中医外治法干预运动创伤性膝关节炎模型兔膝关节滑膜中碱性成纤维细胞
生长因子的表达★
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廖八根1，2，徐 勇2，高鹏吉3
课题背景：中医外治法治疗运动创伤性骨关节炎后检测碱性成纤维细胞生长因子在兔关节滑膜中的表达及分布，观察中医外治对运动创伤性关节炎治疗作用的机制。
偏倚或不足：实验对照模型未进行安慰剂对照以及未采用双盲法可能对结果有一定影响。如果检测碱性成纤维细胞生长因子在兔关节软骨或软骨和滑膜中的表达及分布将更直接，更有意义。在治疗上采用内外兼治会更好。
相关链接：碱性成纤维细胞生长因子能够诱导外胚层和中胚层来源的细胞增殖及分化，具有强大的促有丝分裂作用，在软骨损伤后的修复中有很重要的作用。但动物研究显示使用碱性成纤维细胞生长因子可增加损伤后感染的机会，且过多的碱性成纤维细胞生长因子还促进软骨基质分解，因此如何避免这些问题值得关注。
1南方医科大学南方医院内分泌科，广东省广州市 510150；2广州体育学院运动医学室，广东省广州市 510076；3湖北中医学院，湖北省武汉市 430061
廖八根★，男，1966年生，江西省峡江市人，汉族，1994年中山医科大学毕业，硕士，副教授，主要从事运动与生存质量的研究。
bagen@21cn.com
摘要
目的:实验拟验证外治法治疗运动创伤性关节炎模型兔膝关节滑膜中碱性成纤维细胞生长因子的表达，探讨中医外治法治疗运动创伤性关节炎的可能机制。
方法：实验于2006-01/06在广州体育学院和南方医科大学内分泌实验室完成。①实验分组：普通级健康雄性新西兰大耳白兔24只，体质量2.1~2.6 kg；随机数字表法分为正常组、模型组和外治法组，每组8只。②实验方法：以Hulth模型制备运动创伤性关节炎模型。造模8周后外治法组用中药熏蒸配合手法弹拨以及电刺激治疗4周。③实验评估：4周后每组取部分切片行常规苏木精-伊红染色；另每组取部分石蜡切片行免疫组织化学SABC法观察实验动物膝关节滑膜碱性成纤维细胞生长因子的表达。
结果：纳入健康雄性新西兰大耳白兔24只，均进入结果分析。①滑膜组织结构变化：正常组滑膜无增生肥厚，滑膜组织苏木精-伊红染色见纤维细胞排列均匀、规则；关节软骨外观呈蓝白色，无裂纹及溃疡。模型组滑膜充血、部分粘连，苏木精-伊红染色见滑膜绒毛肥厚与纤维样化；关节软骨失去原有的光泽。外治法组的关节软骨皆仍有光泽，略发黄，软骨表面无明显的裂纹、糜烂及溃疡形成。②滑膜组织中细胞因子变化：碱性成纤维细胞生长因子免疫组织化学检测平均吸光度正常组为0.126 1±0.029 0，模型组为0.238 6±0.040 0，与外治法组0.513 5±0.038 0相比较，差异显著（P < 0.01）。
结论：外治法能够促进实验动物膝关节滑膜细胞碱性成纤维细胞生长因子的表达，以及受损软骨的修复。
关键词：运动创伤性关节炎；外治法；碱性成纤维细胞生长因子；组织构建
廖八根，徐勇，高鹏吉. 中医外治法干预运动创伤性膝关节炎模型兔膝关节滑膜中碱性成纤维细胞生长因子的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2047-2050 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2047(ps).pdf]
中图分类号:R874
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)11-02047-04
收稿日期：2007-12-20 修回日期：2008-02-27 (07-50-12-7081/WL·Q)
External treating therapy influences basic fibroblast growth factor expression in the knee synovium of rabbits with sports traumatic arthritis
Abstract
AIM:The study was to explore the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in the synovial tissue of experimental sports traumatic arthritis in rabbit knee with treatment of external treating therapy (ETT) and to investigate possible mechanism of ETT for sports traumatic arthritis.
