动物数量及观察时间，以增强文章的说服力。

偏倚或不足：①本课题所使用的基因载体为携带了目的基因的质粒载体，相比较病毒类载体虽然有不整合宿主、携带DNA信息量大等优点，但存在有表达时间短、表达时限较短、稳定性较差等缺陷。②由于客观原因所限，未能获得移植术后12周以上更长时间的观察资料和数据，有待后续研究进一步完善。

1河南省正骨研究院小儿骨科研究室，河南省洛阳市 471002；2重庆医科大学儿科研究所外研室，重庆市 400014

丁幸坡☆，男，1973年生，河南省洛阳市人，汉族， 2006年重庆医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事关节软骨组织工程研究。
dingxingpo@163.com

摘要
目的：在前期成功构建携带有目的基因的质粒载体IRES2-EGFP-hIGF-1基础上，探索使用可吸收生物材料PLGA复合基因强化的同种异体骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植修复兔关节软骨缺损的方法。
方法：实验于2005-09/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。①选择3月龄新西兰大耳白兔18只，双下肢髁关节面上共制作4个直径3 mm、深3 mm的全层软骨缺损，自左到右为：空白对照组，PLGA移植组，PLGA-MSCs组（PLGA+空载体转染的MSCs移植），PLGA+hIGF-1-MSCs组（PLGA+hIGF-1转染的MSCs移植）。②分别于术后4，6，12周各处死6只，应用大体观察、组织学观察及组织学评分评估缺损软骨的修复情况、修复组织中hIGF-1和Ⅱ型胶原的表达情况、移植细胞GFP荧光强度等。
结果：16只兔进入结果分析，脱落2只。术后12周时，组织切片显示，PLGA+HIGF-1-MSCs组新生组织中可见大量类透明软骨细胞出现，Ⅱ型胶原丰富表达；荧光追踪显示PLGA-MSCs组和PLGA+hIGF-1-MSCs两组修复组织在4周时仍有可见的GFP表达；PLGA+hIGF-1-MSCs组各个时间点组织学评分均高于其他3组（P < 0.05）。
结论：PLGA与经过hIGF-1基因强化的MSCs复合移植提高了对兔关节软骨缺损的修复效果。
关键词；可降解生物材料；PLGA；关节软骨；骨髓间充质干细胞；基因强化；

丁幸坡，金先庆，王智勇，付艳丽.可降解生物材料复合基因强化干细胞移植修复兔关节软骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1839-1842 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1839(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)10-01839-04

Repairing articular cartilage defects in rabbits by gene-modified stem cells transplantation of biodegradable materials

AIM:Based on the IRES2-EGFP-hIGF-1 plasmid vector carrying target gene, this study was designed to research the method of repairing articular cartilage defects in rabbits by the transplantation of biodegradable PLGA scaffold compounded with allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs).
METHODS: The experiment was performed at the Pediatric Research Institute, Children's Hospital of Chongqing Medical University from September 2005 to January 2006.①Eighteen 3-months-old New Zealand rabbits were selected for making 4 models of articular cartilage defects in articular facets of both lower extremities, with 3 mm diameter and 3 mm depth. Four groups were divided as blank control group, PLGA scaffold transplantation group, PLGA scaffold compounded with MSCs transplantation group (modified by blank vector), and PLGA scaffold compounded with MSCs transplantation group (modified by hIGF-1 gene).②Every 6 animals were sacrificed at 4, 8, 12 weeks postoperatively. The observation of macroscopy and the score of histology were used to evaluate the repairs of knee joint articular cartilage defects in rabbits, the expressions of hIGF-1 and type II collagen, as well as GFP fluorescence intensity of transplanted cells.
RESULTS: Sixteen rabbits were involved in the result analysis, whereas 2 animals were lost. At 12 weeks postoperatively, histological observation showed that there were many cartilago-like cells in new tissues from defects field and abundant expression of type II collagen. At 4 weeks postoperatively, GFP expression was detected by fluorescence tracking in frozen section from PLGA-MSCs group and PLGA+hIGF-1-MSCs group. The histological score in the group transplanted by PLGA+hIGF-1-MSCs was higher than that in other three groups (P < 0.05).
CONCLUSION: After the gene is modified by hIGF-1, MSCs transplantation with PLGA can improve the repair effect on articular cartilage defects in rabbits.

