去细胞同种异体神经种植许旺细胞的体外实验：组织工程化人工神经应用的可行性

去细胞同种异体神经种植许旺细胞的体外实验：组织工程化人工神经应用的可行性�

韩金豹1，高宏阳2，赵宝辉1，韩久卉1，陈居文3

课题背景：本实验最早酝酿于2002年，是“胎兔雪旺细胞桥接体复合体修复周围神经缺损的实验研究”课题的组成部分。在前期的研究中分别探讨了神经生长因子对胎兔许旺细胞培养的影响以及聚氧乙烯辛烷基酚(TritonX-100)制备去细胞的神经移植体。

应用要点：实验将胎兔许旺细胞作为种子细胞，减少了细胞移植后的免疫排斥反应，在细胞培养过程中加入神经生长因子，获得了大量高纯度的许旺细胞，有效解决了种子细胞问题。实验过程中也观察到胎兔许旺细胞在体外的确能在经去细胞处理的同种异体神经段中生长、繁殖，并沿保留完整的基底膜管纵形排列生长，这些都为下一步去细胞同种异体神经桥接复合体的体内移植提供了很好的研究基础。

同行评价：文章体外实验证实，胎兔坐骨神经培养的许旺细胞能用在成年兔坐骨神经制备的去细胞神经中生长良好，为组织工程化人工神经的构建提供了有效的方法，对研究神经缺损的解决方法具有启发作用。不足之处在于未能探讨许旺细胞与移植物的有机结合过程。

1河北医科大学第三医院手外科，河北省石家庄市 050051；2河北医科大学第一医院骨科，河北省石家庄市 050031； 3天津市第四中心医院骨二科，天津市 300140

韩金豹，男，1952年生，河北省衡水市人，汉族，1978年河北医科大学毕业，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事周围神经损伤的研究。
hanjinbao1952 @yahoo.com.cn

摘要
目的:许旺细胞作为种子细胞在组织工程化人工神经制备中的作用已被学术界所接受。胎兔的神经系统已发育完善，而免疫系统尚未成熟，探讨将胎兔许旺细胞植入去细胞同种异体神经桥接体制备组织工程化人工神经修复周围神经缺损的可行性。
方法：实验于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院完成。①实验材料：SPF级怀孕28 d的新西兰白兔2只、成年新西兰白兔1只。②实验过程：包括胎兔许旺细胞培养、去细胞神经桥接体的制备以及许旺细胞与去细胞神经桥接体的体外种植3个步骤。使用双酶消化法培养许旺细胞并将其种植于经3% TritonX-100作用96 h后的同种异体神经中。③实验评估：分别于培养的1，3，5 d通过石蜡切片苏木精-伊红染色观察许旺细胞在桥接体中的生长情况。
结果：①采用双差速贴壁法去除绝大部分成纤维细胞后在细胞培养的初期使用阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，后期培养液中加入神经生长因子促进许旺细胞生长能获取大量许旺细胞且纯度可达90%以上。②用3%Triton X-100作用96 h可去除周围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构，并且对神经基底膜主要成分－层粘连蛋白无明显影响。③采用胎兔坐骨神经培养的许旺细胞能在用成年兔坐骨神经制备的去细胞桥神经接体中生长良好，并且有迁移成行的特性。
结论：种植许旺细胞重新细胞化的去细胞同种异体神经将可能成为一种理想的组织工程化人工神经。
关键词：周围神经；组织工程；化学萃取；许旺细胞

韩金豹，高宏阳，赵宝辉，韩久卉，陈居文.去细胞同种异体神经种植许旺细胞的体外实验：组织工程化人工神经应用的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2006-2010
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2006(ps).pdf]

In vitro study of populating Schwann cell into acellular nerve allograft: Feasibility of applying tissue engineered artificial nerve

