肾源性细胞因子促红细胞生成素对急性脊髓损伤大鼠细胞凋亡的影响**★

肾源性细胞因子促红细胞生成素对急性脊髓损伤大鼠细胞凋亡的影响**★
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陈淑强1，徐又佳1，俞晨1，郝彦明1，张振东1，顾永平2

课题背景：2002年nature medline发表题为Erythropoietin styikes a new cord 文章,报道阐述了促红细胞生成素作为一种新的神经保护因子的可能机制和应用前景。此后大量实验探索促红细胞生成素神经保护作用的可能机制，并对其可通过多种途径来抑制继发性脊髓损伤已有初步的认识。

应用要点：早期应用外源性促红细胞生成素对脊髓不完全损伤后引起的神经运动功能损害具有保护作用,此种保护作用与促红细胞生成素能够减少神经细胞凋亡有关。

相关链接：已有的研究大多通过静脉注射或腹腔注射给药途径观察促红细胞生成素对急性脊髓损伤的保护作用。现在对于脊髓损伤后通过硬膜外途径局部给药的治疗效果逐渐被认识并应用，虽然大多用来注射糖皮质激素。本实验即采用硬膜外腔注射给药的方式来观察促红细胞生成素对急性脊髓损伤的治疗效果。

1苏州大学附属第二医院骨科，江苏省苏州市 215004；2苏州大学基础医学系病理教研室, 江苏省苏州市
215123

陈淑强★，男，1982年生，山东省临沂市人，汉族，苏州大学在读硕士，医师，主要从事脊柱脊髓损伤的研究。
chenshuqiang_0@
yahoo.com.cn

通信作者：徐又佳，博士，主任医师,教授，苏州大学附属第二医院骨科，江苏省苏州市 215004
xuyoujia@
medmail.com.cn

江苏省卫生厅医学发展基金（H200346）*；苏州市社会发展项目基金（ssy0625）*

摘要
目的:促红细胞生成素为肾源性细胞因子，在大鼠急性脊髓损伤后对脊髓神经功能具有保护作用。实验拟证明不同时间硬膜外腔注射后其对脊髓神经细胞凋亡的影响。
方法：实验于2007-01/04在苏州大学附属第二医院动物实验室完成。①实验材料：清洁级成年雄性SD大鼠48只，体质量(270 ±10) g；实验用人重组促红细胞生成素为日本麒麟啤酒株式会社制造，规格3 000 IU /支。②实验分组及处理：将大鼠随机分为正常组6只，假手术组6只（仅切除椎板），生理盐水组18只，实验组18只。按改良Allen打击法建立大鼠脊髓不完全损伤模型。实验组分别于大鼠脊髓损伤后1，6，24 h（每个时间点6只），于硬膜外腔注射重组人促红细胞生成素5 000 u/（kg·bw）；生理盐水组于相同时间予以相同体积生理盐水。③实验评估：通过动物神经运动功能BBB评分及斜板试验评价神经损伤程度；苏木精－伊红染色法观察组织学改变，并采用原位末端标记法标记法检测脊髓神经细胞凋亡数。
结果：①神经行为学评分：正常组、假手术组大鼠双下肢运动功能正常；与生理盐水组相比,脊髓损伤后实验组1,6及24 h神经运动功能有改善；斜板角度及BBB评分均明显提高，差别有显著性意义(P < 0.05)。②组织学苏木精－伊红染色结果：实验组组织学破坏改变明显较生理盐水组轻。③凋亡神经细胞及计数结果：实验组脊髓神经细胞凋亡指数均明显下降，差异有显著性(P < 0.05)。
结论：早期应用外源性促红细胞生成素对脊髓不完全损伤后引起的神经运动功能损害具有保护作用,能明显改善脊髓损伤后的临床功能表现。此种保护作用与促红细胞生成素能够抑制神经细胞凋亡有关。
关键词：脊髓损伤，红细胞生成素，重组；细胞凋亡；注射，硬膜外；组织构建

