淋巴瘤细胞系Raji细胞血管内皮细胞生长因子表达及基质胶中ECV304细胞血管形成与雷公藤内酯醇的干预*☆
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崔国惠，陈卫华，张 纯，陈 燕
课题背景：课题为国家自然科学基金资助项目（30472267）的部分实验内容。课题包括雷公藤内酯醇对核孔蛋白的调节作用、对血管内皮细胞生长因子及肿瘤血管生成的影响、对SDF-1/CXCR4生物学轴效应的作用等。
应用要点：实验利用细胞培养以及基质胶中血管形成实验证实雷公藤内酯醇具有抑制淋巴瘤Raji细胞表达及分泌血管内皮细胞生长因子，并抑制其介导的血管形成。
同行评价：雷公藤内酯醇作为雷公藤一个有效成分单体，其作用明确。本文对其影响淋巴瘤系Raji细胞血管内皮细胞生长因子表达合成分泌及相关血管生成机制进行观察，文章条理清楚，思路清晰，结果具有较强的实际意义。
华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，湖北省武汉市 430022
崔国惠☆，女，1963年生，湖北省宜昌市人，汉族，1986年白求恩医科大学毕业，博士，副教授，主要从事恶性血液病分子生物学方面研究。
ghcui@medmail.
com.cn
通讯作者：陈 燕，博士，教授，华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，湖北省武汉市 430022
国家自然科学基金资助项目
(30472267)*
摘要
目的:观察雷公藤内酯醇对淋巴瘤细胞系Raji细胞血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达、合成分泌以及对基质胶中ECV304细胞血管形成的影响。
方法：实验于2005-08/2006-02在华中科技大学同济医学院公共卫生学院分子生物学实验室完成。①MTT法检测3.125，6.25，12.5，25，50 nmol/L的雷公藤内酯醇在作用12，24，36，48，60，72 h对Raji细胞增殖的影响。②RT-PCR法检测12.5，25，50 nmol/L雷公藤内酯醇处理Raji细胞24 h后，细胞VEGFmRNA表达的变化。③ELISA法检测25 nmol/L雷公藤内酯醇处理Raji细胞24 h后，细胞培养上清VEGF的分泌量。④采用血管形成实验检测雷公藤内酯醇对ECV304细胞在基质胶中血管形成的影响。
结果：①雷公藤内酯醇以时间和剂量依赖方式抑制Raji细胞增殖，24 h半数抑制浓度为25 nmol/L。②Raji细胞内VEGFmRNA主要为VEGF165和VEGF121，雷公藤内酯醇明显抑制其表达，呈剂量依赖方式。③雷公藤内酯醇明显抑制Raji细胞VEGF的分泌量(P < 0.01)。④Raji细胞培养上清、10 μg/L VEGF处理的Raji细胞培养上清可促进ECV304细胞在基质胶中形成血管，而25 nmol/L雷公藤内酯醇处理的Raji细胞培养上清加入基质胶则未见血管形成。
结论：雷公藤内酯醇以时间和剂量依赖性方式抑制淋巴瘤细胞增殖、VEGF的表达分泌及血管形成。
关键词：雷公藤内酯醇；血管内皮细胞生长因子；血管形成����
崔国惠，陈卫华，张纯，陈燕. 淋巴瘤细胞系Raji细胞血管内皮细胞生长因子表达及基质胶中ECV304细胞血管形成与雷公藤内酯醇的干预 [J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2039-2042
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2039(ps).pdf]
中图分类号:R329.114
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02039-04
收稿日期：2007-07-24
修回日期：2008-01-22 (07-50-7-3991/N·Q)
Effects of triptolide on the expression of vascular endothelial growth factor in Raji cells and angiogenesis of ECV304 cells in matrigel
Abstract
AIM:To investigate the effect of triptolide on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in Raji cell line and on angiogenesis in cell line (ECV304).
METHODS: The experiment was performed at the Molecular Biology Laboratory of Public Health Constitute, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology from August 2005 to February 2006. ①The antiproliferative effects of triptolide (3.125, 6.25, 12.5, 25 and 50 nmol/L) against Raji cells were determined by the MTT method at 12, 24, 36, 48, 60 and 72 hours. ②After 24 hours incubations treated by different concentrations of triptolide (12.5, 25, 50 nmol/L), the mRNA level of VEGF by Raji cells was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). ③After 24 hours treatment with 25 nmol/L triptolide, VEGF concentrations in cell culture supernatants were determined by enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA). ④Effect of triptolide on angiopoiesis of ECV304 cells in matrigel was detected by angiopoiesis test.