AIM:It is universally accepted that Schwann cells are the seed cell for preparing tissue engineered artificial nerve. Fetus rabbit nerve system has been developed completely, and immune system is still immature. This study discussed the feasibility of populating fetus rabbit Schwann cells into acellular nerve bridging allograft and preparing tissue engineered artificial nerve to repair the peripheral nerve defects.
METHODS: The experiment was carried out in the Third Hospital of Hebei Medical University between March 2005 and March 2006.①Two New Zealand rabbits of SPF grade, 28-day pregnancy, and one adult New Zealand rabbit.②Experimental managements included three steps: culture of the fetus rabbit Schwann cells, preparation of acellular nerve bridging and in vitro graft of Schwann cells and acellular nerve bridging. Enzyme digestion (trypsin/collagenase) was applied to culture Schwann cells, which were then micro-injected into nerves that had been treated with 3% TritonX-100 for 96 hours.③The paraffin section was sampled at 1, 3, 5 days of culture and the growth of Schwann cells in bridging graft was observed by hematoxylin-eosin staining.
RESULTS: ①We achieved a large amount of high purity (above 90%) Schwann cells by the nerve growth factor, which promoted Schwann cells, added in the culture medium at the latter stage, and double 30-min differential adhesion culture and Arab-c prohibition methods at the early stage of culture were applied to remove fibroblasts.②Schwann cells, axons and myelin sheaths could be successfully removed after treated by 3% Triton X-100 for 96 hours. The basal lamin tubes and collagen fibers structure remained intact. Moreover, the main component of nerve basement membrane-laminin was not damaged.③Schwann cells from fetus rabbit sciatic nerve grew well in the acellular nerve bridge graft of adult rabbit, and migrated in rows.
CONCLUSION: The acellular nerve allografts populated Schwann cells may be an ideal way to prepare tissue-engineered nerve graft.

Han JB, Gao HY, Zhao BH, Han JH, Chen JW. In vitro study of populating Schwann cell into acellular nerve allograft: Feasibility of applying tissue engineered artificial nerve.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2006-2010(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2006(ps).pdf]

周围神经长段缺损的修复一直是临床治疗中的难题。组织工程化人工神经无疑是解决这一难题的金钥匙。许旺细胞作为种子细胞在组织工程化人工神经制备中的作用已经被越来越多的学者所接受。胎兔的神经系统已发育完善，而免疫系统尚未成熟，用胎兔周围神经培养许旺细胞可以减少细胞移植后的免疫排斥反应，弥补自体许旺细胞的不足与来源受限。经过化学萃取的同种异体神经在有效去除抗原成分的同时保留了其完整的纤维支架结构并保留了完整的基底膜，与其他神经替代材料相比具有天然的神经三维空间结构。但是，胎兔许旺细胞能否在经去细胞处理的异体神经段中生长、繁殖并发挥其功能、技术上如何有效可靠的将许旺细胞植入神经段中，本实验通过去细胞同种异体神经种植胎兔许旺细胞的体外实验观察研究为同种异体神经移植修复周围神经缺损的实验作准备。

