肝细胞生长因子基因C57488A多态性与原发性高血压的关系*★

肝细胞生长因子基因C57488A多态性与原发性高血压的关系*★
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孟影，王邦宁

应用要点：试验观察了肝细胞生长因子的单核苷酸多态性分布与高血压发病的关系，而单核苷酸多态性作为一种分布广泛、遗传稳定的基因遗传标记，能充分地反映个体间的遗传差异。通过本课题的观察结果可能预测合肥地区汉族人群高血压的发病情况，及早提高预测青少年发生高血压的几率。

术语解析：单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。频率大于1%。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。单核苷酸多态性在人类基因组中广泛存在，平均每500~1 000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

偏倚或不足：①在试验的设计上，只是单纯分析了肝细胞生长因子的单核苷酸多态性与高血压发病间的可能关系，未能联合研究血肝细胞生长因子水平和单核苷酸多态性分布的关系，而进一步分析探讨血肝细胞生长因子水平具体受哪些单核苷酸多态性影响。②本试验采用的方法较为简单，仅观察了肝细胞生长因子的一个单核苷酸多态性位点，同时试验对象数目亦偏少。

安徽医科大学第一附属医院心内科1病区，安徽省合肥市 230022

孟影★，女，1982年生，安徽省阜南县人，汉族，安徽医科大学第一附属医院心内科在读硕士，主要从事高血压病的基因研究。
mengying1010@
sohu.com

通讯作者：王邦宁，主任医师，教授，安徽医科大学第一附属医院心内科1病区，安徽省合肥市
230022
wangbangning@
medmail.com.cn

摘要
目的:血管内皮细胞功能不全在高血压患者中普遍存在，肝细胞生长因子在内皮细胞功能不全中起重要作用，与高血压的流行、严重程度、靶器官受损等有关。探讨肝细胞生长因子基因C57488A的多态性在原发性高血压发病机制中的作用。
方法：①试验对象：选择2006-06/12在本院保健中心体检或本科室住院的原发性高血压患者共107例作为原发性高血压组，平均年龄（61±9）岁，其中有高血压家族史者共47例；所有对象均为合肥地区居住且无血缘关系的汉族人，患者对试验知情同意，试验经医院医学伦理委员会批准。病例收集按照中华医学会制订的高血压指南标准，收缩压≥140 mm Hg，或舒张压≥ 90 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，或明确诊断为高血压而接受药物治疗达1年以上者。1个月内仅服用降压药。同时选择未曾接受高血压药物治疗的健康人共110名作为正常对照组，平均年龄（60±8）岁；纳入标准：收缩压< 140 mm Hg，舒张压< 90 mm Hg，并排除高血压家族史。所有受试对象均详细调查家族史，排除继发性高血压、糖尿病、冠心病、甲状腺疾病、严重的肝肾疾病及心肺功能不全等。②试验方法及评估：所有受试对象均测定血压、身高、体质量，计算出体质量指数，常规生化测定总胆固醇、三酰甘油、极低密度脂蛋白、空腹血糖等。采用单一等位基因特异性引物PCR技术测定两组肝细胞生长因子的基因型及肝细胞生长因子C57488A基因多态性分布、各基因型和等位基因频率分布。
结果：纳入原发性高血压患者107例和健康人110名，均进入结果分析。①原发性高血压组和正常对照组的年龄、性别、体质量指数、三酰甘油、总胆固醇、极低密度脂蛋白和空腹血糖差异均无显著性(P > 0.05)。②所有受试对象基因多态性分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。原发性高血压组中有家族史者(47例)和无家族史者(60例)的CC、CA、AA基因型频率分别为0.809、0.170、0.021和0.733、0.233、0.033，C、A等位基因频率分别为0.894、0.106和0.850、0.150。正常对照组肝细胞生长因子基因C57488A 的CC、CA、AA基因型频率分别为0.527、0.355、0.060；C、A等位基因频率分别为0.705、0.295。③原发性高血压组中有家族史和无家族史者基因型CC和等位基因C频率均高于正常对照组(P < 0.01，P < 0.05)；有家族史者CC基因型频率和C等位基因频率均高于无家族史者，但差异无显著性 (P > 0.05)。
结论：合肥地区汉族人群原发性高血压的发生与肝细胞生长因子基因C57488A多态性有关，基因型CC和等位基因C可能是原发性高血压的易感因素。
关键词：肝细胞生长因子；原发性高血压；基因多态性

