课题背景：利用膜诱导组织再生是生物材料开发的重点。一般诱导组织再生膜材料只具有机械屏障作用，膜本身并不具有成骨诱导性，这就限制了它在骨修复材料中的使用。因此，开发出一种具有诱导作用的复合性生物膜，是临床上应用较理想的膜材料。实验采用溶剂蒸发的方法，利用骨性诱导材料纳米羟基磷灰石和高分子聚合物聚氨酯复合，制备出具有较好的骨诱导性和良好的热稳定性复合再生膜，并对其的生物学性能进行评估。

应用要点：①体外细胞培养具有良好的生物相容性，细胞增殖并分化，毒性为0级。②材料在体内短期内有炎症反应是正常现象，12周后材料和周围组织结合良好，有良好的生物相容性。③蓖麻油基聚氨酯有一定的降解性，材料表面沉积的钙盐及羟基磷灰石的溶出，使材料具有一定的骨诱导性。

偏倚或不足：材料从动物体内取出时，未拍照宏观照片；做组织切片的同时未对材料做定性分析。

四川大学纳米生物材料研究中心，分析测试中心，四川省成都市 610064

董志红☆，女，1978年生，黑龙江省齐齐哈尔市人，汉族，四川大学纳米生物材料研究中心在读博士，主要从事生物医用材料的研究。
girlluyao@163.
com

通讯作者：李玉宝，教授，博士，四川大学纳米生物材料研究中心，分析测试中心，四川省成都市 610064 nic7504@scu.
edu.cn

国家重点基础研究发展计划(973计划) (2007CB 936102)*
课题名称：软骨与骨一体化修复纳米复合材料的构建与再生重建机理研究

摘要
目的：骨诱导再生膜材料对骨组织损伤后的重建和再生起着屏蔽和诱导的作用。拟进一步验证羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）/聚氨酯（Polyurethane，PU）复合骨诱导再生膜体内外的细胞相容性和降解性能。
方法：实验于2007-03/07在四川大学华西口腔医学国家重点实验室及四川大学纳米生物材料研究中心完成。①HA/PU复合膜制备成10 mm×10 mm大小，选择成熟的成骨细胞株MG63，体外细胞培养，在1，4，7 d内观察细胞在膜上的生长和增殖情况，并采用MTT法测定细胞的增殖率，判断其细胞的毒性。②把HA/PU复合膜制备成直径1.5 mm大小，选择健康的SD雌性大鼠3只，在脊柱一侧肌肉内埋植HA/PU复合膜，在1，4，12周后取出。以苏木精-伊红染色和Masson染色，组织切片观察材料的细胞相容性和自身降解性。
结果：①HA/PU复合膜上细胞增殖良好，无坏死和悬浮细胞出现，细胞在膜上的增殖能力均高于MG63的增殖能力（P < 0.05），细胞毒性为0级。②组织学切片观察，1~4周时材料在体内依旧是有形固体，材料被周围组织包裹，有巨噬细胞聚集，未见多核细胞，胶原纤维逐渐变得致密。12周时，材料发生降解，有纤维组织长入，周围与组织结合良好，未见有炎症发生。
结论：HA/PU复合膜具有良好的细胞相容性和自身降解性能，可作为骨组织诱导再生膜材料。
关键词：HA/PU复合膜；生物相容性；降解性；生物材料

董志红，李玉宝，邹琴，李吉东.羟基磷灰石/聚氨酯复合骨诱导再生膜的细胞相容性及自身降解性能[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1847-1850 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1847(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)10-01847-04

收稿日期：2007-12-18
修回日期：2008-02-29 (07-50-12-7039/Y·Y)

Cell biocompatibility and degradation of hydroxyapatite/polyurethane composite membrane in inducing osseous tissue regeneration

