核苷酸结合寡聚结构域受体1作为先天免疫识别受体在血管平滑肌细胞激活中的作用★

核苷酸结合寡聚结构域受体1作为先天免疫识别受体在血管平滑肌细胞
激活中的作用★
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丁彦春，曲鹏

课题背景：核苷酸结合的寡聚结构域受体是新近发现的细胞内模式识别受体，目前的研究主要集中于它们在人类一些炎症性疾病如炎症性肠病的发生、发展中的作用。核苷酸结合的寡聚结构域受体与Toll样受体具有相似的结构和功能，核苷酸结合的寡聚结构域受体是否像Toll样受体一样也参与动脉粥样硬化形成和发展，它们在动脉粥样硬化形成和发展中的具体作用机制，以及二者介导的信号传导通路之间的相互作用关系将是未来该领域的研究热点。

同行评价：文章通过观察细菌细胞壁粘肽对血管平滑肌中细胞内模式识别受体核苷酸结合的寡聚结构域受体1激活和表达的影响，结论认为核苷酸结合的寡聚结构域受体1介导的先天免疫信号通路可能通过激活血管平滑肌细胞参与动脉粥样硬化的发生和发展。对于临床上预防动脉硬化形成和经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄过程有重要意义。

相关链接：免疫反应参与动脉粥样硬化形成的全过程，先天免疫反应的激活在动脉粥样硬化形成中具有重要作用。对先天免疫反应及模式识别受体在动脉粥样硬化形成中的作用进行研究不仅有助于理解动脉粥样硬化形成过程，而且还能通过直接干扰动脉粥样硬化形成中的炎症反应过程来提供抗动脉粥样硬化治疗的新方案、新策略。

丁彦春★，男，1971年生，河南省扶沟县人，汉族，1999年大连医科大学毕业，硕士，副教授，主要从事动脉硬化形成机制及介入心脏病学。
yanchunding@
yahoo.com.cn

通讯作者：曲鹏，博士，教授，大连医科大学附属第二医院心内科，辽宁省大连市
116027 qupeng777@
yahoo.com.cn

摘要
目的:核苷酸结合的寡聚结构域受体1 是新近发现的先天免疫细胞内模式识别受体。实验通过观察细菌细胞壁粘肽对血管平滑肌中细胞内核苷酸结合的寡聚结构域受体1激活和表达的影响，探讨核苷酸结合的寡聚结构域受体1介导的先天免疫信号通路在血管平滑肌激活中的作用。
方法：实验于2006-06/2007-03在大连医科大学附属二院中心实验室完成。①实验材料：人冠状动脉血管平滑肌细胞购自Cambrex公司。②实验过程：体外培养人冠状动脉血管平滑肌细胞，用核苷酸结合的寡聚结构域受体1激动剂细菌细胞壁粘肽（10 mg/L）刺激0，3，6和24 h。③实验评估：用实时定量反转录-聚合酶链反应检测平滑肌细胞中核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA的表达，用酶联免疫吸附法检测细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的浓度。
结果：①血管平滑肌细胞在静息状态下表达低水平的核苷酸结合的寡聚结构域受体1。细菌细胞壁粘肽刺激能够引起血管平滑肌细胞中核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA表达上调(从0.164±0.005增加到0.231±0.027，P < 0.05)。②酶联免疫吸附法显示细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的浓度也显著增加[白细胞介素8从（0.12±0.01）μg/L 增加到（2.31±0.11）μg/L，肿瘤坏死因子α从（4.22±0.50）ng/L 增加到（143.11±12.58）ng/L，P < 0.01]。
结论：推测血管平滑肌细胞中的核苷酸结合的寡聚结构域受体1介导的先天免疫信号通路被激活，参与了动脉粥样硬化的发生和发展。
关键词：血管平滑肌细胞；核苷酸结合的寡聚结构域受体1；粘肽；动脉粥样硬化；血管组织构建��

丁彦春，曲鹏. 核苷酸结合寡聚结构域受体1作为先天免疫识别受体在血管平滑肌细胞激活中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2021-2024 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2021(ps).pdf]

中图分类号:R329.412
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02021-04

Role of nucleotide binding oligomerization domain receptor 1 as a new innate immune recognition receptor in activation of vascular smooth muscle cells

AIM:Nucleotide binding oligomerization domain receptor 1 (NOD1) is a recently identified intracellular pathogen pattern recognition receptor of innate immunity. This study was designed to explore the role of NOD1-mediated innate immune signal pathway in the activation of vascular smooth muscle cells (VSMCs), and investigate the effect of peptidoglycan (PGN) on the activation and expression of NOD1 in human VSMCs.
METHODS: The experiment was performed in the central laboratory of the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University from June 2006 to March 2007.①Subject: Human coronary artery VSMCs were purchased from Cambrex company.②Methods: Human coronary artery VSMCs were cultured in vitro, and stimulated with NOD1 agonist PGN (10 mg/L) for 0, 3, 6 and 24 hours.③Evaluation: The mRNA expression of NOD1 in VSMCs was measured by real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. The concentration in the culture supernatants of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) was determined by enzyme linked immunosorbent assay.
RESULTS: ①Human VSMCs constitutively expressed a low level of NOD1 at resting condition. Upon PGN stimulation, the expression of NOD1 mRNA was up-regulated in VSMCs, from 0.164±0.005 to 0.231±0.027 (P < 0.05).②Enzyme linked immunosorbent assay showed the concentration in the culture supernatants of IL-8 and TNF-α increased significantly, IL-8 from (0.12±0.01) μg/L to (2.31±0.11) μg/L and TNF-α from (4.22±0.50) ng/L to (143.11±12.58) ng/L, respectively (P < 0.01).
CONCLUSION: The NOD1-mediated innate immune pathway may be involved in the atherogenesis though the activation of VSMCs.