陈淑强，徐又佳，俞晨，郝彦明，张振东，顾永平.肾源性细胞因子促红细胞生成素对急性脊髓损伤大鼠细胞凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2034-2038 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2034(ps).pdf]

中图分类号:R651.21
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02034-05

Protective effect of erythropoietin on neurocyte apoptosis following experimental acute spinal cord injury in rats

AIM:Erythropoietin, a cell factor produced by kidney, can protect spinal nerve from acute spine cord injury (SCI) in rat. The experiment explored the effects of erythropoietin on the apoptosis of neural cells.
METHODS: The experiment was performed in the animal laboratory of Second Affiliated Hospital of Soochow University from January to April 2007. ①Forty-eight adult male Sprague-Dawley rats of (270±10) g were randomly divided into normal group (n =6), sham operation group (n =6) underwent laminectomy procedure only, saline group (n =18) and treatment groups (n =18). The SCI models were established using the improved Allen method. The rats in treatment group were epidurally injected with 5 000 u/kg body mass of recombinant human erythropoietin (Kirin Beer Company, Japan, 3 000 IU per piece) 1, 6, and 24 hours after injury respectively (6 animals at each time point). Control group received normal saline epidurally at the same time point. ③Behavioral evaluation of the rats was made 48 hours after trauma by using the Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) scoring system and Rivlin's tiltboard experiment; Hematoxylin and eosin (HE) staining was performed for histological observation after injury. Injured spinal cord tissues cells apoptosis were examined by the terminal deoxynucleotidal transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) reaction.
RESULTS: ①Neuroethology evaluation: The both lower extremities of rats in normal group and sham operation group showed normal movement function. Compared to saline group, neuromotor function in rats after SCI was significantly improved in 1, 6 and 24 hours, and the angles of Rivlin's tiltboard experiment and the scores of BBB were significantly increased (P < 0.05). ②HE staining results suggested that the histological damage extent of the spine cord in treatment group was remarkably lessened compared with saline group. ③TUNEL staining: The number of TUNEL-positive cells was significantly decreased in the erythropoietin-treated rats (P < 0.05).
CONCLUSION: Early application of recombinant human erythropoietin can lessen the lesion of neuromotor function, and significantly improve the clinical function after SCI. The protection is partially due to the reduction of neural cell apoptosis.

Chen SQ, Xu YJ, Yu C, Hao YM, Zhang ZD, Gu YP.Protective effect of erythropoietin on neurocyte apoptosis following experimental acute spinal cord injury in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2034-2038(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2034(ps).pdf]

0 引言

脊髓损伤是骨科常见的严重疾患。如何有效的治疗一直是困扰医学界的一大课题。近年来发现促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) 即内源性造血生长因子不仅影响红系细胞，而且是一种多功能的营养因子，对中枢神经有良好的神经保护作用，并有望成为治疗脊髓损伤的一种新型药物[1-3]。已有文献报道在脊髓损伤的实验研究中发现促红细胞生成素可抑制脊髓损伤后神经细胞的继发性损伤，保护受损神经元[4-6]，但大多采用腹腔注射途径。本试验将采用人重组促红细胞生成素硬膜外腔注射方法，探讨促红细胞生成素在脊髓损伤后对损伤脊髓神经的神经保护作用。

