课题背景：骨发育和骨折愈合是一个极其复杂的过程，血管化和骨形成是其中两个最基本环节，而且血管化的出现是早于骨形成的。这一复杂过程包含了数种细胞的迁移、增殖、分化、活化和这些细胞间的相互作用。本实验观察以1，25-(OH)2VitD3作为活性因子通过加强人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞间相互作用而加速血管化，进而促进组织工程骨的骨化。

应用要点：实验应用1，25-(OH)2 VitD3这一具有多重作用机制的细胞活性因子作用于成骨样细胞和血管内皮细胞两种种子细胞，分别通过1，25-(OH)2 VitD3对两种细胞单独的作用、对两种细胞间相互作用的加强、对各种生物活性因子作用的调节而发挥促进新生血管形成和骨形成的作用。减少了单一因子大剂量应用所带来的缺点。

偏倚或不足：作者因较长时间从事临床工作，对部分先进的仪器设备、检测方法了解不够，致使有部分可行的方法没有充分利用。如：更完善的免疫组织化学、免疫荧光技术，使珊瑚羟基磷灰石人工骨支架、成骨细胞、血管内皮细胞能以不同的颜色，显示其二维、三维情况下的共存情况及细胞功能；作为生物活性因子，1，25-(OH)2VitD3随细胞代谢的浓度变化情况；进一步研究该组织工程骨应用于临床的可行性。

1淄博市中心医院骨科，山东省淄博市 255036；2苏州大学第一附属医院骨科，江苏省苏州市 215006

李 涛☆，男，1970年生，山东省淄博市人，汉族，2005年苏州大学毕业，博士，副主任医师，主要从事脊柱外科及组织工程的研究。
litaozhongguo@
163.com

摘要
目的: 观察以1，25-(OH)2VitD3为活性因子，与人骨髓间质成骨细胞、脐静脉血管内皮细胞、珊瑚羟基磷灰石人工骨联合构建组织工程骨时，1，25-(OH)2VitD3在三维支架上对成骨细胞的作用及构建组织工程骨的体内快速血管化能力和异位成骨能力。
方法：(1)实验材料及对象：实验于2005-09/2006-03在苏州大学细胞与基因教研室完成。取SPF级6~8周龄BALB/cnu雄性裸鼠18只，体质量27~32 g，骨髓来源于健康成人(志愿者)、新生儿脐带取材时经产妇同意。(2)实验方法及评估：①体外实验：体外分离、培养人骨髓间质成骨细胞和脐静脉内皮细胞。人骨髓间质成骨细胞以5×108 L-1，脐静脉内皮细胞以2.5×108 L-1 按2∶1比例接种至经1，25-(OH)2VitD3处理过的珊瑚羟基磷灰石人工骨上，作为实验组；相同比例接种于单纯珊瑚羟基磷灰石人工骨上为对照组。体外培养3 d 后，检测骨钙素含量及碱性磷酸酶活性并始终行光学显微镜观察。②动物实验：18只裸鼠随机摸球法分为两组，9只植入实验组组织工程骨每侧1块，另9只植入对照组组织工程骨每侧1块。术后4，8，12周后取材，行常规组织学、扫描电镜观察，并行植入物新生血管定量分析和成骨的定量判断。
结果：纳入裸鼠18只，均进入结果分析。①倒置显微镜下珊瑚羟基磷灰石人工骨周边人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞均良好生长。组织工程骨构建3 d 后，骨钙素含量和碱性磷酸酶活性实验组明显高于对照组(P < 0.05)。②组织学观察可见，4周时，各组原始类骨组织均长入支架材料内部。8周时，骨组织成熟与微血管相伴出现。12周时，各组均有成熟骨组织出现。对照组在各时间点微血管量均少于实验组。扫描电镜观察，4周时，实验组大量细胞外基质将细胞包埋，材料表面可见大量微血管并有部分穿入材料内部。对照组虽然细胞外基质也较丰富，但微血管量少。8周时，实验组部分材料表面出现了束状条索样的类骨质结构，可见大量微血管相伴出现。对照组微血管量少。新生血管定量分析显示，4周及8周时两组比较，差异显著 (P < 0.05)；植入物成骨的定量判断，8周及12周时两组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。
结论：1，25-(OH)2VitD3作为活性因子通过加强人骨髓间质成骨细胞与脐静脉内皮细胞之间的相互作用，增强了构建的组织
工程骨的快速血管化能力和异位成骨能力。
关键词：组织工程骨；人骨髓间质成骨细胞；脐静脉血管内皮细胞；异位成骨；血管化

