转化生长因子β1对大鼠肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1表达的影响★

转化生长因子β1对大鼠肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1表达的影响★
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邹杨，樊均明

课题背景：本实验设计思路是首先通过时间依赖实验以初步筛选出比较科学合理的时间点，再在此基础上，进行剂量依赖性的观察，以观察转化生长因子β1对大鼠近端肾小管上皮细胞中的基质细胞衍生因子1的影响。

应用要点：实验通过证实在大鼠近端肾小管上皮细胞中转化生长因子β1对基质细胞衍生因子1的调节作用，为揭开基质细胞衍生因子与肾间质纤维化间的关系提供实验基础。

术语解析：基质细胞衍生因子1是一种细胞因子，属CXC(Cys-X-Cys)类趋化蛋白，系统命名CXCL12（CXC chemokine ligand-12），是已知唯一能与受体CXCR4结合并激活的天然趋化因子。基质细胞衍生因子1 和CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺和脾，在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。

邹杨★，女，1982年生，四川省西昌市人，汉族，四川大学华西医学院肾脏内科在读硕士，主要从事肾脏纤维化方面的研究。
zouyang2005@
gmail.com

通讯作者：樊均明，博士，主任医师，博士生导师，四川大学华西医学院肾脏内科，四川省成都市
610041

摘要
目的:已知转化生长因子β1与肾脏组织纤维化形成有密切关系。拟进一步探讨转化生长因子β1对大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）中基质细胞衍生因子1表达的影响。
方法：实验于2006-03/2007-05在四川大学生物治疗国家重点实验室神经分子生物实验室完成。①实验材料：大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK52E，由澳大利亚Monash医学中心肾内科实验室提供；转化生长因子β1由cytolab公司提供。②实验分组：将大鼠近端肾小管上皮细胞分为正常对照组：无转化生长因子β1 干预；实验组：又分为在同一转化生长因子β1浓度(2 μg/L)下，培养6，12，24 h；在不同的转化生长因子β1浓度(2，5，10 μg/L)下，培养24 h。③利用免疫细胞化学技术对同一转化生长因子β1浓度(2 μg/L)干预不同时间后的大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子１的蛋白表达进行半定量分析，选择出最佳的作用时间点；通过反转录-聚合酶链反应、Western-Blotting以检测大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1在不同转化生长因子β1浓度干预下培养24 h后的mRNA、蛋白表达变化情况。
结果：①培养12，24 h时,大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1的蛋白表达比0 h增高(P < 0.05)；24 h时表达略高于12 h (P > 0.05)。提示，基质细胞衍生因子1的表达到达一平台期，24 h为最佳的作用时间点。②从mRNA水平和蛋白水平均证实，2 μg/L转化生长因子β1干预24 h后的大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1的表达高于正常对照组 (P < 0.05)；随着转化生长因子β1的浓度增大，表达呈下降趋势，10 μg/L时表达低于2 μg/L时的表达(P < 0.05)。
结论：基质细胞衍生因子1在正常的大鼠近端肾小管上皮细胞中呈低表达状态，对转化生长因子β1的干预表现出一定的时间、剂量依赖性，基质细胞衍生因子1可能参与了肾间质纤维化的发生、发展。
关键词：转化生长因子β；趋化因子；肾小管，近端／细胞学；组织构建

邹杨，樊均明.转化生长因子β1对大鼠肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2029-2033 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2029(ps).pdf]

中图分类号:R392.114
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)11-02029-05

Effect of transforming growth factor-beta 1 on stromal cell-derived factor 1 expression in rat renal tubular epithelial cells