METHODS: The experiment was conducted at the Guangzhou Institute of Physical Education and Laboratory of Endocrinology of Southern Medical University from January to June 2006. ①A total of 24 healthy male New Zealand rabbits, were randomized into 3 groups ( 8 in each group), a normal group, model group and ETT group. ②The model of sports traumatic arthritis was developed by Hulth technique. At the end of 8th week after modeling, rabbits in the ETT group received additional Chinese herb in combination with manipulation and eletrostimulation for 4 weeks. ③ After 4 weeks of therapy, some synovia were analyzed for microscopic morphology using hematoxylin-eosin (HE) staining, and some for the expression of bFGF using SABC immunohistochemic staining.
RESULTS: All 24 rabbits were involved in the final analysis. ①In normal group, there were no hyperplasia in synovium, and HE staining showed regular array of fiber cells. The surface of articular cartilage exhibited blue-white, and no fissuring or ulcer. In model group, there were obvious congestion and adhesion in the synovium, and HE staining showed fiber tissue hyperplasia and fibrosis. Articular cartilage lost original luminosity. In the ETT group, articular cartilage showed luminous, mild yellow, no fissuring or ulcer. ②Average absorbance (A) was 0.126 1±0.029 0 in the normal group, 0.238 6±0.040 0 in the model group, 0.513 5±0.038 0 in the ETT group respectively and there was a significant differences compared to the ETT group (P < 0.01).
CONCLUSION: ETT increases the expression of bFGF in the synovium of experimental sports traumatic arthritis in rabbit knee, and promote the repair of injured articular cartilage with sports traumatic arthritis.
Liao BG, Xu Y, Gao PJ. External treating therapy influences basic fibroblast growth factor expression in the knee synovium of rabbits with sports traumatic arthritis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2047-2050(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2047(ps).pdf]