Ding XP, Jin XQ, Wang ZY, Fu YL.Repairing articular cartilage defects in rabbits by gene-modified stem cells transplantation of biodegradable materials. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1839-1842(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1839(ps).pdf]

组织工程学的诞生给关节软骨损伤的修复带来了生物学治疗的美好前景。本实验在前期成功构建携带有目的基因的质粒载体IRES2-EGFP-hIGF-1基础上，将之用于转染、修饰骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）并与可降解生物材料聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLGA）在体外短暂复合培养，然后移植修复兔关节软骨缺损，以探讨一种实用的关节软骨缺损组织工程修复方法。

设计：随机对照动物实验。
单位: 河南省正骨研究院小儿骨科研究室。
材料: 实验于2005-09/2006-01在重庆医科大学儿科研究所（BSL-1）完成。
动物：3月龄新西兰大耳白兔18只，雌雄不拘，体质量（3.0±0.2） kg，由重庆医科大学实验动物中心（使用许可证号SCXK(渝)20040009）提供。
细胞-支架材料复合物：PLGA-MSCs或PLGA-MSCs-hIGF-1，接种密度6×1010 L-1，复合培养1周，见图1。

试剂和仪器：4%戊巴比妥；Plank-Rychlo（P-R）脱钙液；8%硫化钠；甲苯胺蓝（TB）、IGF-1兔抗人一抗、Collegen兔抗人II型胶原一抗、DAB显色试剂盒(Boster)；常规手术器械；φ3 mm角膜环钻（上海医疗器械批发部）；组织包埋冷冻台及包埋机（BMJ-III型，常州中威）；组织脱水机（日本SAKURA）；石蜡切片机、冰冻切片机（德国LEICA）；普通光镜；倒置荧光显微镜（日本Nikon）；牙科磨锯；其他常规化学及分子生物学试剂。
设计、实施、评估者：为第一、二作者，余作者配合参加，均接受过相关正规培训。
技术路线：
模型制备：动物耳缘静脉注射30 g/L戊巴比妥 1.0 mL/kg麻醉后固定于手术台，双下肢膝部脱毛、消毒、铺巾，于髌骨外侧缘纵切口2 cm，切开皮肤、皮下，暴露膝关节，外脱位髌骨，以角膜环钻于股骨内、外侧髁关节面上作直径3 mm、深3 mm的全层软骨缺损，无菌镊取出6孔板中预备的细胞-支架复合物填充于关节缺损处，四周轻轻加压使其稍低于关节面，不予固定，复位髌韧带，逐层关闭关节，无菌辅料包扎。关节不予固定，任其自由活动。术后家兔单笼喂养，青霉素20万U/(kg·d)连用1周。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
分组及标本采集：每只动物两关节共制作4个缺损，自左到右为：空白对照组；PLGA移植组；PLGA-MSCs组：PLGA+空载体转染的MSCs移植；PLGA+hIGF-1-MSCs组：PLGA+hIGF-1转染的MSCs移植。将18只动物按照取材时间随机分为3组，分别于术后4，8，12周处死，每个时间点取6只观察并取材检测。
观察指标：①大体观察：观察术后动物一般情况、切口情况及关节缺损局部表面平整与否、色泽、质地、与周围软骨结合情况等。②病理切片观察：按设计分组时间于原缺损区域取材，截取修复部位骨与关节软骨，修成4 mm左右厚度薄片，40 g/L新配多聚甲醛固定2 d，P-R脱钙液脱钙3 d后进行常规固定、石蜡包埋、切片，进行甲苯胺蓝染色观察软骨基质，同时进行免疫细胞化学方法染色观察修复组织中hIGF-1和Ⅱ型胶原的表达情况。③另取术后4周各组标本，EDTA缓慢脱钙2周，每周更换脱钙液2次，取材修剪后冰冻标本，制作6 μm厚度冰冻切片，荧光显微镜下观察、追踪PLGA-MSCs组和PLGA+hIGF-1-MSCs两组移植细胞的GFP荧光标记。④组织学评分：依据Ramallal的关节软骨组织学评分标准[1]对修复后的软骨组织进行评分。满分16分，分数越高表示组织学上越接近正常软骨组织。
主要观察指标：①动物术后一般情况、活动、缺损区域愈合情况。②关节面缺损区修复情况外观。③缺损区新生组织组织学观察及组织学评分。
统计学方法：组织学评分数据均记作_x±s，根据标准差单向方差分析用SPSS 13.0软件进行统计处理，比较各组评分与正常值均数间的差异，a=0.05为检验标准。统计学处理由第一作者完成。