AIM:It has been proved that transforming growth factor-β1 (TGF-β1) has a close correlation with kidney fibrosis. This study investigated the effects of TGF-β1 on stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) in rat renal tubular epithelial cells (NRK52E).
METHODS: The experiment was carried out in the Division of Molecular Neurobiology, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University from March 2006 to May 2007. ①Rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E, Monash Medical Center, Australia) were divided into normal control group, which were not treated with TGF-β1 (Cytola), and experimental group, which were subdivided into time-dependent groups: NRK-52E cells were incubated with TGF-β1 at the same concentration (2 μg/L) for 6, 12, and 24 hours, and dose-dependent groups: NRK-52E cells were treated with TGF-β1 at different concentrations (2, 5, and 10 μg/L) for 24 hours. ②The semi-quantitative calculation of SDF-1 protein expression in the cells treated with TGF-β1 at the concentration of 2 μg/L for different time was accessed by immunocytochemistry to find the best time point. Then the variances of the mRNA and protein expression level in cells treated with TGF-β1 at different concentrations for 24 hours were detected by RT-PCR and Western-Blotting.
RESULTS: ①The protein expression level of SDF-1 in NRK-52E cells treated with TGF-β1 for 12 and 24 hours was higher than for 0 hour (P < 0.05), and the level for 24 hours was slightly higher than for 12 hours (P > 0.05). This indicated the SDF-1 expression reached a flat stage, and 24 hour was the bets time to study the dose dependence. ②Both the mRNA and protein expression level analyses demonstrated that the expression of SDF-1 in NRK-52E cells treated with 2 μg/L TGF-β1 for 24 hours was significantly higher than that in normal control group (P < 0.05), and the expression was declined as the concentration of TGF-β1 increased. Moreover, the expression with 10μg/L was lower than with 2 μg/L (P < 0.05).
CONCLUSION: SDF-1 is weakly expressed in normal NRK-52E cells, and its expression shows a time- and dose-dependence to TGF-β1. It suggests that SDF-1 may play a significant role in the occurrence and development of renal fibrosis.

Zou Y, Fan JM. Effect of transforming growth factor-beta 1 on stromal cell-derived factor 1 expression in rat renal tubular epithelial cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2029-2033(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2029(ps).pdf]

炎症反应是许多肾脏疾病发生、发展的重要环节，涉及大量趋化因子。趋化因子是由免疫细胞和非免疫细胞分泌的一类细胞因子，有研究表明肾固有细胞及浸润到局部的炎性细胞均可表达趋化因子,已有40多种趋化因子得到鉴定[1]。
目前，国内外大量研究指出一CXC趋化因子亚家族成员,基质细胞衍生因子及其唯一的天然受体，CXCR4（系统命名）参与肾脏生理、病理的发生、发展[2-7]，关于其相互作用的调节，也就显得格外重要。在既有研究中,转化生长因子β1对基质细胞衍生因子1及其受体间相互作用的调节引起了研究者的兴趣[8-13]。已知转化生长因子β1与肾间质纤维化具有密切联系，不论何因，转化生长因子β1是导致纤维化的最后共同中介物，因此转化生长因子β1成为治疗肾脏纤维化的一个公认治疗靶点。另外，Ueno等[14]、Hashimot等[15]发现基质细胞衍生因子1与肺纤维化、肝纤维化具有密切联系。而基质细胞衍生因子1在肾间质纤维化中的作用以及其在肾小管上皮细胞中与转化生长因子β1间的相互关系的研究未见报道。本实验以大鼠近端肾小管上皮细胞为实验对象，探讨转化生长因子β1对大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1表达的影响，以期为今后的研究提供实验基础。