设计：单一样本观察。
单位：河北医科大学第三医院。
材料：实验于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室(BSL-2)完成。主要试剂：DMEM培养液、胰酶为Gibco公司产品；神经生长因子为北大之路生物工程有限公司产品；胎牛血清、兔抗S-100蛋白抗体、TritonX-100为美国Sigma公司产品；主要仪器：超净工作台为苏州安泰空气技术有限公司生产，BCM-1000型生物洁净工作台；CO2培养箱为美国Forma Scientific公司生产；高速离心机为北京医用离心机厂生产，LDC4-0.8。动物：SPF级怀孕28 d的新西兰白兔2只、成年新西兰白兔1只，均为河北医科大学动物中心提供（许可证号：医动字第04037）。
设计、实施、评估者：实验设计及实施为第一、二作者，评估为第三、四作者，实验收集资料为第五作者。所有作者均经过科研培训。
技术路线：
胎兔许旺细胞培养：取怀孕28 d新西兰白兔，耳缘静脉注入20 mL空气处死，手术区常规消毒、铺无菌巾，迅速剖腹取胎兔。将胎兔浸入体积分数为0.75的乙醇约5 min后无菌盐水冲洗3遍，在无菌条件下取坐骨神经，在手术显微镜10倍视野下去除神经外膜，Hank’s液冲洗5遍。显微剪刀将剥离好的神经剪碎后加入2 g/L胰酶，37 ℃ 水浴摆箱中消化30 min。加入体积分数为0.2的血清终止消化后1 000 r/min离心5 min，弃上清液。往离心管中加入1 g/L胶原酶,吸管轻轻吹打均匀，37 ℃ 水浴摆箱中再消化30 min，120目筛网过滤，Hank’s液冲洗。将过滤液1 000 r/min离心5 min，弃上清液后加入含体积分数为0.2血清的F12/DMEM培养液，吸管吹打均匀。将细胞悬浊液分置于覆有已干燥的0.5 g/L多聚赖氨酸的6 cm培养皿中，37 ℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养30 min后将细胞悬液移至另一培养皿培养。30 min后再更换培养皿。以双30 min差速贴壁差贴走大部分成纤维细胞。培养24 h后往培养液中加入阿糖胞苷（终末浓度为1× 10－5 mmol/L），阿糖胞苷作用48 h后换成含神经生长因子 (终末浓度为40 μg/L)培养液[1]。以后每隔两三天更换1次培养液，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。培养后的许旺细胞用抗S-100免疫组织化学鉴定并计算其浓度。
许旺细胞纯度：于10×20倍显微镜下随机取10个不同视野，以蓝色细胞核计为总细胞数，以胞浆显色者（棕褐色）为阳性细胞。阳性细胞总数/总细胞数×100%=阳性细胞百分数，即许旺细胞的纯度。
去细胞神经桥接体的制备[2]：取成年新西兰白兔1只，分别于梨状肌下缘水平以远切取双侧坐骨神经，显微镜下剥除周围组织，剪成约每段3 cm后置于4 ℃ 蒸馏水中静置6 h，以使细胞和髓鞘在低渗液体中膨胀、细胞破裂，使之易于TritonX-100的渗透；再将神经段放入3% TritonX-100水溶液中静置12 h；然后置于蒸馏水中振荡、漂洗6 h，以使溶于水的TritonX-100膜蛋白体复合物充分脱离神经干。如此反复，TritonX-100作用时间共为96 h。萃取好的神经段Hank's液中4 ℃ 保存。
许旺细胞与去细胞神经桥接体的体外种植：将培养好的许旺细胞以1×107 L－1的浓度用100 μL的微量注射器注入去细胞神经段的中央，注射后将神经段置入含体积分数为0.2血清的DMEM培养液中继续培养，分别于培养后的第1，3，5天取出神经段通过苏木精-伊红染色观察细胞在桥接体中的生长情况。
标本处理：①萃取后的神经中线两侧分别切取2段 2 mm神经，一段神经40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋、纵形切片，行苏木精-伊红染色、层粘连蛋白免疫组织化学染色；另一段神经25 g/L戊二醛固定。②扫描电镜样品的制备与观察：样品25 g/L戊二醛固定后用体积分数为0.3~1的梯度乙醇脱水，叔丁醇置换后冻结干燥，干燥的样品黏附在样品托上，经IB-3型真空离子镀膜仪镀金处理，用HITACHIH S-3500N型扫描电镜观察、采集图像。③重新细胞化的去细胞神经段也分别于中线两侧切取2段2 mm标本，40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋分别纵形、横行切片，行苏木精-伊红染色。
主要观察指标：①许旺细胞培养结果。②去细胞神经桥接体结果。③重新细胞化的去细胞神经桥接复合体的观察结果。

2.1 许旺细胞培养结果培养的许旺细胞约于第7天爬满6 cm细胞培养皿，倒置显微镜下观察：许旺细胞形态为梭形，有突起，多为双极，偶见3个细胞突起。胞核明显，核呈卵圆形。细胞呈端对端、肩并肩、旋涡状或栅栏样排列生长。少量成纤维细胞呈“煎鸡蛋”样，胞体较许旺细胞大，扁平状，外形不规则，突起短而多，核仁明显，有2到3个核仁。颜色较许旺细胞浅。神经生长因子作用48 h后许旺细胞生长旺盛，见图1。

许旺细胞的免疫组织化学鉴定：将特制的盖玻片放入细胞培养皿中，待细胞爬满玻片后将玻片取出，Hank’s液洗净，冷丙酮固定约 5 min，抗S-100蛋白抗体浓度梯度1∶100按ABC法染色处理。许旺细胞胞质及突起均呈现咖啡色免疫阳性附和物，见图2。许旺细胞与倒置显微镜下观察到的活细胞形态一致，细胞边界清楚，梭形细胞的两端有突起，胞浆深染，胞核染色较淡，扁平的成纤维细胞呈阴性反应。经纯化后许旺细胞纯度达90%以上。
2.2 去细胞神经桥接体结果 ①一般性状观察：萃取后的神经呈乳白色，色暗，无光泽，其外径及长度较新鲜神经减小，柔软，有韧性。②苏木精-伊红染色观察：Triton-100作用96 h后，神经纤维结构消失，红染的神经内膜呈波浪状纵行排列，形成管柱状空隙。③扫描电镜下观察：神经内的轴突、髓鞘已被完全去除，可见由胶原纤维构成的立体管状结构，部分管腔不规则。胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征，管内可见膜样结构，为许旺细胞基底膜。④层粘连蛋白免疫组织化学染色观察：去细胞神经上细胞结构、轴突已消失，染成棕黄色的基底膜则被保留，呈管状纵形排列，膜与膜之间空虚，见图3，扫描电镜观察见图4。