李涛，臧洪敏，唐天驷.1，25-(OH)2VitD3促进组织工程骨的血管化和骨化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2001-2005 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2001(ps).pdf]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02001-05

收稿日期：2007-08-08
修回日期：2007-11-02
(07-50-8-4289/WL·Q)

1，25-(OH)2VitD3 promotes osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone

Abstract

AIM:To study the osteogenesis and vascularization of artificial bone composite of coral hydroxyapatite, 1,25-(OH)2VitD3, human marrow stromal osteoblast and umbilical vein endothelial cells.
METHODS: ①Experiments were performed at the Department of Cell and Gene of Soochow University from September 2005 to March 2006. Eighteen BALB/cnu male SPF nude mice aged 6-8 weeks weighting 27-32 g were selected. Bone marrow was collected from healthy voluntary adults. Umbilical cords in neonates were collected with the agreement of the parturiens.②Human marrow stromal osteoblast and umbilical vein endothelial cells were harvested in vitro. Human marrow stromal osteoblast (5×108 L-1) and umbilical vein endothelial cells (2.5×108 L-1) were incubated at the ratio of 2∶1 in coral hydroxyapatite artificial bone that was coated with 1，25-(OH)2VitD3 as an experimental group. Those were incubated in only coral hydroxyapatite artificial bone as a control group. Three days later, osteocalcin levels and alkaline phosphatase activities were determined under a light microscopy. Eighteen nude mice were randomly assigned into two groups. Nine in the experimental group were implanted with a tissue-engineered bone at one side. Nine in the control group were implanted with a tissue-engineered bone at one side. 4, 8 and 12 weeks after the surgery, the retrieved scaffolds and cells were examined histologically and by a scanning electron microscopy, and the vascular area and the new-formed bone area were measured quantitatively.
RESULTS: Eighteen nude mice were involved in the result analysis. ①Human marrow stromal osteoblast and umbilical vein endothelial cells grew well around coral hydroxyapatite artificial bone under a invert microscope. Three days later, osteocalcin levels and alkaline phosphatase activities were higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). ②Histological observation showed that in the fourth week; Primitive bone tissue grew into the stent. In the eighth week, mature bone and conspicuous microvessel were found. In the twelfth week, mature bone appeared in either group. The amount of microvessel was less in the control group than the experimental group. Scanning electron microscope showed that a mass of extracellular matrix coated the cells in the experimental group, and a large quantity of microvessel was seen in the surface of the materials and some grew into the material in the fourth week; Extracellular matrix was rich in the control group, but the microvessel count was less. In the eighth week, fascicular cord-like osteoid was found in partial materials, with a large number of extracellular matrix and microvessel in the experimental group. Microvessel count and mature bone was less in the control group. Quantitative analysis of neovascularization showed that there were significant differences between the two groups in the fourth and eighth weeks (P < 0.05). There were significant differences in the implant osteogenesis between the two groups in the twelfth and eighth weeks (P < 0.05).
CONCLUSION: The 1，25-(OH)2VitD3 can improve the ability of ossification and vascularization of tissue-engineered bone by strengthening the association of human marrow stromal osteoblast and umbilical vein endothelial cells.

Li T, Zang HM, Tang TS.1，25-(OH)2VitD3 promotes osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2001-2005(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2001(ps).pdf]

0 引言

随着组织工程化骨研究的深入及其临床应用范围逐渐拓宽，促进组织工程化骨植入体内后的快速血管化已成为新的研究热点。联合应用成骨样细胞和血管内皮细胞作为种子细胞构建组织工程骨是促进组织工程所构建骨组织新生血管形成的方法之一[1]。 1，25-(OH)2 VitD3可以加强成骨细胞与血管内皮细胞之间存在的相互作用，已有学者观察了成骨细胞和血管内皮细胞体外共培养时1，25-(OH)2VitD3的作用[2]。本实验观察以1，25-(OH)2VitD3作为活性因子通过加强人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞间相互作用而加速血管化，进而促进组织工程骨的骨化。