设计：对比观察。
单位：四川大学生物治疗国家重点实验室神经分子生物实验室。
材料：实验于2006-03/2007-05在四川大学生物治疗国家重点实验室神经分子生物实验室完成。主要试剂：转化生长因子β1（cytolab公司），DMEM干粉剂（Gibco），新生牛血清（Gibco），基质细胞衍生因子1多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），β-肌动蛋白抗体（abcam公司），免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，基质细胞衍生因子1引物（invitrogen公司），β-肌动蛋白引物（invitrogen公司），反转录酶（RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase，MBI公司），聚合酶链反应试剂（Taq DNA Polymerase (recombinant)，MBI公司），皮克级化学发光检测底物（Pierce公司），Trizol（invitrogen公司）。
设计、实施、评估者：实验由第二作者与第一作者设计，第一作者实施，第二作者评估，均接受过正规培训。
技术路线：
细胞培养及分组：大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK52E来源于American Type Culture Collection(ATCC)，
由澳大利亚Monash医学中心肾内科实验室提供。将细胞复苏后，用含体积分数为0.1的胎牛血清培养，消化传代采用2.5 g/L胰酶，培养条件为体积分数为0.05的CO2，37 ℃。分组：正常对照组：无转化生长因子β1干预；实验组：又分为在同一转化生长因子β1浓度(2 μg/L)下，培养6，12，24 h；在不同的转化生长因子β1浓度（2，5，10 μg/L）下，培养24 h（通过时间依赖实验选择出的最佳时间点）。
反转录-聚合酶链反应方法检测基质细胞衍生因子1的mRNA表达：将用2.5 g/L胰酶消化的细胞以合适的密度（约2×108 L-1）接种到6孔板中培养。收集细胞时以每(5~10)×106个细胞加入1 mL Trizol，按说明书步骤提取细胞总RNA，再采用两步法进行反转录和产物聚合酶链扩增反应，β-肌动蛋白作为内参照。聚合酶链反应条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；38个循环；72 ℃ 10 min；扩增产物经30 g/L琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统成像，用Bio Rad quanity one 软件对条带进行半定量分析，基质细胞衍生因子1的mRNA相对含量分别用其与β-肌动蛋白条带的积分吸光度比值表示。
引物序列：基质细胞衍生因子1（191 bp）：上游：5’-GAC GGT AAG CCA GTC AGC CT-3’；下游：5’-CAG GTA CTC TTG GAT CCA CT-3’，β-肌动蛋白（300 bp）：上游：5’-　TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ATG A-3’；下游：5’-CAT CGG AAC CGC TCA TTG CCG ATA G-3’。
免疫细胞化学检测基质细胞衍生因子1的蛋白表达：将用2.5 g/L胰酶消化的细胞，以（3~5）×107 L-1的密度接种到爬片上进行培养。从6孔板取出长满细胞的盖玻片，用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，磷酸盐缓冲液漂洗2次，5 min/次；加入打孔液处理 10 min，磷酸盐缓冲液洗2次；体积分数为0.03的H2O2室温处理 15 min，磷酸盐缓冲液洗2次；用正常山羊血清封闭，37 ℃ 孵育15 min，吸去多余血清，不洗，加入基质细胞衍生因子1多克隆抗体，比例为1∶100，4 ℃ 冰箱过夜，接着，按照免疫组织化学染色试剂盒的说明书步骤进行操作，再用二氨基联苯胺显色试剂（武汉博士德生物工程有限公司）显色，自来水充分冲洗后，苏木精复染，自来水冲洗返蓝，后依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。经显微镜拍照后,用Imagepro-Plus软件对免疫组织化学的基质细胞衍生因子1蛋白进行半定量分析，分析值以IA值表示。
Western blotting检测基质细胞衍生因子1的蛋白表达：将经2.5 g/L胰酶消化后的细胞，以合适的细胞密度（约 2×108 L-1）接种到六孔板中培养。收集细胞时按100 μL 10 g/L十二烷基硫酸钠+1 μL细胞抑制剂（Pierce公司）/孔，在室温下裂解细胞，收集细胞裂解液，超声破碎仪超声破碎，充分裂解细胞后置于4 ℃　离心机，13 000 r/min离心20 min，取上清，用酶标仪进行蛋白定量；同时配置 150 g/L分离胶，40 g/L浓缩胶，根据所测的各组蛋白浓度进行调整上样量，使上样量统一为50 μg；电泳：恒压，80 V 2 h；转膜：恒压，70 V 40 min；用PBST漂洗转印膜3次，3 min/次，用PBST溶解的5%脱脂奶粉，室温封闭2 h，将膜移入杂交袋中，加入用5%脱脂奶粉稀释的兔抗基质细胞衍生因子1(1∶200)；β-肌动蛋白(1∶600)置于摇床，4 ℃ 过夜；取出膜，洗膜3次，15 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（Pierce公司，稀释比例1∶10 000），室温反应1 h，洗膜3次，15 min/次，用皮克级化学发光检测底物检测，暴光，X片记录实验结果。用Bio Rad quanity One软件对条带进行半定量分析，基质细胞衍生因子1蛋白相对含量用其分别与其相应的β-肌动蛋白条带的积分吸光度比值表示。
主要观察指标：①大鼠近端肾小管上皮细胞在同一转化生长因子β1浓度干预下,培养不同时间后，基质细胞衍生因子1的蛋白表达。②大鼠近端肾小管上皮细胞在同一时间点，接受不同浓度转化生长因子β1干预后，基质细胞衍生因子1的mRNA与蛋白的表达。
统计学分析：由本文作者用SPSS 13.0软件对数据进行分析处理，计量资料用_x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著意义。