设计：随机对照动物实验。
单位：苏州大学附属第二医院骨科。
材料：实验于2007-1/04在苏州大学附属第二医院动物实验室(BSL-2)完成。清洁级成年雄性SD大鼠48只 (苏州大学医学院实验动物中心提供，许可证号：FYXK 苏 2007- 0035)，体质量260~285 g，平均270.6 g。人重组促红细胞生成素(日本麒麟啤酒株式会社制造,规格3 000 IU /支)。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
设计、实施、评估者：本实验由第二作者设计，第一、第三、第四作者实施和评估，均受过相应的培训。
技术路线：
建立脊髓损伤模型及硬膜外置管术：采用改良Allen打击法[7]制作大鼠脊髓损伤模型，手术严格在无菌条件下完成。大鼠用40 g/L 水合氯醛(10 mL/ kg) 腹腔注射麻醉，备皮后，俯卧位固定，消毒，铺盖无菌巾单。按照Nystrom法[8]，以T12为中心，切开皮肤和肌肉，长约2 cm，显露T11~13棘突和椎板，咬除T12棘突和椎板，以T12脊髓为中心显露大小为3 mm×4 mm的打击区。在硬膜表面垫一曲度与脊髓表面一致的塑料垫片，用直径2.5 mm、重10 g的圆柱状金属棒在细玻璃管的引导下从7 cm高处垂直落下打击，造成以T12为中心的脊髓急性挫伤[致伤力为70 (g·cm)]。
实验分组：采用随机数字表法分为正常组6只，仅给与麻醉；假手术组6只，麻醉后行椎板切除术；生理盐水组18只，建立脊髓损伤模型，硬膜外腔注射生理盐水；实验组18只，建立脊髓损伤模型，硬膜外腔注射重组人促红细胞生成素5 000 IU/kg。
硬膜外置管术：大鼠脊髓损伤模型建立后将长约6 cm 的PE-10聚乙烯管(外径0.6 mm，内径0.3 mm，宁波安来科技公司)向大鼠尾端插入硬膜外腔约0.5 cm，严密缝合伤口肌肉层并固定导管，从皮肤切口一侧引出，缝合伤口后用乙醇灯烧灼末端封闭导管。损伤后每天3次人工按压膀胱排尿。假手术组仅行椎板切除。实验各组大鼠均肌注青霉素1次/d，分笼饲养。
重组人促红细胞生成素干预方法：分别于大鼠脊髓损伤后1，6，24 h(每个时间点6只)，剪除导管末端，用1 mL无菌胰岛素注射器(针尖29 G)，连接导管注药，缓慢推注约30 s。实验组予以重组人促红细胞生成素，5 000 u/(kg·bw)；生理盐水组于相同时间予以相同体积生理盐水。
神经行为学评分：采用改良斜板实验和BBB分级评分法[9]于术前、术后1 h和术后48 h双盲法评价各组大鼠双侧后肢运动功能。
改良斜板实验：斜板的斜面倾斜角度为可调控型。由2名非本课题组的实验人员分别观察, 记录后取其均值。①所有大鼠均于术前行斜板实验校正并筛选。记录各组大鼠维持平衡5 s时斜板的最大角度。②实验组、生理盐水组、假手
术组分别于术后1 h完全清醒后与术后24，48 h测量大鼠维持平衡5 s时斜板的最大角度。
BBB分级评分法：将大鼠置于开放的环境中，有两名熟悉掌握BBB评分标准的非本实验人员独立观察4 min并评分。BBB分级评分法根据脊髓损伤后动物后肢的运动能力分为21个等级即最高分为21分。主要观察：后肢关节的活动能力，能否负重脚掌站立,有无前后肢协调运动，后脚爪的伸展及着地情况和尾巴的平衡。评分取双后肢评分的均值。
原位末端标记法检测凋亡神经细胞染色：采用原位细胞死亡检测试剂盒(武汉博士德公司)。主要步骤：石蜡切片脱蜡和水化后，双蒸水冲洗，0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.6) 冲洗；20 mg/L 蛋白酶K溶于10 mmol /L Tris -HCl 液中(pH 7.4)，37 ℃ 水浴槽内消化30 min，磷酸盐缓冲液洗5 min×3 次;滴加原位末端标记反应液(TdT 酶溶液和地高辛标记的核苷酸混合物溶液于使用前按1∶1 比例混合)。每张切片50 μm，37 ℃ 孵育60 min。磷酸盐缓冲液后碱性磷酸酶转换液37 ℃ 孵育30 min。磷酸盐缓冲液冲洗后,NBTPBCIP显色5~15 min；磷酸盐缓冲液冲洗后,复染、脱水、中性树胶封固。
凋亡细胞计数：在伤后48 h取材，每个标本取损伤中心及头尾两端共3张切片，采用OlympusBX60显微镜双盲法进行镜检，观察大鼠急性脊髓损伤后凋亡神经细胞及其相关蛋白的表达情况。由2名非本课题组并且熟悉凋亡细胞形态的实验人员在高倍显微镜下随机选择3个不重叠视野观察统计凋亡细胞数。
主要观察指标：①各组大鼠神经行为学评分。②组织学苏木精－伊红染色结果。③凋亡神经细胞计数。
统计学方法：实验数据以_x±s表示，由第一作者采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析和两样本配对t 检验，P < 0.05 为差异有显著性意义。

