1柳州市人民医院口腔颌面外科，广西壮族自治区柳州市 545001； 2中南大学湘雅医院口腔颌面外科，湖南省长沙市 410008

雷荣昌☆，男，1967年生，湖南省沅江市人，汉族，2006年中南大学毕业，博士，副主任医师，主要从事口腔颌面外科疾病的研究。
Leroch@tom.com

通讯作者：翦新春，教授，硕士，中南大学湘雅医院口腔颌面外科，湖南省长沙市 410008 jianx-inchun@
hotmail.com

摘要
目的：生物衍生骨具有天然骨组织的三维立体孔隙-网架结构，有利于种子细胞的黏附、增殖。观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。
方法：实验于2005-03/2006-12在中南大学湘雅医院中心实验室完成。选择健康家兔16只，3月龄左右，其中1只提供骨髓，另15只作组织工程骨植入，分4，8，12周3个时间点，每个时间点5只。采用Ficoll密度梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞并诱导培养；采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架，与经诱导培养的骨髓基质干细胞体外复合培养后植入机体内，同时植入单纯猪松质骨支架做自身对照。
结果：纳入动物15只，均进入结果分析。采用X射线、苏木精-伊红染色、Masson三色染色及图像分析观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。①X射线观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体移植术后4周移植区周围可见少量散在分布的中密度影，8，12周时中高密度影逐渐向中心区增大。单纯猪松质骨支架移植术后各时间点移植区内均呈低密度影。②组织学观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后4周开始有新骨生成，支架开始降解；8周时新骨的形成及支架的降解都明显增加；12周时新骨继续增加，逐渐向成熟骨组织转变，可见少量哈佛系统，但骨小梁尚不典型，毛细血管增生明显，少量支架残留，未见炎症细胞。单纯猪松质骨支架植入后各时间点无新骨形成。③图像分析表明：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后新骨组织随时间延长而增加，而材料组织随时间延长而减少，但新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关（P > 0.05）。
结论：猪松质骨支架与骨髓基质干细胞复合移植后新骨逐渐形成，支架逐渐降解，是一种较理想的骨组织工程支架材料。
关键词：猪松质骨支架；骨髓基质干细胞；复合移植；成骨；生物材料

雷荣昌，翦新春.猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体兔体内成骨[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(10):1851-1855 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1851(ps).pdf]

中图分类号:R318.08
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)10-01851-05

收稿日期：2008-01-03
修回日期：2008-03-01 (08-50-1-49/Y·Y)

Osteogenesis of porcine cancellous bone scaffold/bone marrow stromal cells complex in rabbits

Abstract

AIM:Bio-derived bone possesses the three-dimensional pore-grid structure of natural bone tissues, and can improve the adhesion and proliferation of seed cells. This study was designed to investigate the osteogenesis and biological degradation of the porcine cancellous bone scaffold/bone marrow stromal stem cells complex in rabbits.
METHODS: This experiment was carried out from March 2005 to December 2006 in the Xiangya Hospital Center Laboratory of Central South University. Sixteen healthy rabbits, 3 months old, were recruited, and one rabbit was used for harvesting bone marrow while other 15 rabbits were randomly divided into three experimental groups for tissue-engineered bone implants at 4, 8 and 12 weeks, each group contained five rabbits. The bone marrow stromal stem cells of the rabbits were harvested with Ficoll density gradient centrifugation method for the induction of osteoblastic cells. Porcine cancellous bone scaffold was processed by physical and chemical methods, and compounded with bone marrow stromal cells cultured in vitro for the implantation. Meanwhile the implantation of single porcine cancellous bone scaffold was carried out as self-control.
RESULTS: Fifteen rabbits were involved in the analysis of results. X-ray, hematoxylin-eosin stain, Masson trichrome stain and image analysis were used to observe osteogenesis and degradation of porcine cancellous bone scaffold/bone marrow stromal stem cells complex in rabbits.①X-ray observation: A little medium density shadow distributed around the composite 4 weeks after implantation, and medium-high density shadow gradually enlarged to the centre area of the scaffold 8 and 12 weeks after implantation. There was a medium density shadow in the single scaffolds 4, 8, 12 weeks after implantation.②Histological observation: Four weeks after implantation, porcine cancellous bone scaffold/bone marrow stromal cells complex appeared new bone formation and scaffold's degradation, which significantly increased in 8 weeks; In 12 weeks, new bone continued to increase and changed gradually to mature bone, a small amount of the Havers system was seen, the trabecular bone was not typical, capillary proliferated obviously, few residual scaffolds were seen, and no inflammatory cells were observed. Single porcine cancellous bone had no new bone formation after implantation in each time point.③Image analysis: With the time prolonged, the new bone tissue increased, but the scaffold material reduced. There was non-linear correlation between the increase of new bone tissue and the decrease of scaffold material (P > 0.05).
CONCLUSION: In porcine cancellous bone scaffold/bone marrow stromal stem cells complex after implantation, the new bone forms gradually and the scaffold degrades gradually, so the complex is an ideal scaffold for bone tissue engineering.