2.1 大鼠近端肾小管上皮细胞在2 μg/L 转化生长因子β1的干预下，培养不同时间后，基质细胞衍生因子1的表达孷①免疫细胞化学检查光镜下观察，基质细胞衍生因子1主要位于大鼠近端肾小管上皮细胞的胞质中，呈棕黄色，颗粒状。②在蛋白水平上检测到，6 h时比0 h时有所增多，但差异没有显著性（P > 0.05）；而12 h时，其表达显著高于0 h（P < 0.05）；24 h时，基质细胞衍生因子1表达稍高于12 h，但与12 h差异没有显著性 (P > 0.05)，与0 h时相比，差异具有显著性（P < 0.05）。可初步认为，基质细胞衍生因子1在正常的大鼠近端肾小管上皮细胞中的基质细胞衍生因子1呈低表达状态，随着转化生长因子β1的诱导时间的延长而呈现逐渐增高趋势，到12~24 h时，其表达量达一平台期。见图1，2。

2.2 大鼠近端肾小管上皮细胞在不同浓度转化生长因子β1干预下培养24 h后，基质细胞衍生因子1的mRNA与蛋白表达 ①反转录-聚合酶链反应在mRNA水平上检测到，大鼠近端肾小管上皮细胞接受 2 μg/L转化生长因子β1干预24 h后,其mRNA水平明显高于正常对照组，有统计学意义(P < 0.05)；而随着转化生长因子β1剂量的增大，基质细胞衍生因子1的mRNA水平呈下降趋势，10 μg/L转化生长因子β1作用下，与2 μg/L转化生长因子β1干预后差异存在显著性(P < 0.05)。见图3，4。

②Western Blotting从蛋白水平上检测到：2 μg/L转化生长因子β1干预24 h后可使大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1的表达明显高于正常对照组(P < 0.05)，而5 μg/L转化生长因子β1干预后则呈下降趋势，但与2 μg/L转化生长因子β1干预24 h后相比，差异不明显（P > 0.05）；10 μg/L转化生长因子β1干预24 h后，大鼠近端肾小管上皮细胞中的基质细胞衍生因子1的蛋白表达比2 μg/L转化生长因子β1干预24 h后显著降低 (P < 0.05)。见图 5，6。