Ding YC, Qu P. Role of nucleotide binding oligomerization domain receptor 1 as a new innate immune recognition receptor in activation of vascular smooth muscle cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2021-2024(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2021(ps).pdf]

血管平滑肌细胞激活后增殖、移行到血管内膜并合成细胞外基质蛋白是动脉硬化形成和经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄的一个关键过程[1]。感染可能通过触发先天免疫反应参与上述过程[2]。核苷酸结合的寡聚结构域受体是一个新近发现的模式识别受体家族，它们位于胞浆内，负责识别进入细胞内的危险信号[3]。核苷酸结合的寡聚结构域受体1是核苷酸结合的寡聚结构域受体家族的主要成员，能够识别进入细胞内的G-和G+菌细胞壁粘肽成份，启动宿主细胞清除病原体感染的先天免疫反应[4]。刺激核苷酸结合的寡聚结构域受体1能够导致核因子-κB的激活，引起促炎症因子的表达[5]。核苷酸结合的寡聚结构域受体1在血管平滑肌细胞中也具有一定水平的表达，本文应用核苷酸结合的寡聚结构域受体1的激动剂细菌细胞壁粘肽刺激人冠状动脉血管平滑肌细胞，探讨核苷酸结合的寡聚结构域受体1信号通路在血管平滑肌细胞激活中的作用。

设计：以细胞为对象进行对比观察。
单位：大连医科大学附属第二医院。
材料：实验于2006-06/2007-03在大连医科大学附属第二医院中心实验室（国家中医药管理局3级分子生物学实验室）。人冠状动脉血管平滑肌细胞购自Cambrex公司（Walersville,USA）；核苷酸结合的寡聚结构域受体1的激动剂细菌细胞壁粘肽购自Fluka-Chemie公司；DMEM培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Gibco BRL公司；RNeasy total RNA mimi Kit购自Qiagen公司；人白细胞介素8、肿瘤坏死因子α ELISA Kit 购自BD Phamingen 公司。
设计、实施、评估者：为全部作者，均受过相关专业培训。评估是针对试验结果进行的，由于是细胞试验，未采用特殊盲法。
技术路线
细胞培养及分组：人冠状动脉血管平滑肌细胞生长于含体积分数为0.1的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素及1 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，在体积分数为0.05的CO2，37 ℃培养箱内孵育。实验所用细胞为5~8代。将人冠状动脉血管平滑肌细胞移入含体积分数为0.001胎牛血清的DMEM培养基中，以1×106/孔种入标准6孔板中并孵育24 h。实验分为以下4组：分别以10 mg/L细菌细胞壁粘肽刺激0（对照组），3，6，24 h。
RNA 分析：细胞总RNA用RNeasy total RNA mimi Kit提取，然后用BioAnalyzer （Agilent Technologies, Germany）分析。1 μg总RNA配制反转录反应体系，反转录合成cDNA。以3 μL cDNA为模板，用实时定量反转录-聚合酶链反应进行扩增。人核苷酸结合的寡聚结构域受体1和cyclophinlin A引物和探针均为Assay-on-demand (ABI, Foster City, California,USA)。转录水平用目标基因与cyclophinlin A 的比值表达。
细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的测定：留取各组细胞培养物标本，低温高速离心 (4 ℃ 14 000 r/min, 30 min)，收集上清液，分装，-80 ℃保存，收齐标本后统一用酶联免疫吸附法测定细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的浓度。每个样品设2个平行孔，按照试剂盒说明书进行测定。
细胞活力试验：细胞活力试验采用锥虫蓝染色、细胞计数方法。实验各组(每组n=3)于细菌细胞壁粘肽 (10 mg/L)刺激3，6和24 h后，制备细胞悬液，每孔取900 μL 悬液与100 μL 锥虫蓝试剂混匀，各取10 μL 滴于计数板上，分别进行坏死细胞和活细胞计数，计算细胞存活率。细胞存活率计算公式为：活细胞率(%) = 活细胞总数×100%/(活细胞总数+死细胞总数)。
主要观察指标：①核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA 在人血管平滑肌细胞中的表达。②细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的含量。③细胞活力试验。
统计学方法：数据用_x±s表示，由第一作者采用SPSS 10.0 统计软件进行处理，多组间比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性。