Lei RC, Jian XC.Osteogenesis of porcine cancellous bone scaffold/bone marrow stromal cells complex in rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(10):1851-1855(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-10/10k-1851 (ps).pdf

0 引言

骨缺损的修复目前一般是采用自体骨和异体骨移植，但这两种方法均有各自的缺点，自体骨移植供区易发生疼痛和感染等并发症；异体骨移植存在移植免疫反应，导致骨移植失败。利用组织工程学原理和方法构建的组织工程骨移植可克服这些不足和弊端，为骨缺损的修复提供全新的思路和方法。骨组织工程需要具有多孔结构的支架，因为多孔网状结构可以允许骨组织细胞的长入，促进细胞在材料上的黏附和生长。文献报道生物衍生骨来源广泛，制备技术成熟，具有天然骨组织的三维立体孔隙-网架结构，有利于种子细胞的黏附、增殖[1-2]。骨髓基质干细胞在特定的诱导条件下能向成骨细胞转化。本实验采用猪松质骨支架与兔骨髓来源的骨髓基质干细胞构建组织工程骨植入有机体内，观察其成骨及支架的降解情况，探讨异种松质骨支架构建组织工程骨的可行性。

1 材料和方法

设计：对照观察。
单位：柳州市人民医院口腔颌面外科。
材料：实验于2005-03/2006-12在中南大学湘雅医院中心实验室完成。选择清洁级健康家兔16只，3月龄左右，雌雄不拘，体质量约2 kg，由中南大学动物学部提供（SCXK(湘)2005-0015）。其中1只提供骨髓，另15只作组织工程骨植入，分4，8，12周3个时间点，每个时间点5只。试剂：市售猪松质骨、质量分数为0.3的双氧水、0.6 mol/L盐酸、氯仿、甲醇、双蒸水、DMEM培养液、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C。仪器：DZF-6210真空干燥箱（南京绿登机械设备有限公司），GZX恒温箱（无锡索亚特试验设备有限公司），IMT-2型倒置相差显微镜（日本OLYMPUS），Forma深低温冰箱（-86 ℃，Freezer Forma Scientific），RSBiotech CO2培养箱（英国），Image-proPlus图像分析系统（Media Cybernetics 公司,美国），YJ-1450型超净工作台（苏州），Heliodent DS牙科X射线机（西诺德牙科设备有限公司）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施、评估为全部作者，评估者经过正规培训。
技术路线：
兔骨髓基质干细胞的获取及培养[3]：取健康3月龄左右家兔1只，全麻后无菌条件下取前腿骨，磷酸盐缓冲液冲洗，剪断，用DMEM液（每1 mL DMEM液中含500 U肝素）冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，装入50 mL离心管内，1 000 r/min，离心8 min，按体积比5∶3（细胞液：淋巴细胞分离液）混入淋巴细胞分离液，1 800 r/min， 15 min，收集中间层细胞，即为原代单核细胞层，内含内皮细胞和间质干细胞，制成单细胞悬液。原代细胞培养1 d后换液，将未贴壁的内皮细胞除去，培养3 d，长满皿底后，用质量分数0.002 5胰蛋白酶消化，按1∶2传代。然后将收集第4代和第5代的细胞以条件培养液（DMEM液中加入10 mmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C）培养，待长满皿底后，用质量分数0.002 5胰蛋白酶消化备用。
组织工程骨的构建：猪松质骨（髂骨）以37 ℃生理盐水浸泡洗尽表面，剔除表面软组织、骨膜及密质骨，修整成1 cm3大小骨块，再以37 ℃生理盐水冲洗，使骨块表面完全清洁。然后参照Urist等[4]方法进行处理得到猪松质骨支架，使用前以DMEM液浸泡24 h，每6 h更换DMEM液。收集诱导培养后的骨髓基质干细胞悬液，调整浓度为1×1010 L-1，先加100 μL培养液于6孔板的孔底，放入材料，向材料表面加100 μL细胞悬液，37 ℃，体积分数为0.05的CO2、饱和湿度静置培养2 h，取出后翻转，向另一面加100 μL细胞悬液，静置培养2 h， 加入培养液没过材料，37 ℃，体积分数为0.05的CO2、饱和湿度静置培养，以后每24 h更换培养液，7 d后进行体内植入实验。