2.1 实验动物数量分析术中麻醉死亡1只，术后单侧关节感染予放弃1只，其余16只动物皆存活且创口愈合良好，进入结果分析16只，4，8周5只，12周6只。
2.2 大体观察空白对照组和PLGA移植组缺损创面中依时间不同有不同程度的机化组织，创面颜色由红色逐渐变浅，显示了典型的瘢痕演变过程，肉眼观察及组织学改变两组无明显差异，见图2a；PLGA-MSCs组关节缺损区域大部为新生组织填充，填充物呈灰白色半透明状，厚度几与关节面相平，部分关节缺损缘有较硬的软骨样组织向中心延伸生长，色淡红，半透明状；PLGA+hIGF-1-MSCs组缺损完全被新生组织替代修复，表面光滑，色亮白，半透明，有条索状或卵石样起伏，质地坚韧，缺损修复组织中央部分较周围稍低平，边缘部分多未高出周围软骨缘，与关节表面连续较好，结合紧密，但与正常软骨交界处仍可辨，见图2b。

2.3 普通光镜及荧光显微镜观察 ①空白对照组和PLGA移植组：光镜下，缺损区域始终未见典型的软骨细胞及软骨基质TB着色，病理切片显示缺损处充填组织为纤维结缔样组织，正常软骨边界有代偿性增生；术后12周缺损仍然存在，结缔组织变厚。②PLGA-MSCs组创面有一定程度修复，12周时，缺损局部已为修复组织充满，缺损区域深层可见部分区域性软骨样细胞团，基质被染为较深的紫红色，表面及浅层已可见较多类透明软骨细胞均匀、分散排列，但周围无明显基质着色，胶原着色明显。③PLGA+hIGF-1-MSCs组：术后12周，TB染色见重建的组织内浅层有新生的软骨细胞或类软骨细胞逐渐出现，深层软骨细胞进一步增多，分布区域扩大，区域性分布的细胞团内以类透明软骨为主，胞间结合紧密，胞周出现深染细胞基质，见图3a，DAB染色可见胞周黄染的Ⅱ型胶原，见图3b。
hIGF-1表达：免疫细胞化学显示，只有PLGA+hIGF-1-MSCs组在移植4周后的组织中可见到极少量细胞hIGF-1表达阳性，4周后及其他组中未见表达。同时，4周时镜下可见大量未降解的PLGA材料片段及其周围散在细胞。

移植细胞的GFP荧光追踪：缺损区域取材组织冰冻切片显示，术后4周于PLGA-MSCs组和PLGA+hIGF-1-MSCs两组可见到少量散在圆形和椭圆形绿色荧光标记的细胞及其少量分裂相，荧光充满胞体。但8周后荧光基本消失。
2.4 组织学评分各组相同时间点比较，PLGA+hIGF-1-MSCs组均明显优于其他3组 (P < 0.05)，而PLGA-MSCs组和PLGA-MSCS组之间比较差异无显著性意义 (P > 0.05)；另除空白对照组外，组间不同时间点比较差异均有显著性意义。见表1。