Abstract

AIM:The membrane materials for inducing bone regeneration play an important role in screening and inducing the rebuilding and regeneration of osseous tissue after wound. This study was designed to further verify cell compatibility and degradation of hydroxyapatite (HA)/polyurethane (PU) composite membrane to induce osseous tissue regeneration in vitro and in vivo.
METHODS: The experiment was conducted in the National Key Laboratory of West China College of Stomatology in Sichuan University and the Research Center for Nano-biomaterials in Sichuan University from March to July in 2007.①HA/PU composite membrane with a size of 10 mm×10 mm was prepared, and mature osteoblast strain MG63 were cultured in vitro, then the cell growth and proliferation on the surface of materials were observed at days 1, 4, 7. Cell proliferation rate by MTT method was evaluated so as to justify cytotoxicity.②HA/PU composite membrane with a diameter of 1.5 mm was prepared, and three healthy SD female rats were selected. HA/PU composite membrane was bedded at one side of vertebral column's muscle and fetched out at weeks 1, 4, and 12. The cell compatibility and degradation were detected with hematoxylin-eosin stain and Masson stain.
RESULTS: ①Cells proliferated well on the HA/PU composite membrane, no necrotic or suspended cells appeared, and the proliferation ability of cells on the composite membrane was higher than MG63 cells (P < 0.05), with the cytotoxicity of zero grade.②Histological sections revealed that, materials were at solid state and wrapped up by the surrounding around tissues in vivo in 1-4 weeks. Some macrophages aggregated around the materials and no apocytes appeared. Collagen fibers turned to dense gradually. In weeks 12, HA/PU composite membrane generated to degradation, some fibrous tissues ingrew. The surrounding tissues combine well with the materials and no inflammation was found.
CONCLUSION: HA/PU composite membrane has a good cell compatibility and degradation, and may be used as a membrane material to induce osseous tissue regeneration.

Dong ZH, Li YB, Zou Q, Li JD.Cell biocompatibility and degradation of hydroxyapatite/polyurethane composite membrane in inducing osseous tissue regeneration.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1847-1850(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1847 (ps).pdf]

0 引言

在20世纪80年代初期，膜诱导组织再生技术在组织工程学上应用越来越广泛，其最重要的特征是有充分的力学强度，能固定在某一部位，使组织在膜下生长，且有良好的生物相容性和可吸收性，在一定时间内能降解，不影响膜下组织的再生。缺点是该膜只有机械屏障作用，膜本身并不具有成骨诱导性。本实验采用这种技术，结合骨性材料或骨生长因子可制备出具有骨诱导再生的复合生物膜[1-4]，这将是研制具有骨诱导作用膜材料的发展方向。
纳米羟基磷灰石（Hydroxyaoatite,HA）由于和自然骨无机成分相似，具有较好的骨传导性[5]和骨诱导性[6]，能与骨组织形成牢固键合[7-8]。聚氨酯(Polyurethane,PU)高分子材料，具有良好的生物相容性、机械性能和降解性、不吸收人体蛋白及优良的物理性能[9-12]，结合HA和PU的特性，通过溶剂蒸发的方法，制备出具有骨诱导性的多孔HA/PU复合生物膜，该膜不但吸收性较好，力学强度高，溶剂蒸发后留下的微孔为细胞的生长提供了良好的微环境。本文通过体外细胞培养及体内肌肉埋植这两套评估体系[13]，对HA/PU复合膜的生物相容性和降解性进行探讨，为复合膜在骨诱导组织再生中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