孟影，王邦宁.肝细胞生长因子基因C57488A多态性与原发性高血压的关系[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2043-2046 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2043(ps).pdf]

中图分类号:R392.114
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02043-04

AIM:The impaired function of vascular endothelial cells occurs popularly in hypertensive patients. Hepatocyte growth factor (HGF) plays a crucial role on impaired function, and is related to prevalence, severity and target organ damages of hypertension. This study explored the relationship between HGF gene C57488A polymorphism and essential hypertension (EH).
METHODS: ①Between June and December in 2006, totally 107 EH patients with an average age of (61±9) years, in them 47 cases with family history of hypertension, were recruited in this study. Informed consents were obtained from the patients who were all the Han residents of Hefei area, and the experiment was approved by the hospital ethical committee. The hypertension criteria formulated by Chinese Medical Association included the systolic pressure ≥140 mm Hg or diastolic pressure ≥ 90 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa), or having received drug therapy for hypertension over one year. The patients were administrated with hypotensive drugs with one month. Meanwhile 110 normotensives without family history of hypertension and drug therapy were served as controls, with an average age of (60±8) years. Inclusion criteria: systolic pressure < 140 mm Hg or diastolic pressure < 90 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa). All the subjects were surveyed for family history, excluding secondary hypertension, diabetes, coronary heart disease, thyroid disease, severe liver and kidney disease, cardiorespiratory function insufficiency and so on.②Detection parameters included blood pressure, height, weight, body mass index, and total cholesterol, triacylglycerol, very low density lipoprotein, fasting blood glucose were detected biochemically. Single allele-special primer polymerase chain reaction technique was used to examine the polymorphism of HGF genetypes and distribution of allele frequency in two groups.
RESULTS: Both 107 EH patients and 110 healthy controls were involved in the result analysis.①There were no significant differences in age, sex, body mass index, total cholesterol, triacylglycerol, very low density lipoprotein and fasting blood glucose between the EH group and the controls (P > 0.05).②The distributions of HGF gene C57488A polymorphism were in agreement with Hardy-Weinberg equilibrium, indicating population representativeness. The frequencies of three genotypes CC, CA, AA were 0.809, 0.170, 0.021 and C, A alleles were 0.894, 0.106 in the EH group with family history respectively. Correspondingly, the frequencies were 0.733, 0.233, 0.033 and 0.850, 0.150 respectively in the EH patients without family history. Meanwhile, the frequencies were 0.527, 0.355, 0.060 and 0.705, 0.295 respectively in the controls.③The frequencies of genotype CC and allele C were both significant higher in EH with or without family history compared with the controls (P < 0.01, P < 0.05), but no significant difference was observed between the EH with family history and those without family history (P > 0.05).
CONCLUSION: HGF gene C57488A polymorphism is possibly associated with EH, and genotype CC and allele C may be the factors of genetic predisposition of EH in Han population of Hefei area.

Meng Y, Wang BN.Hepatocyte growth factor gene C57488A polymorphism and essential hypertension.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2043-2046(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2043(ps).pdf]

0 引言

原发性高血压（Essential hypertension, EH）是一种由遗传因素和环境因素相互作用的多基因遗传性疾病，其中基因在高血压的发病中起30%的作用[1]，寻找与EH相关的易感基因、阐明EH发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。认为只要基因编码的蛋白质参与了血压调节机制，该基因就可以作为EH的候选基因[2]。目前参与血压调节机制主要有以下几个系统：肾素-血管紧张素-醛固酮系统，激肽释放酶-激肽系统，儿茶酚胺/肾上腺素能系统，钠通道异常，内皮功能不全及胰岛素抵抗等。关于以上大多系统物质基因与EH关系研究已经屡见报道[3-7]。而其中血管内皮细胞功能不全在高血压患者中普遍存在，在高血压的发病机制中扮演重要作用。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）是一种间质来源的多源性因子，近年来越来越多的研究表明其在内皮细胞功能不全中起重要作用[8]，与高血压的流行、严重程度、靶器官受损等有关[9]。而关于HGF的基因单核苷酸多态性与高血压关系的研究经检索万方数据库未见报道，本课题就此作一研究。