2.3 重新细胞化的去细胞神经桥接复合体的观察结果细胞注射后1 d，细胞在桥接体内成团分布，排列不规则，3 d后细胞较第1天明显分散；细胞注射后5 d，许旺细胞沿基底膜管纵形排列，形成类似的Büngner’s带，见图5。

随着组织工程学概念的提出，组织化人工神经的研究逐渐被人们所关注。许旺细胞是周围神经组织工程的核心，在周围神经损伤中起着举足轻重的作用[3－4]：①与巨噬细胞一起吞噬变性的轴突与髓鞘为新轴突的生长扫清道路。②在神经内膜管内形成纵形排列的柱状细胞突起或特有的Büngner’s带为再生轴突提供生长通道。③通过产生许多神经营养因子及其受体起着重要的促进神经再生的作用[5]。④通过增加合成细胞表面黏附分子以及分泌多种基底膜成分（如：层粘连蛋白、纤维粘连蛋白）引导促进轴突再生[6－7]。⑤包绕再生轴突形成有髓纤维髓鞘以及形成无髓神经纤维内膜（髓鞘化），从而促进再生轴突的成熟。
本实验采用双酶消化法培养许旺细胞,培养过程中为了尽可能消除成纤维细胞的污染主要采取了如下措施：①10倍显微镜下仔细剥除神经外膜和束膜[8]。因为膜性成份中主要是成纤维细胞，所以尽可能剥除膜性成份是尽可能消除成纤维细胞的污染获取高纯度许旺细胞的最关键措施。②采用双30 min差速贴壁。由于成纤维细胞贴壁速度较许旺细胞快且黏附性强，利用这一特征将细胞悬液接种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，贴壁一段时问，收集未贴壁细胞，而已贴壁的细胞绝大部分为成纤维细胞，藉此可除去一部分成纤维细胞。贴壁的时间一般选择在30 min左右，因为时间太短达不到去除成纤维细胞的目的，时间太长则可能会丢失部分许旺细胞。③在许旺细胞培养初期加入阿糖胞苷处理。经过双差速贴壁后仍会有部分成纤维细胞残余，但在培养过程中成纤维细胞与许旺细胞分裂增长周期不同，成纤维细胞分裂较快（约两三天），许旺细胞较慢（约七八天），因此作者在细胞培养的初期，尤其是成纤维细胞的指数生长期在细胞培养液中加入阿糖胞苷目的就是抑制和杀死快速增长的成纤维细胞。值得提出的是阿糖胞苷是一种有丝分裂抑制剂。它在抑制成纤维细胞生长的同时也会影响许旺细胞本身的增殖能力，所以在Arab-C的作用浓度和作用时间的选择上作者参考了Mason等[9]在新生大鼠许旺细胞及在人胎儿许旺细胞培养中使用的方法，但是，由于许旺细胞来源不同，阿糖胞苷的作用浓度和时间仍值得进一步探讨。为了获取大量许旺细胞以满足组织工程的需要，本实验在细胞培养的后期（去除阿糖胞苷作用后）在细胞培养液中加入了神经生长因子。神经生长因子是一种具有广泛生物活性的肽类物质，在神经系统中分布广泛，有促进神经发育、维持神经正常生理等功能，对起源于中胚层和神经外胚层的细胞具有有效的促有丝分裂活性。需要提出的是神经生长因子一定要在成纤维细胞基本纯化干净后加入，否则成纤维细胞生长速度也会加快且加快速度要高于许旺细胞，这将会影响许旺细胞的纯度。
许旺细胞的鉴别：培养的许旺细胞在倒置显微镜下具有典型的形态特征：形态为梭形，有突起，多为双极，偶见3个细胞突起。细胞呈端对端、肩并肩、旋涡状或栅栏样排列生长。易于跟成纤维细胞相鉴别，因此也有学者认为许旺细胞是培养细胞中可通过形态学标准而进行鉴定的少数细胞类型之一。S-100蛋白是细胞浆内存在的一种酸性钙结合蛋白，因其可溶于100%的硫酸铵溶液而得名。正常许旺细胞、黑色素细胞、朗格罕氏细胞、汗腺细胞和肌上皮细胞均可呈现S-100蛋白阳性反应。但本实验可排除其他细胞存在的可能性，因而对许旺细胞鉴别有特异性。