目前既有的研究表明：转化生长因子β1对基质细胞衍生因子1及其受体的相互作用具有调节作用，Wright等[9]发现，转化生长因子β1下调骨髓基质细胞中的基质细胞衍生因子1的表达；Ohira等[10]发现胆管癌细胞分泌转化生长因子β1下调胆管癌间质纤维母细胞中基质细胞衍生因子1的表达；Franitza等[11]发现转化生长因子β1上调天然T淋巴细胞中的基质细胞衍生因子1的受体表达，且还能增强天然T淋巴细胞对基质细胞衍生因子1的趋化效应；Chen等[12]发现转化生长因子β1增加单核细胞衍生的巨嗜细胞中的基质细胞衍生因子1的受体表达，同时增强其相互间的信号传导；Basu等[13]研究发现，CD34+细胞若长期暴露于基质细胞衍生因子1，对基质细胞衍生因子1的趋化效应会降低，但低水平的转化生长因子β1却可增加CD34+细胞对基质细胞衍生因子1趋化的敏感性;当转化生长因子β1被RNA干扰掉后可致基质细胞衍生因子1分泌降低；转化生长因子β1可引起人成骨细胞HOB、骨肉瘤MG-63、MC3T3-E1细胞分泌基质细胞衍生因子1明显降低（30%~100%），但却能引起大鼠骨肉瘤ROS17/2.8细胞的分泌增多[8]。
可见转化生长因子β1对基质细胞衍生因子1的调节具有明显的细胞依赖性。而基质细胞衍生因子1广泛地、组成性地表达于多种细胞和组织中,包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺和脾等。本实验发现基质细胞衍生因子1在正常大鼠近端肾小管上皮细胞中呈低表达状态，与Tgel 等[5]研究结果一致。而转化生长因子β1在大鼠近端肾小管上皮细胞中，对其基质细胞衍生因子1的调节根据时间依赖实验提示：基质细胞衍生因子1的蛋白表达量于6 h时，比0 h有所增加，呈增长趋势，12~24 h呈现显著性增高，24 h时其表达量略高于12 h，但两者间没有显著性差异，可见其表达量达一平台期。推测转化生长因子β1对大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子的诱导作用可在较早的时间出现，与Wright等[9]的研究一致，而到12~24 h可达一稳定状态，此时基质细胞衍生因子1的表达量比较稳定，在此状态下可进行下一步剂量依赖性研究。实验结果提示：基质细胞衍生因子1的mRNA或蛋白表达，在转化生长因子β1低浓度 2 μg/L干预下培养24 h后，其表达水平明显高于正常表达水平,且随着转化生长因子β1剂量的增高，呈现持续降低趋势，具有统计学意义，与Basu等[13]研究结果一致。
由此可以推测转化生长因子β1在肾间质纤维化初始阶段即可引起基质细胞衍生因子1的增高，而基质细胞衍生因子１此时则可能通过其自身相关作用参与肾间质纤维化的发生。
肾间质纤维化是以小管间质白细胞浸润、成纤维细胞增殖、大量细胞外基质（Ⅰ型胶原等）的产生从而导致小管细胞的坏死与凋亡为特征。据相关文献报道基质细胞衍生因子1具有：趋化CD34+骨髓成体干细胞[16-17]；趋化白细胞、淋巴细胞等参与炎症反应 [18]；促进细胞增殖[19]；介导大量Ⅰ型胶原产生 [20]；强烈促血管生成等作用[21]。
就基质细胞衍生因子1本身的作用特点，可见其与纤维化进程息息相关，而目前关于基质细胞衍生因子1在纤维化进程中起保护性作用或有害作用仍存在争论，Ueno等[14]认为血管源性细胞，内皮祖细胞能抑制肝纤维化的进展，而基质细胞衍生因子1具有趋化骨髓中内皮祖细胞、减弱其凋亡的功能，所以推测基质细胞衍生因子1可以延缓肝纤维化的进展；Hashimot等[15]则发现，基质细胞衍生因子1趋化骨髓组织的成体干细胞到肺纤维化灶处分化为成纤维细胞，并产生大量的Ⅰ型胶原，参与纤维灶的形成。故认为，基质细胞衍生因子1可以通过趋化外源性细胞从促进肺纤维化的发生，被认为是外源性纤维化的标志。而通过本实验证实在正常的大鼠近端肾小管上皮细胞中基质细胞衍生因子1表达量低下，但作为治疗肾脏纤维化的公认治疗靶点的转化生长因子β1可在早期、小剂量时引起基质细胞衍生因子1的分泌，且存在着一定的时间、剂量依赖性，为基质细胞衍生因子参与肾间质纤维化的进程提供了实验依据，为进一步研究基质细胞衍生因子1在肾间质纤维的发生、发展中所起的具体作用的研究提供了实验基础。

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