设计：对比观察。
单位：四川大学纳米生物材料研究中心。
材料：实验于2007-03/07在四川大学华西口腔医学国家重点实验室及四川大学纳米生物材料研究中心完成。选择清洁级、毛色光泽、健康的SD雌性大鼠3只，体质量180~200 g,由四川大学华西医学动物中心提供（动物合格证号：川大动管第005号）。主要原料：蓖麻油为化学纯，1，4丁二醇为分析纯，均在110~120 ℃真空度为1.33 kPa左右减压、脱水后密封保存；甲苯-2，4二异氰酸酯为工业级，含量≥98.0％，密封于冰箱中冷藏保存；丙酮溶剂为分析纯；HA粉末为自制浆料[14]，至脱水烘干、研磨成粉，过200目筛，干燥密封备用。聚氨酯由本实验室使用蓖麻油原料合成，HA/PU复合膜的拉伸强度为65.7 MPa，断裂伸长率为90.3%，吸水率为22.58%，接触角为61.4°，材料的孔径为2.0 μm，Mr 130 000。骨肿瘤成骨样细胞MG63(武汉大学培养典藏中心)，MTT、胰蛋白酶、胶原酶(Sigma公司)。仪器：756型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为全部作者，评估为第二作者。
技术路线：
HA/PU膜的制备：将20 g蓖麻油加入到装有电动搅拌器、氮气保护的三颈瓶中，滴加甲苯-2，4二异氰酸酯，并逐渐升温到60 ℃，反应0.5 h；再按NCO/OH= 4/3，滴加计量的扩链剂1，4丁二醇，并用丙酮分散，反应0.5 h后，加入HA粉末，反应5 h后，得到乳白色的HA/PU液体，采用流延法，将其滴入玻板上，流延成膜，在40 ℃真空烘干12 h。取出后浸泡在无水乙醇下2 h，去除残留的小分子单体，切成 10 mm×10 mm和直径1.5 mm大小的薄膜，聚乙烯塑料袋包装，辐射灭菌，备用。
细胞培养及复合膜的细胞相容性检测：用吸管取出MG63融化的冻存液，注入离心管，加入5倍的含有体积分数为0.1的胎牛血清和 20 g/L抗生素（用三蒸水配制，每毫升培养液中加入200 μg青霉素和200 μg链霉素）的DMEM培养液中，于37 ℃、含体积分数为0.05 的CO2的湿化空气培养箱中进行原代培养。隔天换液，待细胞达到一定数量后，用含体积分数为0.002 5的胰蛋白酶和体积分数为0.000 2的胶原酶消毒液常规消化，传代。试验用细胞传代48~72 h生长最旺盛的细胞。把已消毒备好的HA/PU复合膜放入24孔板中，每孔滴加1 mL DMEM培养液，浸泡24 h润湿，移出孔内培养液，以2×106 L-1的细胞浓度接种MG63细胞，每孔滴加2 mL于样品表面，置于体积分数为0.05的CO2，37 ℃的恒温培养箱内继续培养，隔日换液。分别在不同时间内进行倒置显微镜下动态观察细胞贴壁情况、细胞形态、生长情况。
采用四唑盐比色分析方法（MTT法）检测MG63相对增殖率的影响，评定其细胞毒性。具体操作是：将孔板中的培养基移出，每孔中加入2 mL的MTT，37 ℃下培养箱中培养4 h，吸除孔内培养上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，震荡30 min，使结晶物充分溶解，用分光光度计在570 nm波长下测定吸光度值（A值），至少取4个孔板每3 d进行测定，每个孔板测定3次。把实验组值除以阴性对照组值的百分率即为细胞增殖率。最后转化为相应的细胞毒性等级[15]，标准为：0级为细胞增殖率≥100%，1级为75%~99%，2级为50%~74%，3级
为25%~49%，4级为1%~24%，增殖率≤0者为5级。动物试验过程：在大鼠臀部注射麻醉药速眠新（0.8 mL/kg）。背部脱毛，常规消毒、铺巾。在无菌条件下将其背部纵向切开约1 cm的口子，将大鼠脊柱一侧肌肉横向切开1.5 mm，将试样随机植入肌肉内，并用线缝合、消毒，注入青霉素40万U/d，连续3 d，并涂红霉素软膏。在植入1，4，12周后麻醉后处死动物，取植入试样及周围肌肉组织，肉眼观察试样周围组织情况，40 g/L甲醛固定，常规下脱钙、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色和Masson染色、制片、光镜观察。
主要观察指标：复合膜的特征，光镜下复合膜细胞的形态，复合膜细胞的增殖情况，肌肉埋植复合膜的生物相容性。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 9.0进行数据处理，数据以_x±s表示，行t检验。

2 结果

2.1 复合膜的特征 HA/PU复合诱导再生膜厚度为0.5~1.0 mm，HA含量为质量分数为0.13。吸收率达到22.58%，拉伸强度为65.7 MPa，断裂伸长率为90.3%，孔径尺寸0.5~2.0 μm，分子间形成牢固的键和。
2.2 复合膜细胞的形态观察 倒置显微镜下观察了不同时间内在HA/PU复合膜上细胞的生长形态状况，见图1。

当培养1 d时，在膜表面的细胞分布很少，细胞黏附在材料表面，轮廓清晰，呈梭形，形态正常。7 d时，细胞增殖良好，通过伪足彼此相连，和材料结合紧密，部分形成了单层的细胞层，并与细胞形成了材料－细胞复合体，说明材料对细胞的形态没有影响，表现出材料有良好的细胞生物相容性。
2.3 MTT测定 通过MTT法测得11 d内细胞的增殖变化见图2，随着时间的延长，两组吸光度值均显著增加但也有显著差异。通过统计学分析可以得出，复合膜的细胞增殖在1，4，7，11 d时间段均高于对照组，其细胞增殖率值分别149.36%，124.74%，104.21%，104.02%。