由于排斥反应的发生，用新鲜同种异体神经移植临床修复周围神经缺损几无可能。但是，随着免疫学、免疫移植学的研究和发展，越来越多的学者对异体神经移植再次发生兴趣。研究的焦点就在于如何降低移植物的抗原性。1954年Sanders提出，移植神经段中异体许旺细胞是宿主免疫排斥反应的最主要标靶，这种观点又被很多学者相继证实[10]。1967年Das Gupta将神经进行1~6周的预变性(被认为缺乏髓鞘) 然后行异体移植。发现免疫反应明显减轻，从而提出髓鞘是引起排斥反应的主要部分。因此，矛盾的焦点就转变为如何有效去除异体神经中的许旺细胞和髓鞘。
1990年Ide等[11]研究发现，用冻融（以杀死许旺细胞）的无细胞基底膜管行异体移植不诱发决定性的一期免疫反应，缺乏免疫反应的组织学征象，从而否定了基底膜、胶原成份是抗原成分的设想。Gulati[12]及Tajima等[13]也先后通过自己的实验证实基底膜成分如层粘连蛋白等以及组成神经的神经外膜、神经束膜、神经内膜三重膜性结构的胶原成分几乎无免疫原性。
对同种异体神经进行去细胞处理就是采用化学或物理的方法去除异体神经中的许旺细胞、髓鞘、轴突，使剩余的主要成分为无损伤的基底膜管用以修复周围神经缺损。目前常使用的方法有了冷冻法[14-16]、放疗法、冻干法[17-18]、化学萃取法等等。尤为一提的是最近发展的化学处理方法可有效去除神经中的细胞及髓鞘，为临床寻找理想的自体神经替代物开辟了新的途径。
Triton X-100制备神经细胞外基质的原理：Triton X-100是一种温和的非离子型表面活性剂，是具有两性结构的分子。一是亲水基团，一是疏水基团，它可应用于免疫组织化学、病毒及细菌的蛋白质提取等方面。Triton X-100的水溶液稳定性高，不易受强电解质、无机盐类存在的影响。细胞膜基本是由两层类脂分子构成的生物膜，每个类脂分子一端为亲水端，另一端为疏水端即脂肪酸链。在类脂双层，所有的类脂分子的亲水端都朝向膜的两表面，疏水端则朝向膜的中央。Triton X-100中的疏水端能和膜蛋白的疏水区结合形成复合物，溶解于溶液中。这样，Triton X-100能彻底破坏生物膜，并且清除磷酯类物质，从而使细胞溶解破坏。而细胞外基质具有不溶性和耐损性，所以可完整保留。
经过去细胞处理的异体神经在去除抗原成分的同时保留了其完整的纤维支架结构和完整的基底膜。因此，与其他神经替代材料相比具有无可比拟的优点：①良好的生物相容性和细胞亲和力。这种支架来源于天然神经，可参与新生组织的构成，并且去细胞神经中含有大量细胞外基质，它们对种子细胞的黏附、迁移、以及轴突再生有促进作用。②低免疫原性。由于神经中的细胞成分已被去除，故其抗原性大为降低。③去细胞的神经三维结构完全“仿生”，保留了天然神经的纤维性骨架。已有的实验表明：在种植了许旺细胞的神经基膜管中，再生轴突完全沿长轴紧贴基膜管内表面生长，而通过肌、血管基膜管则远离内壁生长，这提示萃取的神经纤维结构与缺损的神经段结构最接近，作为支架结构可能最为理想[19]。
许旺细胞的存在以及其与合理结构移植物的有机结合是轴突再生良好的必须[20－21]。本实验就是将许旺细胞悬液以一定浓度(1×107 L－1)用微量注射器直接注射入去细胞神经段中。但是，总的说来许旺细胞的种植还处于试验阶段，究竟用哪种方法能使许旺细胞更有序地纵行排列于移植体上，形成Büngner Band促进再生轴突的生长，这也是组织工程化人工神经研究的重要方面。
本实验设计了将胎兔许旺细胞种植于经去细胞处理的同种异体神经桥接体内进行体外培养，将组织工程中的三要素：种子细胞、生物材料及其三维结构有机结合在一起。结果也显示：经去细胞处理的同种异体神经不仅保留了良好的基膜管结构、为许旺细胞生长提供了良好的支架，而且许旺细胞在其内确能生长良好并可迁移成行排列。但是，胎兔许旺细胞在同种异体神经桥接体内生物活性如何？桥接复合体与受体的生物相容性如何？其在体内的生长情况及种植的许旺细胞能否具有明显的促进、引导神经轴突再生长？解决这些问题需下一步的实验研究。

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