RESULTS: ①The triptolide significantly inhibited the proliferation of Raji cells in time- and dose-dependent manner. IC50 value was 25 mmol/L. ②The mRNA expression of VEGF165 and VEGF121 (containing 165 and 121 amino acid residues, respectively) was detected in all groups. Triptolide reduced the mRNA expression of VEGF165 and VEGF121 in a dose-dependent manner. ③Triptolide significantly suppressed VEGF expression in Raji cells (P < 0.01). ④There was blood vessel formation on matrigel in the supernatants from Raji culture group and VEGF group. No network and cord formed were seen in control and triptolide groups.
CONCLUSION: Triptolide could inhibit the proliferation of Raji cells in time- and dose-dependent manners as well as the expressions of VEGF in Raji cells and angiogenesis in ECV304 cells.
Cui GH, Chen WH, Zhang C, Chen Y. Effects of triptolide on the expression of vascular endothelial growth factor in Raji cells and angiogenesis of ECV304 cells in matrigel.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2039-2042(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2039(ps).pdf]
0 引言
近年来的研究显示血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 是体内一种强效力的促血管生成因子，能直接或间接参与血管生成，在肿瘤的发生、发展及预后中具有极其重要的地位[1]。造血系统肿瘤也可产生包括VEGF在内的各种生长因子并与疾病的预后和对化疗药物的抗性有关[2-4]。中药成分雷公藤内酯醇具有免疫抑制及抗炎的作用,并在治疗免疫性疾病上取得了较好的疗效，其抗肿瘤作用亦愈来愈受到人们的关注。有研究表明雷公藤内酯醇能抑制内皮细胞VEGFmRNA表达及VEGF的合成与分泌 [5]。为进一步明确雷公藤内酯醇的抗肿瘤机制，本文观察雷公藤内酯醇对淋巴瘤细胞系Raji细胞VEGF的表达、合成分泌以及对基质胶中ECV304细胞血管形成的影响。
1 材料和方法
设计：随机区组对照实验。
单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所。
材料：实验于2005-08/2006-02在华中科技大学同济医学院公共卫生学院分子生物学实验室完成(BSL-2)。人淋巴瘤细胞系Raji和ECV细胞系来源于美国 ATCC，由武汉大学培养典藏中心提供。雷公藤内酯醇（Sigma公司）分子式为C20H24O6，相对分子质量为360.4，纯度99%，用二甲基亚砜溶解，0.22 μm微孔滤膜除菌，分装于-20 ℃冻存；基质胶(Becton Dickinson，USA), 用M 199培养基1∶1稀释，VEGF-ELISA试剂盒( R&D Systems,USA)；RNA抽提试剂Trizol(Life Technologies Inc., USA)，氯仿、异戊醇、乙醇为国产分析纯。RT-PCR试剂盒(Fermentas, Lithuania，USA)，引物由北京上海博亚公司合成。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预实验及评估为全部作者，均受过专业培训，未使用盲法评估。
技术路线：