1 材料和方法

设计：完全随机分组设计，随机对照观察。
单位：淄博市中心医院骨科。
材料：实验于2005-09/2006-03在苏州大学细胞与基因教研室完成。取SPF级6~8周龄BALB/cnu雄性裸鼠18只，体质量27~32 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供（动物合格证号：SCXK(沪)2003-0002）。骨髓来源于健康成人(志愿者)、新生儿脐带取材时经产妇同意，治疗方案经医院医学伦理委员会批准。
主要试剂及仪器：低糖DMEM培养液、胰蛋白酶 (Gibco公司)；小牛血清(Hyclone公司)；1，25-(OH)2VitD3 (Sigma公司)；VWF 一抗、二抗(武汉博士德生物制品有限公司)；放射免疫检测试剂盒(北京原子高科核技术应用股份有限公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；珊瑚羟基磷灰石人工骨(北京意华健科贸有限责任公司)；JSM-5900型扫描电镜（日本电子株式会社）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、三作者，干预实施为第一、二作者，评估为全部作者，评估者受过相关专业培训，采用盲法评估。
方法：
人骨髓间质成骨细胞和脐静脉内皮细胞的体外分离和培养：无菌条件下抽取健康成人骨髓3~5 mL 后，按王永红等[3]介绍方法对人骨髓间质成骨细胞进行体外分离、培养和诱导。无菌条件下获取健康新生儿脐带约20 cm，按胡学峰等[4]介绍方法对人脐静脉内皮细胞进行体外分离、培养和鉴定。
组织工程骨的构建：将珊瑚羟基磷灰石人工骨修剪成 5 mm×5 mm×3 mm 大小块状，分为两组。实验组珊瑚羟基磷灰石人工骨浸泡于2×10-5 mol/L 的1，25-(OH)2VitD3中，抽真空，使1，25-(OH)2VitD3附着于珊瑚羟基磷灰石人工骨支架上，所有材料均置入24孔细胞培养板内备用；人骨髓间质成骨细胞以5×108 L-1、脐静脉内皮细胞以2.5×108 L-1 按朱伟南等[5]报道的成骨细胞与血管内皮细胞共培养时最佳的2∶1比例接种至经1，25-(OH)2VitD3处理过的珊瑚羟基磷灰石人工骨上。对照组人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞按2∶1比例接种至单纯珊瑚羟基磷灰石人工骨上。
骨钙素含量测定：细胞接种3 d 后，分别收集每组各3孔的细胞培养液，冻干。将各组冻干培养液复融，再同标准品均加入抗-骨钙素、125Ⅰ各100 μL，4 ℃ 放置20 h。加入免疫分离剂0.5 mL，4 ℃，3 500 r/min 离心25 min。弃去上清液，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品骨钙素含量。
碱性磷酸酶活性测定：细胞接种3 d 后，每组取3块人工骨，以2.5 g/L 胰蛋白酶消化，所得细胞用磷酸盐缓冲液冲洗2次后加入培养液1 mL，用吸管轻轻吹打混匀，移入1.5 mL 离心管内，4 ℃ 低温离心(3 000 r/min，5 min)，再用磷酸盐缓冲液清洗3次，最后一次弃上清液后加入200 μL 磷酸盐缓冲液，轻轻吹打均匀后-20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次，每组得到3份细胞裂解产物。细胞裂解产物利用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞的碱性磷酸酶活性。
手术方法：小鼠采用氯胺酮(40 mg/kg)腹腔麻醉，背部消毒，切开皮肤、皮下，潜行分离。组织工程骨体外培养3 d 后，植入裸鼠背部皮下两侧。18只裸鼠随机摸球法分为两组，9只植入实验组组织工程骨每侧1块，另9只植入对照组组织工程骨每侧1块。术毕将裸鼠放入无菌环境下分笼饲养，于术后4，8，12周每组分别取3只裸鼠麻醉后处死，行常规组织学、扫描电镜观察，并行植入物新生血管定量分析和成骨的定量判断。
主要观察指标：①组织工程骨构建后细胞的生长、功能情况。②组织工程骨裸鼠体内的血管化、骨化情况。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件包完成统计处理。实验数据以_x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 纳入裸鼠18只，术后切口无感染，进食、活动正常，均进入结果分析，无脱落。
2.2 倒置相差显微镜观察组织工程骨构建后细胞的生长情况 两组均可见珊瑚羟基磷灰石人工骨周边人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞生长良好。实验组共培养3 d 后，细胞已于珊瑚羟基磷灰石人工骨上展开，并开始分泌细胞外基质，见图1a。对照组细胞外基质分泌量少，见图1b。