2.4 肌肉埋植生物相容性观察 手术动物均成活，进食、饮水均正常，伤口无红肿、化脓等现象，未见过敏、中毒等反应，手术伤口愈合良好，切口无感染。体质量日益增加。剖开后见材料被肌肉组织包覆良好，均未出现任何组织坏死、纤维化、囊性的改变，主体仍为有型固体。材料与周围肌肉组织学切片观察，材料植入初期(1~4周)，材料被周围肌肉组织包覆良好，材料界面清晰，周围组织中有巨噬细胞聚集，未见中性粒细胞及多核巨细胞等炎症细胞浸润，成纤维细胞和肌细胞分布其间，4周时，胶原纤维逐渐变得致密，见图3a，b。到12周时，材料发生了降解，材料周围组织并没有引起急性特异性病理学反应，见图3c，d。

3 讨论

由蓖麻油合成的聚氨酯有良好的力学强度和疏水性，由于蓖麻油官能度增加，反应的交联点增多，交联密度也加大，使材料从线性结构转化为体形结构，使分子的内聚能增加，分子间结合力增大，限制了基团之间的移动和旋转，同时，扩链剂1，4丁二醇在结构上也存在着对称性，提高了聚氨酯的结晶性。当和HA复合后，由于空间上发生了位阻效应，阻碍了PU结构的完整性，使复合膜的亲水性提高，这有利于细胞的黏附和生长。同时表面的微孔提供了细胞营养物质的交换和新陈代谢的输送。
不同材料的化学结构，影响着细胞的生长能力，如本实验中蓖麻油的羟基，它有较强的表面极性和表面亲水性，能增强细胞的黏附和生长。但是这两个参数之间，不同的学者，观点却有不同，一些学者认为有较好亲水性的材料，可优先吸附白蛋白，表现出良好的细胞生物相容性[16]。然而还有些学者认为成骨细胞在吸湿的材料表面并没有表现出细胞的良好生长，而是材料表面的极性能在生物学的过程中起着决定性的作用[17]。总之，细胞与材料的黏附与生长受多种因素影响，如细胞的疏水性、细胞表面电荷及细胞表面膜分子的侧向运动与细胞表面膜的柔韧性等，以及材料表面的物理、化学、几何性质、材料的亲疏水性及材料表面修饰，都会影响细胞的黏附与生长[18]。同时，HA/PU复合膜表面的微孔也会影响细胞的黏附和增殖，影响的具体情况还要依细胞的类型而定[19]，总之，细胞的类型和材料的形貌，都影响着细胞在材料表面的黏附和生长，这是个很复杂的生化过程，还需要继续探讨。
MTT细胞毒性试验是材料生物安全性评价标准中最重要的方法，它检测细胞存活和生长情况[20]。HA/PU复合膜细胞毒性为0级，符合植入人体生物材料的细胞毒性要求。但是在材料应用于人体时，还需要一系列生物学评估试验，如急性毒性、溶血、热源和皮肤致敏等试验指标，对材料的生物相容性作一系列确切的评估。
HA/PU复合膜在体内发生了不同程度的降解且生物相容性良好，这与材料本身密切相关，因其HA不具有毒性，PU也具有良好的生物相容性。合成聚氨酯的原料蓖麻油，其结构中含有烯键、酯键和羟基，易于发生水解、脂化等多种化学反应。在体内降解后断裂成短链的低分子量聚合物，同时，长的重复链和水解基团大多在非结晶区附近，易于降解。材料孔径扩大，面积缩小，部分材料被降解成小块，空间内有纤维结缔组织长入，周围有组织纤维膜形成，并进一步形成纤维囊腔结构，随降解时间的延长，HA中的钙离子和磷酸根离子释放，加之体内的微环境释放出的钙离子等，形成磷酸钙盐，从图上可看到有盐晶状小颗粒出现，这为骨诱导再生膜的修复和再生提供了很好的钙化作用，可加速骨膜的形成，这将在动物实验中进一步验证。总之，HA/PU复合膜表现出良好的生物相容性和降解性。
结论：HA/PU复合膜经过体内外试验评估表明，细胞贴壁良好，并出现了增殖、分化。有良好的细胞生物相容性，且细胞毒性为0级。材料在体内，短期内有炎症细胞反应等现象，但经过体内细胞的吞噬和排解后，12周材料周围和组织结合良好，并分解成小块状，随着PU的降解，材料表面沉积的钙盐以及复合材料中HA的溶出，使得表面出现许多盐晶状颗粒。材料在体内外表现出良好的生物相容性和降解性。

