抗非特异性蛋白吸附的聚乙二醇接枝聚乳酸对成骨细胞黏附、生长和分化的影响**★

糜丽，潘君，赵明媚，刘颖，王彬，王远亮

课题背景：寻求能够作为细胞移植与引导组织生成的人工合成可降解的生物材料作为组织工程支架的应用成为组织工程的研究重点。本课题受国家自然科学基金资助（30300084），旨在检测实验室合成的聚乙二醇接枝的聚乳酸材料（PPLA）是否具有良好的生物相容性。

应用要点：采用了小相对分子质量聚乙二醇接枝改性了聚乳酸材料，通过对牛血清白蛋白的吸附实验发现，该材料能显著地降低对非特异性蛋白的吸附；通过细胞实验发现该材料具有促进细胞黏附、生长和分化功能，加上前期研究已经证实的它的良好亲水性和降解性，因此它是一种比聚乳酸更能满足生物材料发展要求的新型材料。

同行评价：文章研究聚乙二醇接枝聚乳酸作为骨生长的生物材料介质，是热门课题，实验的结果良好，数据可靠，具有很强的应用价值。

重庆大学生物工程学院生物材料与仿生工程研究中心，重庆市 400044

糜丽★，女，1982年生，重庆市人，汉族，重庆大学生物工程学院在读硕士，主要从事高分子材料的生物相容性研究。
mizhuer@yahoo.
com.cn

国家自然科学基金资助项目（30300084）*；“111”计划“生物力学与组织修复工程学科创新引智基地”资助项目*

摘要
目的：在前期成功合成聚乙二醇接枝的聚乳酸材料[poly(ethylene glycol) graft poly(D,L-lactic acid)，PPLA]的基础上，以聚乳酸为对照，进一步考察该材料的细胞相容性。
方法：实验于2006-10在重庆大学生物材料与仿生工程实验室进行。①以FITC荧光标记牛血清白蛋白检测聚乳酸及自制的PPLA材料的抗非特异性蛋白吸附性能。②在体外聚乳酸和PPLA聚合物膜上培养Wistar新生鼠成骨细胞。采用四甲基偶氮唑盐比色法测试细胞黏附和增殖情况，并通过检测碱性磷酸酶活性评价细胞分化程度。
结果：①与聚乳酸相比，PPLA对牛血清白蛋白的吸附明显降低，仅为聚乳酸的37.3%。②与聚乳酸相比，在接种成骨细胞后，PPLA材料上的细胞黏附量更多，细胞数量更高；经过8 d的培养后，PPLA材料上成骨细胞的碱性磷酸酶活性高于聚乳酸。
结论：与聚乳酸相比，PPLA材料具有更强的抗非特异性蛋白吸附作用，并能显著地促进细胞黏附、生长及分化，具有良好细胞相容性。
关键词：聚乳酸；聚乙二醇；细胞相容性；聚乙二醇接枝聚乳酸；生物材料

糜丽，潘君，赵明媚，刘颖，王彬，王远亮.抗非特异性蛋白吸附的聚乙二醇接枝聚乳酸对成骨细胞黏附、生长和分化的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1843-1846
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1843(ps).pdf]

Influence of poly(ethylene glycol) graft poly(D,L-lactic acid) with protein-resistant property on the adhesion, proliferation and differentiation of osteoblasts

AIM:The poly(ethylene glycol) graft poly(D,L-lactic acid) (PPLA) has been synthesized, and this study will detect its cell compatibility compared with polylactic acid (PLA).
METHODS: The experiment was carried out in the laboratory of Biomaterials and Bionics, Chongqing University in October 2006.①The anti-non-specific protein absorption properties of PLA and PPLA polymer were tested using FITC labeled bovine serum albumin.②Osteoblasts of Wistar neonatal rats were cultured on the PLA and PPLA polymer in vitro. The adhesion and proliferation of osteoblasts on the films of polymers were tested using 3-(4, 5-dimethylthiazal-2yl) 2, 5-diphenyltetrazolium bromide assay. The alkaline phosphatase activity was tested to evaluate the cell differentiation.
RESULTS: ①Compared with PLA, the poly(ethylene glycol) graft PPLA showed an obviously decreasing absorption of bovine serum albumin, accounting for 37.3% of PLA.②Compared with PLA, the adhesion and proliferation of osteoblasts were improved after seeding on PPLA material; Alkaline phosphatase activity of osteoblasts was also advanced on PPLA material after 8 days.
CONCLUSION: Compared with PLA, PPLA reveals a prominent property of non-specific protein absorption, it can significantly improve the adhesion, proliferation and differentiation of osteoblasts, as well as representing good cell compatibility.