2.3 各组骨钙素含量、碱性磷酸酶活性测定 见表1。

2.4 组织学观察新生血管及新骨形成情况 所有切片均可见未被吸收的珊瑚羟基磷灰石人工骨因脱钙溶解所占据的空间，其中新生骨组织长入孔洞内。4周时可见原始类骨组织伴随微血管长入孔洞内，形成的原始骨组织钙化程度低，实验组微血管量较对照组丰富，见图2。

8周时可见大片状幼稚新骨形成，相互连接形成原始层板骨，原始骨组织的成熟是伴随微血管出现的，见图3。

12周时，骨组织均基本成熟，并占据珊瑚羟基磷灰石人工骨部分吸收后遗留的空间；成骨细胞位于骨陷窝中，周围有大量骨基质呈淡紫色，局部可见Ⅰ型胶原存在，组织学表现已接近成熟骨，可见典型的骨单位及其正中的毛细血管成分；实验组明显优于对照组，见图4。

哈佛管清晰可见，形成多个骨化中心，骨小梁、骨岛遍布其中，可见成熟板层骨、立方状排列整齐的活性成骨细胞。
2.5 扫描电镜观察新生血管及新骨形成情况 贴附在支架上的细胞伪足伸入材料的孔隙，伪足样突起相互接触，周围有大量条索细胞外基质，编织成网状；细胞大多呈多角形、扁平状、伪足长短不一。4周时，实验组大量细胞外基质将细胞包埋，材料表面可见大量微血管并有部分穿入材料内部，见图5a。对照组细胞外基质分泌量和微血管数量明显少，见图5b。

8周时，实验组部分材料表面出现了束状条索样的类骨质结构，球形细胞则堆积于柱状细胞和鳞片状细胞之间或其上，细胞外基质丰富，见图6a。对照组微血管量少，类骨质成熟度差，见图6b。

2.6 新生血管定量分析 实验组4周时为（28.74±7.81）%，8周时为(24.66±7.38)%；对照组4周时为(19.52±4.57)%，8周时为(17.84±5.22)%；4周及8周时两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.7 植入物成骨的定量判断 植入物的成骨程度评分：实验组形成软骨和新骨的程度较对照组好，8周时为(3.1±0.52)，12周时为（4.63±0.55）；对照组8周时为 (2.3±0.59)，12周时为（3.53±0.62）；8周及12周时两组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