组织工程骨植入：动物以质量分数0.03戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯卧固定于动物手术台上，修剪术区皮毛，络合碘常规消毒，在背部两侧各标记一术区，切开皮肤、皮下组织，于近头侧骶棘肌内形成一1.2 cm×1.2 cm×1.2 cm大小的肌袋，庆大霉素生理盐水冲洗伤口，将体外构建的组织工程骨植入一侧肌袋内，另一侧肌袋内植入支架材料，伤口分层缝合，敷料包扎，弹性绷带固定。术后常规进食，清洁环境中分笼饲养，肌注20万U青霉素，2次/d，连续3 d。分别于术后4，8，12周3个时间段作相关检测。
主要观察指标：①肉眼观察：主要观察术后各组动物的活动、进食、伤口愈合及组织工程骨在体内与周围组织的融合情况。②X射线观察：动物麻醉后处死，去除内脏后行X射线
检查，Heliodent DS牙科X射线机，曝光条件为：60 kV，7 mA，0.08 s，投照距离30 cm。观察实验部位骨质生长情况。③苏木精-伊红染色：标本经40 g/L甲醛固定24 h后甲酸脱钙3 h，梯度脱水，常规石蜡定向包埋，连续切片，厚度为5 μm，苏木精-伊红染色，光镜下观察，每一切片随机挑选5个视野，将图像输入HPIS-1000图像分析系统分别统计视野中新生骨和支架材料所占的面积百分比。④Masson三色染色[5]：切片脱蜡，苏木精-伊红染色5~10 min，盐酸乙醇分化，流水蓝化，蒸馏水洗，丽春红酸性品红液中染5~8 min，蒸馏水洗，质量分数0.01磷钼酸染1~3 min，直接入甲苯胺蓝液或亮绿液中 5 min，置60 ℃温箱中烘干，二甲苯透明，封固，光镜下观察。
统计学方法：由第一作者采用SAS 6.12及SPSS 11.5进行数据处理，数据以_x±s表示，行t检验。取α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入动物15只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 肉眼观察 术后各组动物的活动及进食均正常，伤口无红肿、渗液等炎性反应，Ⅰ期愈合，见图1。组织工程骨块外周有一紧密结合的纤维结缔组织壁，见图2。

2.3 X射线观察 松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体移植术后4周可见少量散在分布的中高密度影，主要位于周围，见图3a。8，12周时移植区内中高密度影逐渐向中心区增大，见图3b。松质骨支架移植术后各实验时间点移植区内均无高密度影。

2.4 苏木精-伊红染色 松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入术后4周，苏木精-伊红染色可见血管和纤维组织长满支架各个间隙，有少量炎症细胞，大量纤维样骨组织，细胞丰富，见图4a，支架开始降解，在支架的周边可见小片块状新骨。术后8周，植入的支架部分降解，在支架的周边和内部出现大片块状新骨，仍有少量炎症细胞，见图4b。术后12周，新骨继续增加，逐渐向成熟骨组织转变，可见少量哈佛系统，但骨小梁尚不典型，毛细血管增生明显，少量支架残留，未见炎症细胞，见图4c；松质骨支架植入术后4周，可见血管和纤维组织由外逐渐向支架内部间隙生长，随时间的延长，支架大部分被降解吸收，为纤维组织替代，炎症细胞减少，未见骨组织形成，见图4d。
2.5 Masson三色染色 支架材料呈红色，猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入术后4周可见少量蓝绿色纤维骨，主要位于红色支架周边，见图5a。术后8周时蓝绿色新生骨组织增多，与红色支架材料相互包绕，组织内细胞核明显，支架量减少，见图5b。术后12周时可见大量蓝绿色新生骨组织，部分组织内细胞核不明显，毛细血管增生明显，见图5c。
2.6 图像分析 每样本取5个玻片，每个玻片随机取5个视野，经图像分析统计新生骨组织和材料组织的面积百分比，测量结果见表1。从表1中可知，新生骨组织面积在3个时点是递增的，而材料组织面积在3个时点是递减的，进一步分析表明：①新生骨组织和材料组织在3个时点的两两比较，差异有显著性意义（P < 0.05）。②新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关（P > 0.05），见表2。③新生骨组织增加及材料组织减少在3个时点样本之间差异均无显著性（P > 0.05）。说明家兔个体差异对本试验无明显影响。