0 引言
运动创伤性关节炎是由于连续的物理性或机械性损伤导致的可运动关节的软骨变性、破坏以及在此基础上的关节软骨、软骨下骨、滑膜、关节囊及周围肌肉和韧带的一系列改变而引起的关节功能障碍。其发生与运动中同一关节长期反复劳损以及关节暴力伤、关节内骨折、关节内异物存留等有关，而其病理过程和临床表现则与退行性骨关节病相同，但运动创伤性关节炎的发病年龄、发病部位和发病机制均与退行性骨关节病有别。
运动创伤性关节炎可发生于青壮年的任何关节，但多以髋、膝、踝、肩、肘等大关节多见[1]。有报道中医的外治法对运动创伤性关节炎有一定疗效，但其机制并不清楚[2-3]。碱性成纤维细胞生长因子能够诱导外胚层和中胚层来源的细胞增殖及分化，具有强大的促有丝分裂作用，在软骨损伤后的修复中有很重要的作用。本实验采用外治法治疗运动创伤性骨关节炎兔，检测兔关节滑膜中碱性成纤维细胞生长因子的表达及分布，探讨中医外治法发挥作用的可能机制。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
单位：广州体育学院运动医学室。
材料：实验于2006-01/06在广州体育学院和南方医科大学内分泌实验室完成。普通级健康雄性新西兰大耳白兔24只，体质量2.1~2.6 kg，购自中山医科大学实验动物中心。
主要试剂及仪器：碱性成纤维细胞生长因子一抗及过氧化物酶（SABC）即用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色盒均购自博士德公司。熏洗中药购自广州特别大药房，方剂采用湖北省中医院成方伤科熏洗汤，中药组成：羌活12 g，独活12 g，桂枝10 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，透骨草10 g，川椒10 g，艾叶10 g，五加皮12 g，海桐皮12 g，白芷10 g，防风10 g。G6805-1型针灸治疗仪为青岛鑫升实业有限公司生产。
设计、实施、评估者：实验设计为第二、三作者，干预实施及评估为第二作者。经过正规培训，未采用盲法评估。
方法：
模型制备：以Hulth模型为实验模型，取动物右侧后肢剪毛，确定其膝关节为手术模型复制关节，用3 g/L 戊巴比妥按3 mg/kg 体质量进行耳缘静脉麻醉，将家兔仰卧固定于兔台上，四肢伸直，术野皮肤常规无菌操作，取内侧髌旁入路，切断内侧副韧带，打开关节腔，剪断前后交叉韧带，并切除内侧半月板，术中按无菌技术操作并注意保护关节软骨面不受损伤。模型复制成功后，彻底止血，冲洗关节腔，逐层缝合，术后肌注青霉素 20万U/(只·d)，共7 d 预防感染。
干预分组：24只白兔随机数字表法分为正常组、模型组和外治法组，每组8只。正常组不做任何特殊处理。模型组造模成功后即开始清水、饲料喂养，自由活动。外治法组则用中药熏蒸配合手法弹拨以及电刺激，熏蒸30 min/次，手法弹拨20 min，以膝关节周围、股后侧及小腿后侧肌肉为主，配合伸膝关节；电刺激采用G6805-1型针灸治疗仪，配用自制电极，主要刺激兔股前侧及小腿后侧肌肉及膝周穴位，引起兔患膝被动屈伸达40°~ 50°为宜，主要以屈曲为主。模型组和外治法组均造模成功自由喂养8周后分别开始治疗，治疗4周后处死动物取标本，标本取出后100 g/L 多聚甲醛固定，送行石蜡切片。模型组和正常组均在相应时间处死，取标本做石蜡切片。
检测方法：每组取部分切片行常规苏木精-伊红染色；另每组取部分石蜡切片行免疫组织化学SABC法对碱性成纤维细胞生长因子的表达分布进行观察。取出后常规脱蜡至水，体积分数为0.03的双氧水室温5~10 min 灭活内源性酶。抗原热修复。滴加5%BSA封闭液，室温下20 min。加入稀释的一抗，4 ℃ 过夜，次日加入生物素标记的羊抗兔二抗，链霉亲合素生物素过氧化酶溶液与DAB液，室温显色，镜下控制反应时间。苏木精复染封固观察。其间每个步骤均用磷酸盐缓冲液冲洗5 min，共3次。在400倍光镜下每组选取15个典型视野，采用南方医科大学内分泌代谢实验室HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统进行分析。
结果判定：在400倍高倍镜下观察细胞内外有无染色，未着色为阴性，浅棕黄色为弱阳性，中等棕黄色为阳性，深棕黄色为强阳性。
主要观察指标：各组碱性成纤维细胞生长因子的表达。