2.1 实验动数数量分析实验选用大鼠48只，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠神经行为学评分斜板实验：正常组以及术前的假手术组、生理盐水组与实验组大鼠斜板实验角度为51°~55°；生理盐水组与实验组术后1 h大鼠完全清醒后斜板试验角度在27°~32°之间；在术后 48 h，各组大鼠斜板实验角度均较前提高；斜板实验角度实验组与同期生理盐水组相比均明显提高，差异均有显著性（P < 0.05），组间比较差异无统计学意义。见图1。
BBB分级评分：正常组、假手术组大鼠双下肢运动功能正常均为21分。生理盐水组、实验组大鼠术后1 h时后肢均呈不同程度弛缓性瘫痪，BBB评分在2~4分之间，仅有微小的限于髋、膝关节的非反射性运动；术后48 h各组BBB分值均有提高。接受重组人促红细胞生成素干预的实验组大鼠在术后48 h后肢出现髋、膝、距小腿关节（踝关节）部分自主活动，针刺激有反应，但不能对抗重力，偶尔可有脚背着地活动；实验组均较同期生理盐水组有明显的提高，差异有显著意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 大鼠脊髓组织学苏木精-伊红染色结果正常组及假手术组脊髓组织灰白质界限清楚，灰质内神经细胞体大，核仁清晰，白质内神经纤维排列致密有序（见图3）。在模型制作时，即可见损伤脊髓局部出血肿胀。苏木精－伊红染色切片光镜下可见损伤段有广泛出血，脊髓结构破坏，并有炎症细胞浸润，面积较实际打击损伤面积扩大。损伤中心部位有大量的神经细胞溶解死亡，出血坏死区也逐渐被空泡代替，形成大量的空泡区，结构散乱，白质中可见肿胀轴突和大量空泡，部分神经元尼氏体消失。灰质中仅存少量神经元，主要位于后角。部分神经细胞可见核固缩。促红细胞生成素实验组镜下也可见打击区有出血坏死，但脊髓结构的破坏程度较生理盐水组轻，空泡区明显少于生理盐水组，破坏面积也较生理盐水组小。(见图4，图5)。

2.4 各组大鼠凋亡神经细胞观察及计数原位末端标记法标记的阳性细胞胞核呈棕黑色，正常组及假手数组仅见偶染细胞,生理盐水组可见大量阳性细胞表达，白质及灰质中均可见，以白质中为主：阳性神经元细胞为核呈深褐色，胞浆呈棕色；阳性角质细胞较小，呈深褐色点状（见图6）。生理盐水组1，6，24 h凋亡细胞数量差异不是很大。与生理盐水组比较，实验组1，6，24 h组神经元和少突胶质细胞的原位末端标记法阳性细胞数明显减少（见图7），差异有显著性意义(P < 0.05)。见表1。