细胞培养：Raji细胞悬浮、ECV细胞帖壁生长于RPMI1640培养液中，内含体积分数为0.1的胎牛血清，其中另加青霉素和链霉素各100 U/mL。于37 ℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度孵箱中培养。2或3 d换液传代1次，取对数生长期细胞作后续实验。
雷公藤内酯醇抑制Raji细胞增殖：应用MTT法检测，取处于指数生长期的Raji细胞，将细胞浓度调至2×108 L-1，接种在96孔培养板上，每孔加细胞悬液180 μL，实验孔加入 20μL不同浓度的雷公藤内酯醇，对照孔加入等体积溶剂，设4个复孔。将培养板放至37 ℃，体积分数为0.05的 CO2温箱培养至所需时间，加入MTT溶液，继续培养4 h后，离心，弃上清，加入DMSO，颗粒完全溶解后用酶标仪（美国宝特ELX800）在490 nm处测定每孔的吸光度值。细胞抑制率（%）=（1－雷公藤内酯醇各浓度组吸光光度值/空白对照组吸光光度值）×100%。每个实验重复3次。
Raji细胞上清的制备：取对数生长期的Raji细胞离心，调细胞数于2×108 L-1，接种于24孔板，分以下几组处理，每组设5个复孔：对照组不加入任何药物；雷公藤内酯醇组：雷公藤内酯醇终浓度分别为12.5，25，50 nmol/L，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度孵箱中培养 24 h。收集细胞，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清至-70°C，保存72 h 后用于后续实验。
培养细胞RNA的提取：按Trizol抽提试剂说明书进行。概言之，收集上述各组处理的细胞，离心，PBS洗涤，加入1 mL Trizol，冰浴30 min。将裂解液收集于1.5 mL EP管中，加入200 μL氯仿，振荡，冰浴5 min。4 ℃离心，12 000 g× 20 min，取上清，加入异丙醇，-20 ℃过夜；次日，4 ℃离心，12 000 g×20 min，弃上清，75% DEPC处理乙醇清洗一次，空气干燥10 min，
用30 μL DEPC水溶解。取2 μL稀释1 500倍测A值，测A260/ A280确定其浓度和纯度。计算RNA含量；另取5 μＬ做凝胶电泳，其余-80 ℃保存备用。
RT-PCR检测VEGFmRNA的表达：按试剂盒说明操作。VEGF引物序列为：上游引物： 5’-TCG GGC CTC CGA AAC CAT GA - 3’；下游引物：5’-CCT GGT GAG AGA TCT GGT TC-3’。VEGF引物可用来扩增所有的VEGF包括516，588，648，720 bp大小的同型体。β-actin引物序列：上游引物：5’-TCT ACA ATG AGC TGC GTG TG-3’；下游引物：5’-CAA CTA AGT CAT AGT CCG CC-3’，扩增产物878 bp。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光显影，SmartView 2000软件摄像。每个样本重复3次，用GelPro3软件灰度扫描分析，结果用3次样本的平均相对单位VEGF/β-actin表示。
ELISA法检测Raji细胞培养上清液中VEGF水平：取上述经25 nmol/L雷公藤内酯醇处理的冻存Raji细胞上清，室温融化，按试剂盒说明操作。设5个复孔，依次加样，孵育，洗涤，酶联仪(DG-3022A) 492 nm波长比色。检定样本A值，经计算机软件CurveExpert1.3求出标准曲线方程。计算出样本VEGF质量浓度(ng/L)。
基质胶中人类脐静脉内皮细胞起源的细胞系ECV细胞血管形成实验：实验方法参照文后参考文献[6]。 4 ℃冻融基质胶胶液，每400 μL基质胶加入100 μL 10×基质胶稀释液。24孔培养板每孔加入150 μL稀释基质胶，37 ℃孵育1 h成胶，将内皮细胞接种于基质胶上 (10 000个/孔)，实验共分4组，每组3孔，分别加入500 μL Raji细胞培养上清液、VEGF（10 μg/L）处理的Raji细胞培养上清液，雷公藤内酯醇（25 nmol/L）处理的Raji细胞培养上清液，对照组加入1640培养基500μL，37 ℃培养24 h，40倍Olympus倒置显微镜下观察血管生成情况。每孔检查5个视野，实验重复3次。
主要观察指标：①雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖的影响。②雷公藤内酯醇对Raji细胞分泌和表达VEGF的影响。③雷公藤内酯醇对基质胶中ECV304细胞血管形成的影响。
统计学方法：所有数据均用_x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。数据由第一作者采用SPSS 11.0软件包完成统计处理。
2 结果