3 讨论

本实验发现体外培养时，两组均可见珊瑚羟基磷灰石人工骨周边人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞生长良好，即珊瑚羟基磷灰石人工骨与人骨髓间质成骨细胞、脐静脉内皮细胞生物相容性良好。构建组织工程骨后，实验组碱性磷酸酶活性、骨钙素含量均高于对照组，这说明成骨细胞与血管内皮细胞三维支架上共培养时，1，25-(OH)2VitD3可进一步加强成骨细胞的功能。组织工程骨植入裸鼠皮下后，在不同的时间点，形态学上实验组的血管化优势及与之相伴的新生骨组织的成熟程度均明显优于对照组。在各时间点，实验组植入物成骨的定量判断及新生血管定量分析也均高于对照组。形态学、统计学结果均表明加入1，25-(OH)2 VitD3后，所构建的组织工程骨新生血管形成能力、成骨能力加强。血管化程度与新骨形成能力呈正相关。
尽管自体骨移植依然是植骨术的金标准，但该技术存在许多缺陷，如：自体骨供给量有限、取骨致失血量增加、供区疼痛、附加创伤的愈合等问题[6]。自体骨移植的替代物之一是组织工程构建的组织工程骨。在完成较大骨缺损修复时，组织工程骨植入体内后的快速血管化非常重要。超过几个立方毫米的组织，如果没有滋养血管提供营养物质和氧气，仅靠渗透作用是无法存活的。Petite等[7]应用骨髓间质细胞与支架材料复合的组织工程化骨修复羊25 mm骨缺损时，只有3/7的实验动物达到临床愈合。
骨发育和骨折愈合是一个极其复杂的过程，血管化和骨形成是其中两个最基本环节，而且血管化的出现是早于骨形成的[8]。这一复杂过程包含了数种细胞的迁移、增殖、分化、活化和这些细胞间的相互作用。在这些细胞中，成骨细胞和血管内皮细胞是最重要的。成骨细胞与血管内皮细胞之间存在相互作用。一方面，内皮细胞能够产生多种促骨生长因子，如骨形态发生蛋白、白细胞介素1和白细胞介素6、集落刺激因子、前列腺素、内皮素1等作用于骨细胞，调节骨细胞功能，促进骨组织生长；另一方面，骨组织发现有血管内皮细胞生长因子 mRNA的表达及碱性成纤维细胞生长因子的存在，血管内皮细胞生长因子被认为是最强的血管生成刺激因子，而碱性成纤维细胞生长因子是最早发现的促血管生成因子。因此，将血管内皮细胞生长因子[9-10]和碱性成纤维细胞生长因子[11]作为活性因子刺激构建组织的血管化引起了广泛的兴趣。但是，前期临床试验发现，这些因子的有效治疗剂量在不同的报道中相差上百倍[12]，而这些因子转基因治疗时的潜在生物学危害也限制了其应用[13]。所以，构建组织工程骨时联合应用血管内皮细胞和成骨细胞成为一个理想之选[14]。
1，25-(OH)2VitD3是维生素D的活性代谢产物。近年来研究发现，它能抑制细胞增殖，诱导细胞分化和调亡[15]。但是，不像对于其他细胞那样，1，25-(OH)2VitD3对成骨细胞起到的是抑制凋亡的作用[16]。对于体外培养的成骨细胞，1，25-(OH)2VitD3可以刺激其骨钙素、碱性磷酸酶产生，而促进成骨细胞成熟、加强其功能活性[17]。1，25-(OH)2VitD3还可以延长其他因子经成骨样细胞中JAK2/STAT5途径的信号传递[18]。
在骨修复过程中，可以发现许多特定生长因子的表达[19]。但是，在动物模型的骨痂中，它们都以相同的时间、空间模式出现在长骨的发育中[20]。在这一复杂过程中，每种因子只在其中发挥部分作用。而1，25-(OH)2VitD3并不直接影响新生血管的形成。当成骨细胞和血管内皮细胞共培养时，作为生物活性因子，1，25-(OH)2 VitD3可以加强成骨细胞与血管内皮细胞间的相互作用。成骨细胞中结构性地表达血管内皮细胞生长因子mRNA，而且这一过程可被1，25-(OH)2VitD3加强，致使条件培养基中血管内皮细胞生长因子分泌量增加。成骨样细胞通过产生血管内皮细胞生长因子促进内皮细胞增殖，而活化的内皮细胞通过产生骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子Ⅰ和内皮素1等促骨生长因子促进成骨样细胞的增殖和分化。骨形态发生蛋白应用于骨组织工程，除具有加速骨形成的作用外，还具有血管源性活性因子的作用并可减少感染[21]。此外，血管内皮细胞中有血管内皮细胞生长因子受体的表达，当血管内皮细胞与成骨细胞共培养时，这一过程延长，并被1，25-(OH)2VitD3进一步加强。不论成骨细胞还是血管内皮细胞都有1，25-(OH)2VitD3和胰岛素样生长因子Ⅰ的受体。1，25-(OH)2VitD3既能增加成骨样细胞胰岛素样生长因子Ⅰ受体的数量，又可刺激血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子受体基因的表达水平。所以1，25-(OH)2VitD3可以通过成骨样细胞与血管内皮细胞间的相互信息传递系统增强这些细胞的功能。此外，1，25-(OH)2VitD3对成骨细胞与血管内皮细胞间相互作用的加强还与血小板衍化生长因子的分泌增多有关[2]。
该方法将1，25-(OH)2VitD3这一具有多重作用机制的细胞活性因子作用于成骨样细胞和血管内皮细胞两种种子细胞，分别通过1，25-(OH)2VitD3对两种细胞单独的作用、对两种细胞间相互作用的加强、对各种生物活性因子作用的调节而发挥促进新生血管形成和骨形成的作用。减少了单一因子大剂量应用所带来的缺点。与支架材料预血管化相比，不增加机体额外创伤，不受局部血管条件限制，对组织工程骨成骨能力、血管化能力的加强效果确切，是一种较为理想的促组织工程骨快速血管化、骨化技术。
1，25-(OH)2VitD3作为生物活性因子，可以通过加强成骨细胞与内皮细胞间的相互作用，进一步增强成骨细胞的功能、促进所构建的组织工程骨的新生血管生成和骨化。

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