1911年Allen首先将脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。近年来随着研究的深入对脊髓损伤的具体机制有了更明确更细致的认识，但仍将其描述为一个原发性和继发性两个损伤阶段的过程 [10-12]。脊髓损伤的最终损伤程度不仅取决于原发性损伤的程度，更取决于继发性损伤造成的神经细胞死亡以及脊髓中央灰质的空洞化程度，所以预防继发损伤是早期治疗的关键。脊髓损伤发生后，损伤区会继发一系列的神经生化、微循环失调及炎症反应，引起大量病理性的细胞凋亡发生。
最近的研究中，促红细胞生成素是一种调节红细胞生成的肾源性细胞因子，被发现对中枢神经有明显的神经保护作用[1-3，13]。这种因子被发现有很多作用：包括调节微循环的作用，抑制凋亡减轻炎症反应，抗氧化作用，调节细胞兴奋性和神经干细胞分化增殖等。在大鼠脊髓损伤模型的实验中，一些作者报道在脊髓缺血或创伤中促红细胞生成素能够抑制损伤的扩大和发展，显著的促经神经功能的恢复，能明显预后[14-15]。促红细胞生成素通过与特异性促红细胞生成素受体结合，激活相应的信号转导途径发挥其生物学效应[14]。
除坏死外，细胞凋亡是迟发性脊髓损伤后神经细胞死亡的重要方式，近年来许多实验研究已证实[16-17]。调亡损伤被认为是急性脊髓损伤后神经功能改善的重要途径。Liu等[18] 1997年报告发现在脊髓损伤Allen打击模型中损伤范围神经细胞凋亡在灰质区伤后6 h即有出现但数量较少，24 h增多，48~72 h维持在最高水平；白质区6 h可见，48~72 h维持在最高水平。先前的研究结果与此相符合[19]。所以本实验选取48 h处死，即是在大鼠脊髓损伤后凋亡发生的高峰期获取标本，来观察各组的变化，这样更能准确而敏感的测定凋亡表达的差异性。
虽然在脊髓损伤中促红细胞生成素的具体神经保护作用的机制还不清楚，但研究表明促红细胞生成素在继发性损伤中对凋亡有着显著的影响力[20]。本实验通过不同时间应用促红细胞生成素干预脊髓损伤，试图对这方面进行探索。以往的研究多采用腹腔或静脉注射途径，但研究表明只有在促红细胞生成素注射量达500 IU/kg以上才对脊髓损伤有治疗效果[21]。硬膜外注射也是临床给药的一种常规途径，只是其操作难度较大不如上面两种简单易行，但现在直接采用药物来预防或治疗脊髓损伤已逐渐越来越多的应用[22]，麻醉科应用的最为广泛，硬膜外注射可以使药物直接作用于损伤局部，治疗作用更快更直接，减少药物的使用剂量，可降低促红细胞生成素可能的副作用。脑缺血缺氧损伤直接注射促红细胞生成素入大脑可以减轻神经组织的损伤[23]。本实验采用硬膜外途径应用促红细胞生成素干预，初步探讨此途径应用的效果。
本实验结果再次证实脊髓损伤后脊髓组织中神经细胞凋亡广泛存在, 在灰质和白质中均检测到阳性细胞, 白质中为主。应用外源性促红细胞生成素干预可以明显加快神经功能恢复，改善临床预后；神经细胞凋亡的发生明显减少。通过斜板试验和BBB评分结果表明，给药时间越早，脊髓前角运动神经元支配的下肢运动功能的恢复越好。这一结果与凋亡发生的出现及高峰时间有着密切的联系，根据对凋亡发生时间的研究，作者认为较早应用促红细胞生成素可抑制或者阻断凋亡启动发生的路径[19]，使凋亡细胞数量大大减少，从而降低继发性损伤程度。凋亡在损伤后24~48 h已达到高峰期，以后逐渐下降，伤后7 d仍存在，所以24 h组应用促红细胞生成素虽然仍有效，但不如1 h和6 h组更明显。在伤后1，6，24 h应用促红细胞生成素均有效说明促红细胞生成素的应用窗口比较宽，这更有利于临床上的实际应用。
综上所述, 早期应用外源性促红细胞生成素对脊髓不完全损伤后引起的神经运动功能损害具有保护作用此种保护作用与促红细胞生成素能够减少神经细胞凋亡有关。但是外源性促红细胞生成素是如何与脊髓神经细胞发生作用，通过何种信号级联途径来实现对神经细胞凋亡启动的抑制作用的仍需进一步研究。

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