2.1 雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖的影响 给予终浓度为3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 nmol/L的雷公藤内酯醇分别作用Raji细胞12，24，36，48，60和 72 h后，可明显抑制Raji细胞增殖，并随着浓度增加和作用时间延长，其抑制作用增强，呈时间和剂量依赖方式。作用24 h，其抑制率分别为12.7%, 15.6%, 31.5% and 52.8%,53.3% 和60.3%。24 h半数抑制浓度IC50为25 nmol/L。见图1。
2.2 基质胶中ECV细胞血管形成实验 由图2可以看出，在加入未处理的Raji细胞上清组和加入VEGF(10 μg/L)处理的Raji细胞上清组，可促进ECV304细胞在基质胶中形成血管；而雷公藤内酯醇(25 nmol/L)处理的Raji细胞上清组和对照组在基质胶中未见血管形成。
2.3 雷公藤内酯醇对Raji细胞VEGFmRNA表达的影响 见图3。
如图3显示：在Raji细胞内可检测出2种mRNA，VEGF165 mRNA 和 VEGF121 mRNA。与对照组比较，经12.5，25，50 nmol/L雷公藤内酯醇处理24 h，VEGF121/β-actin表达比值为0.48±0.08, 0.24±0.005 和0.05±0.004，对照组为0.71±0.014；VEGF121/β-actin表达比值分别为0.57±0.007,0.30±0.02 和 0.08±0.006,对照组0.67±0.015。随着雷公藤内酯醇浓度的增加，Raji细胞VEGF mRNA的表达逐渐降低，雷公藤内酯醇可显著减少VEGF165 mRNA和VEGF121 mRNA 表达(P < 0.01)。
2.4 Raji细胞培养上清的VEGF定量 雷公藤内酯醇 25 nmol/L作用24 h后细胞上清液中VEGF质量浓度为（48.56±9.87）ng/L，与对照组（168.94±23.98）ng/L比显著降低 (n=5，P < 0.01)。
3 讨论
雷公藤内酯醇是从雷公藤中分离到的二萜内酯化合物，许多研究表明雷公藤是很有希望的抗肿瘤药，可抑制各种肿瘤的生长，包括白血病、淋巴瘤[7-12]。但其作用机制尚未完全明了。VEGF是体内一种强效力的促血管生成因子，能直接或间接参与血管生成，在肿瘤的发生、发展及预后中具有极其重要的地位[1,4,13-14]。目前发现VEGF有6个异构体(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和VEGF206)，其中VEGF165 和V EGF121以可溶性蛋白形式存在，分泌到细胞外[15]，与内皮细胞表面的特异性受体结合，促进血管内皮细胞发生分裂和增殖，尤其是VEGF165,它的促血管作用最明显。而肿瘤细胞具有分泌血管内皮生长因子的功能，并可表达其受体，通过自分泌途径促进自身增殖[13]。目前普遍认为VEGF能增强肿瘤血管形成从而影响肿瘤的发生和发展。对于淋巴瘤,有研究发现霍奇金淋巴瘤患者血清中VEGF水平明显增加,治疗后则显著下降,是治疗有效的重要标志[16,17],同时有研究表明雷公藤内酯醇能抑制内皮细胞VEGFmRNA表达及VEGF的合成与分泌[5]。
为进一步明确雷公藤内酯醇的抗肿瘤机制，本文探讨雷公藤内酯醇对淋巴瘤细胞系Raji细胞VEGF的表达、合成分泌以及对基质胶中ECV304细胞血管形成的影响。结果显示雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖抑制作用呈时间和剂量依赖方式，浓度越高，作用时间越长，抑制作用越强。同时用RT-PCR在Raji细胞内共检测出了2种VEGFmRNA，分别为VEGF165和VEGF121。而雷公藤内酯醇可呈剂量依赖方式减少Raji细胞VEGF165和VEGF121mRNA表达；同时显著降低Raji细胞上清液中VEGF的含量，表明其可抑制淋巴瘤细胞分泌VEGF。同时在基质胶中ECV细胞血管形成实验中，我们发现Raji细胞上清和VEGF在基质胶中作用ECV细胞24 h后可促进血管形成，这一结果与Toshio 等报道基本一致[18-19]，表明VEGF与ECV细胞血管新生有关。而经雷公藤内酯醇处理的Raji细胞培养上清加入基质胶则未见血管形成，证实雷公藤内酯醇能抑制血管的形成。因此通过下调肿瘤细胞VEGF的表达抑制肿瘤细胞血管生长,最终阻抑肿瘤细胞的生长、增殖、黏附和迁移可能是雷公藤内酯醇抗肿瘤作用的重要机制之一。
综上所述，雷公藤内酯醇具有抑制淋巴瘤Raji细胞表达及分泌VEGF并抑制其介导的血管形成，这一结果对深入阐明雷公藤内酯醇的抗肿瘤作用机制及淋巴瘤转移机制具有重要意义。
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