Mi L, Pan J, Zhao MM, Liu Y, Wang B, Wang YL.Influence of poly(ethylene glycol) graft poly(D,L-lactic acid) with protein-resistant property on the adhesion, proliferation and differentiation of osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1843-1846(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1843(ps).pdf]

聚乳酸（PLA）是一种具有良好生物相容性、可降解性的生物材料，已广泛应用于药物控制释放体系、骨固定修复材料及组织工程支架材料中[1-3]。然而聚乳酸材料在生物医学应用中有以下缺陷：疏水性强、缺乏反应活性基团，难以进一步改性[4-5]、缺乏生物活性。对聚乳酸进行生物活化改性，在材料上引入细胞信号，以通过生物识别和机体的转导机制直接刺激生物反应，引导细胞的增殖、分化、迁移、胞外基质的分泌组建[6]；或在材料上引入靶向信号，以通过与靶细胞的识别实现药物的靶向释放分别是组织工程和药物缓释应用的要求[7]。
然而，组织工程及药物缓释要求的生物活性是特异性的，因此在对聚乳酸进行生物活化改性前需要制备具有抗非特异性蛋白吸附的材料[8]。聚乙二醇（PEG）是常用来赋予材料抗非特异性蛋白吸附性能的物质，人们采用相对分子质量大于2 000的PEG改性了聚乳酸，制备了二嵌段聚合物（PEG-PLA）[9]和三嵌段聚合物（PLA-PEG-PLA）[10]，产物有明显的抗非特异性蛋白吸附的作用，对细胞的黏附和生长呈现抑制效应[11]。由于PEG本身不能被生物体降解，因此本室采用低相对分子质量的PEG改性聚乳酸，期望制备具有抗非特异性蛋白吸附的材料，改善PEG改性聚乳酸的生物相容性，同时在材料上引入反应活性基团，为下一步的生物活化改性作准备。前期研究已经证实，与聚乳酸相比，改性材料的亲水性和降解性增加[12]，本实验观察改性材料是否具有抗非特异性蛋白吸附的性质，并评价其细胞相容性。