统计学方法：由第二作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理，实验数据以_x±s表示，均值间差异比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 纳入健康雄性新西兰大耳白兔24只，均进入结果分析，无脱落。
2.2 苏木精-伊红染色结果 正常组取材时可见滑膜无增生肥厚，滑膜组织苏木精-伊红染色见纤维细胞排列均匀、规则，胞内结构正常；关节软骨外观呈蓝白色，色泽明亮，表面光滑，无裂纹及溃疡，见图1。而模型组滑膜充血、部分粘连，苏木精-伊红染色见滑膜绒毛肥厚与纤维样化；关节软骨失去原有的光泽，呈灰黄色，表面凸凹不平，有裂纹、糜烂及溃疡形成，见图2。外治法组滑膜纤维细胞排列仍不规则，但无明显纤维化；关节软骨皆仍有光泽，略发黄，软骨触之较硬，软骨表面无明显的裂纹、糜烂及溃疡形成，见图3。
2.3 各组碱性成纤维细胞生长因子的表达 正常组碱性成纤维细胞生长因子的平均吸光度为0.126 1±0.029 0，模型组为0.238 6±0.040 0，与外治法组0.513 5±0.038 0相比较，差异有显著性意义（P < 0.01）。
2.4 各组碱性成纤维细胞生长因子免疫组织化学染色结果 正常组免疫组织化学染色为阴性，见图4。模型组仅有部分细胞因子反应阳性、部分为弱阳性，胞浆中有黄褐色的斑块状阳性物质分布，但量较少，大部分细胞无着色，见图5。外治法组与正常组相比有所不同，胞浆中阳性物质数量增多，阳性细胞增加，见图6。
3 讨论
运动创伤性关节炎目前并无良好的康复疗法，笔者就读原单位临床上曾经采用中西医结合的外治法治疗运动创伤性关节炎取得了较满意的效果[2-3]，本实验进一步从生物学角度探讨其机制，与马建兵等[4]用同样的造模方法结果一致。
碱性成纤维细胞生长因子是一种能广泛地促进来源于中胚层及神经外胚层细胞增殖的生物活性物质。20世纪70年代中期Gosp-adarowicaz首次将其从牛脑垂体中初步提纯出来，因其能促进成纤维细胞增殖，故命名为成纤维细胞生长因子，其等电点为9.6，后来发现脑组织中除含上述成纤维细胞生长因子以外，尚有另外一种与其同源性较强、功能相似但等电点为5.6的成纤维细胞生长因子。为了区分这两种物质，故据其等电点不同，将前者命名为碱性成纤维细胞生长因子，后者命名为酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)。关于碱性成纤维细胞生长因子的研究发展很快，特别是近几年随着生物工程技术的发展，有关碱性成纤维细胞生长因子的研究已开始向临床应用发展[5-6]。
碱性成纤维细胞生长因子由于无分泌信号肽，因此并不能像经典的细胞因子一样分泌[7]。研究显示[8]它主要是通过损伤将储存的碱性成纤维细胞生长因子释放，因而也被认为是一“损伤激素”。适度的机械刺激促进细胞碱性成纤维细胞生长因子表达[9]，但过度的机械应力则损害细胞碱性成纤维细胞生长因子表达[10]。本实验模型组有少量表达，但采用中西医结合的外治法则显著促进了运动创伤性骨关节炎滑膜细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达。这一方面与熏洗中药主要具有活血化淤，祛风胜湿，温通经络的作用；通过熏洗的热效应和药物作用可以使淤滞的气血得以温通；改善了局部的微循环条件有关[11-13]。其中羌活、独活、五加皮、海桐皮、伸筋草、透骨草等祛风湿类中药有明显抗炎、镇痛作用[14]。另一方面也可能与电刺激以及手法治疗可促进其表达有关。
至于碱性成纤维细胞生长因子的功能，研究表明[15]在关节外，它可促进新生血管形成、软组织损伤修复，但在关节软骨，它的作用并不完全清楚。本实验外治法组滑膜细胞表达的碱性成纤维细胞生长因子明显增多，关节软骨形态明显改善。一般认为碱性成纤维细胞生长因子促进纤维和软骨细胞自身增殖和分化，但对软骨基质的影响则报道不一致[15]。Im等[17-18]认为损伤早期滑液中过多的碱性成纤维细胞生长因子可促发骨关节炎的发生。体外研究[16-19]显示碱性成纤维细胞生长因子可激活分解代谢途径从而使软骨基质分解重塑，同时研究也显示[18]碱性成纤维细胞生长因子与胰岛素样生长因子Ⅰ、转化生长因子β等可协同促进软骨细胞的增生和其蛋白合成功能。本实验外治法组滑膜细胞表达的碱性成纤维细胞生长因子明显增多并不意味释放至滑液中会显著增加，且由于外治法中的电刺激等可促进胰岛素样生长因子Ⅰ分泌[20]，因而可能通过两者协同而促进关节软骨修复。
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