2.1 细胞活力试验结果实验所用10 mg/L细菌细胞壁粘肽对血管平滑肌细胞生长无任何毒性，细胞存活力达98%以上。
2.2 统计推断
2.2.1 核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA的表达见表1。实时定量反转录-聚合酶链反应分析表明血管平滑肌细胞在基础状态下能够表达低水平的核苷酸结合的寡聚结构域受体1。在其配体细菌细胞壁粘肽（mg/L）刺激下，血管平滑肌细胞中核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA呈时间依赖性表达上调，至24 h达到高峰。

2.2.2 细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的含量见表2。酶联免疫吸附法检测发现，细菌细胞壁粘肽刺激能引起细胞培养物上清液中白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的分泌，并呈时间依赖性增加，表明核苷酸结合的寡聚结构域受体1的激活能激活血管平滑肌细胞，引起血管平滑肌细胞分泌白细胞介素8和肿瘤坏死因子α。

先天免疫反应在动脉粥样硬化形成和发展中具有重要作用[6]。研究证实细胞外模式识别受体Toll样受体家族介导的先天免疫信号传导通路在动脉粥样硬化形成和经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄过程中具有重要作用[7-9]，而新近发现的细胞内模式识别受体家族-核苷酸结合的寡聚结构域受体家族在动脉粥样硬化形成过程中的作用却知之甚少。核苷酸结合的寡聚结构域受体1是核苷酸结合的寡聚结构域受体家族的主要成员，负责识别进入细胞内的危险信号[4]。核苷酸结合的寡聚结构域受体1在多种组织中有表达[10]，有研究表明侵入性病原体如肺炎衣原体能穿透内皮细胞，进入到内皮细胞胞浆内，被细胞内的核苷酸结合的寡聚结构域受体1识别，激活核因子-κB，诱导促炎症因子的产生[11]。肺炎衣原体的慢性感染与动脉粥样硬化的发生和发展有关[12]，细菌细胞壁粘肽是细菌细胞壁的主要成份，是核苷酸结合的寡聚结构域受体1的配体，最近有研究在动脉硬化斑块中发现细菌细胞壁粘肽，并证实它是一个与斑块不稳定性有关的标记物[13]，这些都表明核苷酸结合的寡聚结构域受体1介导的先天免疫反应可能参与动脉粥样硬化的形成和发展。
为阐明核苷酸结合的寡聚结构域受体1在血管平滑肌细胞中表达及其功能，作者在培养的人冠状动脉血管平滑肌细胞中检测了核苷酸结合的寡聚结构域受体1的表达，发现血管平滑肌细胞在基础状态下能表达低水平的核苷酸结合的寡聚结构域受体1，在其激动剂细菌细胞壁粘肽的刺激下，血管平滑肌细胞中的核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA呈时间依赖性表达上调，这表明局部的细菌产物能够诱导血管平滑肌细胞中核苷酸结合的寡聚结构域受体1 mRNA的表达。本实验的数据还证实细菌细胞壁粘肽不仅能够诱导血管平滑肌细胞表达核苷酸结合的寡聚结构域受体1，还能够激活核苷酸结合的寡聚结构域受体1介导的信号传导通路，引起下游的促炎症因子如白细胞介素8和肿瘤坏死因子α分泌增加。肿瘤坏死因子α是炎症反应中的一个多能炎症介质[14]，能被粥样硬化斑块中的血管平滑肌细胞和球囊损伤后的血管平滑肌细胞表达，它能通过调节血管平滑肌细胞的增殖和凋亡在动脉粥样硬化病变的发展和斑块的稳定中起重要的调节作用[15]。白细胞介素8是中性粒细胞、单核细胞和T细胞强有力的趋化因子[16]，也是介入治疗后心血管事件有力的预测因子[17]，在动脉粥样硬化形成和发展中具有重要作用[18]。这表明血管平滑肌细胞中的核苷酸结合的寡聚结构域受体1通路的激活，能够促进和增强血管平滑肌细胞中的炎症反应，诱导血管平滑肌细胞分泌促炎症细胞因子，参与动脉硬化的形成。
本实验结果表明细胞外的细菌细胞壁粘肽能够通过某种机制进入血管平滑肌细胞中，并被血管平滑肌细胞中的核苷酸结合的寡聚结构域受体1受体所识别，启动下游的信号通路，这表明血管平滑肌细胞中核苷酸结合的寡聚结构域受体1受体的激活可能代表激活血管平滑肌细胞的一个新的先天免疫信号传导通路。
本实验的发现具有重要的临床意义。目前感染和免疫反应在动脉硬化形成中的重要作用已经得到公认，但是近期大规模的临床研究发现抗菌治疗不能改善冠心病患者的预后[19-20]，表明应用抗生素杀死病原菌并不能阻止动脉硬化的进程。而本实验发现细菌的一些分解产物如细菌细胞壁粘肽能够通过某种机制进入血管平滑肌细胞中，并被细胞内模式识别受体核苷酸结合的寡聚结构域受体1所识别，启动激活血管平滑肌细胞的一个新的先天免疫通路，参与动脉粥样硬化形成过程。如何有效的清除细菌分解产物并阻断由此引发的炎症发应，将是未来冠心病研究的重点，而这些研究的发现必将为今后冠心病的防治策略提供了新的思路。

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