1.1 材料实验于2006-10在生物材料与仿生工程实验室进行。聚乳酸、聚乙二醇接枝聚乳酸（poly(ethylene glycol) graft poly(D,L-lactic acid)，PPLA）：根据文后文献[12]本室自制；DMSO、MTT、Triton-100：sigma；DMEM培养液：GIBCO；双抗：华北制药股份有限公司；小牛血清：天津灏洋生物制品科技有限责任公司；四氢呋喃（THF）：成都科龙化工试剂厂；碱性磷酸酶检测试剂盒：北京中生生物工程技术公司。
1.2 方法
1.2.1 FITC-BSA在聚合物表面的吸附分别取0.100 0 g聚乳酸和PPLA，用5 mL THF溶解，加入直径为9 cm的培养皿内，通过溶剂挥发成膜。在培养皿内加入10 mL、0.02 g/L的FITC-BSA水溶液，37 ℃静态孵育30 min，吸走FITC-BSA溶液，用蒸馏水洗涤聚合物膜3次，在倒置荧光显微镜（Olympus IX-71）下观测其荧光并照相(以蓝色光激发)。之后用4 mL THF将聚合物及表面吸附的FITC-BSA溶解，用荧光分光光度计（Perkin-Elmer LS-50B），以490 nm的光激发，测试溶液在510 nm下的荧光发射强度，并通过FITC-BSA的标准曲线换算成聚合物表面吸附的FITC-BSA质量。
1.2.2 成骨细胞在聚合物表面的黏附分别取 200 μL质量浓度为5 g/L的聚乳酸和PPLA的THF溶液，加入 25 cm2的玻璃培养瓶内，于无菌操作台上静置，通过溶剂挥发成膜，紫外灯灭菌30 min。将培养的第4代Wistar新生鼠成骨细胞以105的细胞量，接种到各培养瓶中，培养介质为2 mL含0.5%双抗的DMEM溶液，在各材料的3个培养瓶的培养介质中补加体积分数为0.1的小牛血清(CS)，培养环境为37 ℃、体积分数为0.05的CO2的恒温培养箱。接种4 h后，弃原培养液，采用MTT法测试，操作如下：加5 g/L 的MTT 水溶液200 μL、无血清DMEM溶液至2 mL，于37 ℃恒温培养箱中孵育4 h，弃上清液后加2 mL DMSO，室温振荡10 min，以溶解形成的紫色沉淀，吸取该上清液至比色皿中，在紫外-可见分光光度计（Perkin-Elmer λ900）570 nm处读取吸光度值。
1.2.3 成骨细胞在材料表面的增殖参照上述成膜方法，每种材料制备12个样品，将培养的第四代Wistar新生鼠成骨细胞以104的细胞量，接种到各培养瓶中，培养介质为2 mL含0.5%双抗和体积分数为0.1小牛血清的DMEM溶液，培养环境同上，在整个培养过程中不更换培养介质。分别于接种后的第2，4，6，8天取样用上述MTT法测试。
1.2.4 成骨细胞在材料表面的碱性磷酸酶的活性参照上述成膜方法，每种材料制备9个样品，将培养的第4代Wistar新生鼠成骨细胞以104的细胞量，接种到各培养瓶中，培养介质为2 mL含0.5%双抗和体积分数为0.1小牛血清的DMEM溶液，培养环境同上，在整个培养过程中不更换培养介质。分别于接种后的4，6，8 d取出，弃原培养液，用0.25%的胰酶消化细胞，用完全培养液吹散后将细胞悬液离心，弃上清液，加入2 mL 0.1%的Triton-100，反复冲洗、吹打，使细胞完全裂解后离心，收集上清液在离心管中，置于-80 ℃冰箱过夜。次日在冻干机（Thermo modulyo-D）中冻干样品，用80 μL PBS溶解后，采用碱性磷酸酶检测试剂盒，以对硝基苯磷酸盐为底物，采用酶标仪（BIORAD Model 680）测试。

2.1 非特异性蛋白吸附解析从图 1可以看出，聚乳酸膜表面有大量的FITC-BSA吸附，而PPLA膜表面则基本没有，这说明PPLA明显降低了FITC-BSA的吸附。通过荧光分光光度计测试，并用FITC-BSA的标准曲线校准，扣除了水与THF两种溶剂吸光度的差值，得到聚乳酸对FITC-BSA的吸附量是0.2 mg/g，PPLA的为0.074 9 mg/g，仅为聚乳酸的37.3%，也说明PPLA显著降低了聚乳酸材料对FITC-BSA的吸附。

2.2 成骨细胞在材料表面的黏附从图 2可以看出，在有血清的培养环境中，在两种材料表面的细胞黏附量都高于无血清的；与聚乳酸相比，在PPLA上的细胞黏附量更大。

大量研究证明PEG具有抗非特异蛋白吸附的性质，它能抑制蛋白、血液和细胞的黏附[13-14]，而本实验得到的PPLA促进了聚乳酸对细胞的黏附。有研究者对含PEG的水凝胶通过化学修饰，得到分别带正电荷、负电荷及零电荷的PEG水凝胶材料，另外通过接枝可促进细胞黏附的多肽RGD得到结合了RGD的含PEG水凝胶材料；细胞实验表明，对细胞黏附的促进作用按大小顺序分别是带正电荷的、含RGD的、带负电荷的和不带电荷的[15]。本实验采用的PPLA材料含有氨基（-NH2）和羧基（-COOH），在细胞培养介质中它们易形成NH3+和COO-离子，这些离子的出现可能促进细胞的黏附。研究者发现PEG的相对分子质量对细胞的黏附有影响，相对分子质量越大，对细胞黏附的抑制作用越明显[16]。本实验中采用的PEG相对分子质量仅为600，目的就是降低PEG对细胞黏附的抑制作用。此外，作者的研究已经证实，PPLA具有比聚乳酸更好的亲水性，亲水性的改善对细胞的黏附也有促进作用。
2.3 成骨细胞在材料表面的增殖从图3可以看出，随着培养时间的延长，在两组材料上的细胞数量都在增加。在同一时间点上，PPLA上的细胞数量都明显高于聚乳酸的，显示出它促进细胞生长的作用。