设计：病例-对照观察。
单位：安徽医科大学第一附属医院心内科1病区。
对象：选择2006-06/12在本院保健中心体检或本科室住院的EH患者共107例作为EH组，男64例，女43例，平均年龄(61±9)岁；其中有高血压家族史者共47例，男28例，女19例；按照中华医学会制订的高血压指南标准，收缩压≥140 mm Hg，或舒张压≥ 90 mm Hg (1 mm Hg = 0.133 kPa)，或明确诊断为高血压而接受药物治疗达1年以上者。1个月内仅服用降压药。同时选择未曾接受高血压药物治疗的健康人共110名作为正常对照组，男68例，女42例，平均年龄（60±8）岁；纳入标准：收缩压< 140 mm Hg，舒张压< 90 mm Hg，并排除高血压家族史。所有受试对象均详细调查家族史，有高血压家族史是指其父母至少1人或直系亲属中有1个人以上患EH。所有观察对象均排除继发性高血压、糖尿病、冠心病、甲状腺疾病、严重的肝肾疾病及心肺功能不全等。本试验经医院医学伦理委员会批准，患者对试验知情同意，所有对象均为合肥地区居住且无血缘关系的汉族人。
设计、实施、评估者：试验设计为第一、二作者，干预实施为第一作者，评估为第二作者。经过正规培训，采用盲法评估。
方法：
临床指标的测定：所有受试对象均测定血压、身高、体质量，计算出体质量指数，常规生化测定总胆固醇、三酰甘油、极低密度脂蛋白、空腹血糖等。
DNA提取：EDTA抗凝外周静脉全血 1 mL，用全血DNA试剂盒法（购于上海赛百盛生物工程有限公司）抽提基因组DNA。
HGF基因SNP检测：①通过美国NCBI（美国国家生物信息中心）的gene bank获取HGF序列及C57488A的SNP信息(rs2074725)。利用Prime 5.0和Oligo 6.53自行设计引物。引物由上海生物工程技术有限公司合成。②利用单一等位基因特异性引物PCR (Single allel-special primer PCR，SASP-PCR)技术检测HGF基因C57488A的基因型[10]。引物序列如下：HGF上游引物：P1-C（野生型）：5’-CAA ATT ATA GTC CAG AGC TTA CC-3’，P1-A（突变型）：5’-CAA ATT ATA GTC CAG AGC TTA CA-3’；HGF下游引物：P2：5’-TCT TGT GCC
AAA ACG AAA C-3’。原理见图1。③PCR反应：每检验一例研究对象的基因型分别需要进行两个PCR反应，其中一个管中加P1-C，另一个加P1-A，其余均相同。如下所示：总体积20 μL：10×Buffer 2 μL，dNTP 1 μL，Taq酶 0.2 μL，Primers各1 μL，DNA模板1.5 μL，MgCl2 1.5 μL，无菌水11.8 μL，短暂离心后PCR扩增。PCR参数：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性40 s，56 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，循环35次，72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 存放备检。扩增物用1.7%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光下检测电泳结果。

PCR结果判读：若P1-C与P2为阳性，P1-A与P2为阳性，则基因型为CA；若P1-C与P2为阴性，P1-A与P2为阳性，则基因型为AA；若P1-C与P2为阳性，P1-A与P2为阴性，则基因型为CC（阳性为PCR后电泳结果见到目的条带，阴性则相反）。
主要观察指标：EH组和正常对照组受试者的一般情况、HGF基因C57488A各基因型和等位基因频率分布。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 14.0软件完成统计处理，数据以_x±s表示；两组对象基因型和等位基因频率比较、基因型分布与Hardy-Weinberg平衡的符合程度用χ2检验或Fisher确切概率法；两组间均数比较采用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 参与者数量分析纳入EH患者107例和健康人110名，均进入结果分析，无脱落。
2.2 EH组和正常对照组受试者临床指标比较见表1。