3 讨论

种子细胞是骨组织工程的基本要素之一，理想的种子细胞应具有以下几个特点:①取材方便，损伤小。②易定向分化为成骨细胞，传代繁殖能力强。③适应性强，植入后能保持成骨活性。骨髓、骨、骨膜均可作为种子细胞的来源。骨髓取材简单，通过穿刺即可获得，易为患者接受，具有来源丰富、安全简便、创伤小、供区无明显并发症、可以反复抽取等优点。骨髓成骨潜能来源于基质中的成纤维集落形成单位，它具有多向分化潜能，在一定条件下，可使其向成骨细胞分化的数目大大增加[6-7]。本实验将全骨髓采用Ficoll密度梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞，按文后参考文献[7]提供方法诱导培养骨髓基质干细胞并与猪松质骨支架复合培养，实验发现骨髓基质干细胞在猪松质骨支架上能很好黏附和分泌细胞外基质[8]。表明骨髓基质细胞具有很强的成骨潜能。
组织工程化成骨过程与生理状态下的骨形成机制大致相同，它是成骨细胞一系列功能的成功表达过程。成骨细胞接种到多孔支架材料内，早期是通过孔隙与外界进行营养交换，其后，来自宿主骨和周围组织的血管侵入组织工程骨的哈佛氏管内，为成骨细胞的活动提供营养。成骨细胞在支架材料的孔隙内增殖并表达成骨功能，分泌胶原和基质包埋细胞，形成软骨样组织充填支架材料的孔隙，在软骨的基础上再钙化形
成骨组织。与此同时，破骨细胞活动，在其周围形成吸收腔隙，为进一步成骨提供空间，如此交替进行，逐渐由新生骨替代移植骨[9]。植入材料修复骨缺损主要经过骨传导和骨诱导的方式来实现，组织工程骨在材料周围和内部均有新骨形成[10-12]。本实验中植入兔背部肌内的猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体，4周时的组织学观察发现材料周边有新骨形成，同时有松质骨支架出现降解吸收；8周时植入的支架降解增加，同时新骨量增加，在支架的内部也出现小片块状新骨；12周时在支架的周边和内部出现大片块状新骨。图像分析表明：新生骨组织在植入后3个试验时点是递增的，而材料组织在3个时点是递减的。同时X射线观察移植区内中高密度影逐渐向中心区增大，说明成骨细胞在材料内的成骨过程是材料吸收降解和细胞分泌基质钙化成骨的动态平衡过程，这一过程与机体内正常的骨代谢活动相同。
组织工程骨支架材料的降解性能主要取决于材料本身的理化特性和移植后机体局部的微环境。生物衍生类降解材料是经特殊处理的天然生物组织形成的材料，其组成和结构往往比较复杂，参与其体内降解的生物活性物质种类多、作用明显，生物衍生骨的主要成分是羟基磷灰石和胶原，它们于体外条件下降解较慢，在体内环境中，生物衍生骨的降解主要与破骨细胞、多核巨细胞的作用有关。局部新骨形成的同时，新骨周边的破骨细胞释放出溶酶体酶等成分，使植入的外源性支架材料网架分解、崩裂，从外周血游移至局部的巨细胞协助吞噬清除残存碎片，从而使植入的支架材料被逐渐降解、吸收[13]。Landi等[14]以异体冻干脱钙骨为填充材料进行上颌窦底升高术的临床研究结果表明，术后6个月受区可见大量新骨形成，植入的冻干脱钙骨已被完全替代吸收。 杨志明[1]认为理想的生物衍生骨降解速度与新骨形成的速度呈正相关关系，新骨形成快，则植入材料降解速度亦同时增快。本实验观察到松质骨支架植入术后4周，支架开始降解，8周是支架大部分降解，同时可见程度不等的炎性细胞浸润，12周时少量支架残留，未见炎症细胞，表明其降解是化学降解和生物降解的协同作用下发生降解的[15]。但新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关，作者认为有以下两方面原因：①炎性细胞浸润。②移植免疫反应。本实验在组织工程骨植入的4周和8周都有程度不等的炎性细胞浸润，炎性细胞的吞噬和移植免疫反应加速了支架的降解吸收。

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