2.4 成骨细胞在材料表面的碱性磷酸酶的活性从图4 可以看出，随着培养时间的延长，成骨细胞在两组材料上的碱性磷酸酶活性都在增加，同一时间点上，PPLA的碱性磷酸酶活性更大，并在8 d时表现出显著差异。

图5为相同时间点成骨细胞的碱性磷酸酶活性与MTT法测试细胞增殖得到的A值的比值，结果显示，4 d时两种材料的比值相近，说明在单个细胞水平的碱性磷酸酶活性没有差异；6 d时PPLA的比值较聚乳酸低，说明此时PPLA材料上细胞的增殖更具有优势；8 d时PPLA的比值高于聚乳酸，说明在单个细胞水平，与聚乳酸相比，PPLA提高了碱性磷酸酶的活性。碱性磷酸酶是成骨细胞成熟的标志性酶之一，富含于包浆中，它有助于矿物质化机制的正常进行，是促进骨间质矿化的重要酶[17]。碱性磷酸酶的活性是成骨细胞功能及分化程度的指标，它在细胞中的表达量直接反映出细胞的分化程度和功能状态。本文结果显示随着培养时间的延长，PPLA可提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性。

MTT法的测试结果可表征活细胞的数量，本实验采用了MTT法测试细胞的黏附和增殖。前期研究表明，成骨细胞的倍增时间约2 d，所以在细胞接种后4 h采用MTT法测试的结果仅与在材料表面黏附的活细胞数量有关，表征了细胞在材料表面的黏附状况；在细胞接种2 d后，细胞增殖，这时采用MTT法测试的结果显示了细胞在材料上的增殖状况。

作为组织工程的支架材料而言，除了应具有良好的生物相容性、生物可降解性、合适的机械强度和易于加工成型外，更重要的是能调控细胞的响应和相互作用[18]，激发肌体自身的修复机制以替代支架材料[19]。上述实验结果表明，与聚乳酸相比，本实验得到的聚乙二醇接枝聚乳酸在接种成骨细胞后，可促进它的黏附和生长，经培养8 d后，又可促进其分化。因此从细胞的相容性和骨组织工程应用的角度看，它是比聚乳酸更适合的一种材料。同时该材料具有抗非特异性蛋白吸附的作用，利用它的反应活性，可在进一步键合细胞因子，调控细胞的响应，获得具有特异性生物活性的聚乳酸材料，用作组织工程的支架材料，这是作者下一步的研究内容。
从药物缓释角度考虑，为了提高药物的生物利用度和实现靶向缓释，需要药物缓释载体在体内的停留时间足够长，而实现的重要途径是赋予载体材料抗非特异性蛋白吸附的性质[20]，PPLA具有了这样的性质，加上其良好的细胞相容性，可通过在此材料上进一步引入靶向导向载体，得到具有靶向性的缓释载体材料，用于药物缓释研究，这也是作者下一步的研究内容。
综上所述，通过接枝，在聚乳酸中引入相对分子质量低达600的聚乙二醇得到的改性聚乳酸材料具有明显的抗非特异性蛋白吸附的性质，可促进成骨细胞的黏附、生长和分化。由于该材料的反应活性、亲水性、可降解性、抗非特异性蛋白吸附以及细胞相容性[12]，通过进一步引入多肽、蛋白质等生物活性分子，制备具有特异性生物活性的材料，能更好地适应药物缓释和组织工程的应用要求。

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