两组间各指标均无显著性差异（P > 0.05）。因部分患者有服用降压药，未做两组间的血压比较。
2.3 基因型的判定如图2所示，1、3、5泳道为PCR中加P1-C引物的电泳结果；2、4、6泳道为加P1-A引物电泳结果。根据前述的SASP-PCR原理，则1、2泳道组为CA基因型；3、4组为AA基因型；5、6组为CC基因型。

2.4 HGF基因C57488A基因多态性分布所有受试对象共217例，基因型分别为CC140例、CA61例、AA16例，其频率分别为0.645、0.281、0.074，C、A等位基因频率为0.786、0.214。经检验，其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P > 0.05)，说明达到遗传平衡，具有群体代表性。
2.5 EH组和正常对照组HGF基因C57488A各基因型和等位基因频率分布见表2。

内皮功能不全在EH发病中扮演重要角色。国内外关于HGF与内皮细胞功能的研究颇多。蒋逸风等[11]研究发现HGF明显促进体外培养的血管内皮细胞的增殖和移行。Yamamoto等[12]研究发现，缺氧能诱发人主动脉内皮细胞发生凋亡，加入HGF后内皮细胞凋亡明显受到抑制。还有研究结果[13]与上述类似。上述研究显示HGF是内皮细胞特异性生长因子，促进内皮细胞增殖，抑制内皮细胞凋亡，提示HGF在高血压内皮细胞损伤方面可能起到一定的修复保护作用。
在血HGF水平与高血压临床研究方面不尽一致，少数学者报道血HGF水平与高血压无相关性[14-15]，而多数研究显现两者之间有相关性，如Nakamura等[9]发现， HGF水平与收缩压、舒张压呈正相关性，血压越高，HGF水平越高。在笔者[16]的前期研究中发现血HGF水平在3级高血压中最高，在2级和1级高血压中高于正常对照组。陈建英等[17]也就高血压与HGF水平、内皮细胞因子内皮素1、血管紧张素Ⅱ做一研究，结果发现1、2级高血压患者血HGF、内皮素1、血管紧张素Ⅱ水平明显高于正常对照组，且与平均动脉压正相关。这些研究结果提示HGF可能反映了高血压血管内皮功能不全的严重程度。而血HGF水平受基因调控，故而编码HGF基因的多态性可能与EH发病的遗传机制相关。
人HGF基因位于第7号染色体长臂7q11.2~21，全长70 kb，包括18个外显子和17个内含子[18]。国内外关于HGF基因多态性研究尚少，Motone等[19]研究了日本人群HGF基因C57488A的多态性与EH的关系，包括278例EH患者和376名对照组，结果显示EH发病率在CC基因型明显高于A等位基因，在女性、消瘦体形者中尤其显著。Takiuchi等[20]也进行了类似研究，结果显示HGF基因的C-1652T、T43839A、T44222C基因型、等位基因频率均与高血压无相关性。
本试验就合肥地区汉族EH组患者和正常对照组的HGF基因C57488A进行多态性分析，结果表明CC基因型频率、C等位基因频率EH组均高于正常对照组，差异显著(P < 0.01，P < 0.05)。其中两者频率在有家族史者亦高于无家族史者，但差异无显著性(P > 0.05)。所有受试对象基因符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则，与国外Motone等[19]报道一致。但Motone等对日本人群的研究结果显示其HGF基因C57488A的CC基因型略高于合肥汉族人群，提示其基因多态性分布具有一定的种族差异。
EH是一种环境因素和遗传因素共同作用的疾病，除了受地区和种族差异的影响外，还受受试者的年龄、性别、体质量指数等因素的影响。本试验保持EH组和正常对照组上述因素及一般临床生化指标齐同，尽量避免其对试验结果的影响。结果提示，合肥地区汉族人群HGF基因C57488A多态性与EH的发病可能有相关性，不论是否有高血压家族史，携带CC基因型、C等位基因均为高血压易感因素。

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