MSCs被公认为是软骨组织工程种子细胞首选种子细胞，但在培养和软骨定向分化中对外源性生长引子的依赖性限制了其广泛应用，也是目前对MSCs应用的难题之一[2-11]。本课题立足于此，在前期实验中通过将具有促进MSCs分化、增殖、软骨特异性胞外基质的合成等作用的hIGF-1基因导入兔MSCs，对其进行了一定程度的基因强化和改良。本实验在前期实验基础上，将基因强化后的种子细胞与PLGA体外短暂复合培养后移植入缺损关节处以提高其修复效果，获得了较为理想的实验结果。
Ⅱ型胶原是细胞向软骨细胞分化的重要标志性蛋白，也是评价机体组织成软骨活性和组织分化能力的重要指标，其高低与软骨分化程度成正相关。本实验显示，随着复合物植入后时间的延长，各组修复组织中胶原成分都有不同程度的升高，同时hIGF-1可促进细胞Ⅱ型胶原的分泌。本实验中，Ⅱ型胶原的表达在不同组有明显区别，在一定程度上证明二者有相关性，但由于质粒表达时限的制约，使得hIGF-1的相对高表达只出现在PLGA+hIGF-1-MSCs组4周以前，无法与在4周以后继续观察，不能判断二者的相关性，但大体标本组织染色以及组织评分显示，Ⅱ型胶原在PLGA移植组、PLGA-MSCs组、PLGA+HIGF-1-MSCS组各个时间点均有不同程度的表达，且以PLGA+hIGF-1-MSCs组表达最为丰富，荧光染色追踪也在一定程度上证实了移植细胞继续存在并发挥着对Ⅱ型胶原的活性作用，与相关报道一致[12-13]。
本实验所用的载体本身携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，可以方便地跟踪移植入体内的基因修饰的MSCs，实验结果显示对本实验所用转基因载体pIRES2-EGFP携带的EGFP标记基因荧光追踪结果显示，在术后4周仍可以追踪到标记基因的绿色荧光表达，证明缺损区域内细胞成份仍含有大量复合移植的修饰细胞并继续保持了蛋白表达活性。6~8周以后，载体的蛋白表达已经基本消失，随之荧光逐渐消失。
作为任何载体都有其优缺点，应该选择合适于实验目的的标记物用于不同的目的。本载体的表达时间在有效刺激MSCs向软骨细胞分化的周期内，所以结果达到了预期目的，与相关报道一致[14-15]。
虽然关节软骨形成后需要长达半年以上的自我改造、塑性以达到更好的生物力学标准和与周围组织的更好融合，但其基本形成时间在12周即可基本完成[16]。本实验术后观察时间在12周，已经基本满足了软骨修复初步需要的时间，按照经典的Ramallal组织学评分标准，所形成的软骨组织已经基本符合了软骨组织的基本特征，但长期的疗效和修复效果尚待进一步观察验证。本实验中，区域性软骨形成新生软骨组织与正常软骨间的整合并不完美，在二者交接区均可见细胞比较稀疏，个别交接区尚有裂隙存在，这与其他一些报道类似[17-20]，原因可能是植入组织与缺损之间嵌合欠佳有关，或者是由于术后肢体未予固定造成早期移植材料与缺损周围组织有相对位移。另外，修复组织评分标准显示，各组组织成分及指标都尚未达到正常组织分值，可能原因主要是术后观察时间稍短，组织尚未及完成自我修复和塑性过程，后续实验中将完整观察时间。另外也可能与材料降解产物造成的局部生化微环境的改变有关。
总之，本实验探讨了用hIGF-1基因强化后的MSCs作为种子细胞复合支架材料移植用于修复实验性关节软骨缺损的新的实验方法，取得了较好的实验效果，为临床关节软骨损伤的生物学治疗提供了一个新的思路。在临床上，若能结合近年来逐渐成熟的腔镜等微创手段将复合培养的细胞导入缺损部位进行治疗，则关节软骨缺损的微创修复和“再生”就可能成为不远的现实。

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