4 参考文献

1 Kikuchi M, Koyama Y, Yamada T，et al. Development of guided bone regeneration membrane composed of beta-tricalcium phosphate and poly (L-lactide-co-glycolide-co-epsilon-caprolactone) composites.Biomaterials 2004;25(28): 5979-5986
2 Liao S, Watari F, Zhu Y，et al. The degradation of the three layered nano-carbonated hydroxyapatite/collagen/PLGA composite membrane in vitro.Dent Mater 2007;23(9): 1120-1128
3 de Vicente JC, Recio O, Martín-Villa L，et al. Histomorphometric evaluation of guided bone regeneration around implants with SLA surface: an experimental study in beagle dogs.Int J Oral Maxillofac Surg 2006;35(11): 1047-1053
4 Liao S, Watari F, Zhu Y, et al. The degradation of the three layered nano-carbonated hydroxyapatite/collagen/PLGA composite membrane in vitro.Dent Mater 2007;23(9): 1120-1128
5 Kokubo T, Kim HM, Kawashita M. Novel bioactive materials with different mechanical properties.Biomaterials 2003;24(13): 2161-2175
6 Ripamonti U，Crooks J，Kirkbride AN. Sintered porous hydroxyapatites with intrinsic osteoinductive activity: geometric induction of bone formation. South Afr J Sci 1999；95 (8) :335-343
7 Ehrlich H，Krajewska B，Hanke T，et al. Chitosan membrane as a template for hydroxyapatite crystal growth in a model dual membrane diffusion system.J Membrane Sci 2006；273（1-2）:124-128
8 Lopatin CM，Alford TL，Pizziconi VB，et al. A new technique for characterization of pore structures in materials-application to the study of hydroxyapatite thin films. Mater Lett 1998；37（4-5）:211-214
9 Grad S, Kupcsik L, Gorna K,et al. The use of biodegradable polyurethane scaffolds for cartilage tissue engineering: potential and limitations.Biomaterials 2003;24(28): 5163-5171
10 Howard GT. Biodegradation of polyurethane: a review.Int Biodeterior Biodegradation 2002；49(4): 245-252
11 Lyu SP, Grailer T, Belu A,et al. Nano-adsorbents control surface properties of polyurethane. Polymer 2007；48(20): 6049-6055
12 Santerre JP, Woodhouse K, Laroche G,et al. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials.Biomaterials 2005;26(35): 7457-7470
13 Matteucci A, Formisano G, Paradisi S,et al. Biocompatibility assessment of liquid artificial vitreous replacements: relevance of in vitro studies.Surv Ophthalmol 2007;52(3): 289-299
14 Wei J，Li YB. Tissue engineering scaffold material of nano-apatite crystals and polyamide composite. Eur Polym J 2004；40（3）:509-515
15 Hao HP.Beijing：Zhongguo Biaozhun Chubanshe 2000：102，285-295，334-347
郝和平.医疗器械生物学评价标准及实施指南[S].北京：中国标准出版社，2000:102，285-295，334-347
16 Oehr C. Plasma surface modification of polymers for biomedical use. Nucl Instrum Methods Phys Res B: Beam Interact Mater Atoms 2003；208:40-47
17 Redey SA, Razzouk S, Rey C, et al. Osteoclast adhesion and activity on synthetic hydroxyapatite, carbonated hydroxyapatite, and natural calcium carbonate: relationship to surface energies.J Biomed Mater Res 1999;45(2): 140-147
18 Lieb E, Tessmar J, Hacker M，et al. Poly(D,L-lactic acid)-poly(ethylene glycol)-monomethyl ether diblock copolymers control adhesion and osteoblastic differentiation of marrow stromal cells.Tissue Eng 2003;9(1): 71-84
19 Lee SJ, Choi JS, Park KS，et al. Response of MG63 osteoblast-like cells onto polycarbonate membrane surfaces with different micropore sizes.Biomaterials 2004;25(19): 4699-4707
20 Xiao RD，Weng GX.Zhongguo Shengwu Yixue Gongcheng Xuebao 2007；26(3):458-461
肖荣冬,翁国星.血管组织工程生物支架材料细胞生物相容性实验研究[J].中国生物医学工程学报,2007,26(3):458-461