刺激性G蛋白在病理性瘢痕组织中的表达*☆
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廖立新，王竟鹏
课题背景：G蛋白信号转导途径是重要的受体介导跨膜信号转导途径。G蛋白偶联受体已经被证实与病理性瘢痕的形成有关，而对于传导过程中关键性中间蛋白--G蛋白的研究却少见报道。因此探讨刺激性G蛋白是否参与了病理性瘢痕和正常皮肤的细胞跨膜信号转导，在哪些细胞中起作用以及刺激性G蛋白在病理性瘢痕形成中的作用，可为防治病理性瘢痕提供新的理论依据。
同行评价：病理性瘢痕形成机制一直是医学研究的热点，G蛋白是细胞信号转导的重要途径。实验检测刺激性G蛋白在病理性瘢痕组织中表达，探讨G蛋白信号转导途径对病理性瘢痕形成的影响，选题有新意，科研设计较合理，方法可行，结果可靠，为病理性瘢痕形成的分子生物学机制研究提供了新的思路。
相关链接：细胞信号传导途径包括很多，主要有细胞间、细胞内、细胞与周围物质、细胞跨膜信号传导等，对细胞跨膜信号传导的研究已经成为新的热点。G蛋白是重要的跨膜信号转导蛋白，参与广泛的细胞生物学活动。国内对急性肺损伤后兔的肺动脉、心肌、脑等组织、哮喘豚鼠肺组织等G蛋白的变化进行了系统的研究，证实G蛋白与许多疾病有关。而对病理性瘢痕中G蛋白的作用尚不清楚。
南昌大学第一附属医院烧伤中心，江西省南昌市
330006
廖立新☆，男，1966年生，江西省高安县人，汉族，2003年江西医学院毕业，博士，主任医师，主要从事烧伤创面修复研究。
llx200532@sina.com
国家自然科学基金资助项目（30660234）*
摘要
目的:比较增生性瘢痕组织和正常皮肤组织刺激性G蛋白的表达差异，以明确刺激性G蛋白病理性瘢痕形成中的作用机制及其在哪些细胞中发挥作用。
方法：实验于2005-09/2006-12在南昌大学第一附属医院烧伤研究所实验室完成。 取10例18~38岁瘢痕整形手术患者术中剩余的全厚正常皮肤和切除的病理性瘢痕组织，采用PR-PCR法检测刺激性G蛋白的基因表达，免疫组织化学法检测G蛋白的表达，比较病理性瘢痕组织与正常皮肤组织间的差异。
结果：①PR-PCR法检测发现两种组织均有刺激性G蛋白基因表达，利用凝胶图像处理系统分析，病理性瘢痕和内参照比值高于正常皮肤和内参照（P < 0.05）。②免疫组织化学检测后发现两种组织均有刺激性G蛋白的表达，均分布在表皮的基底细胞内、真皮的成纤维细胞内和毛细血管的内皮细胞内。在细胞内表达的部位符合G蛋白的本身性质（胞浆侧），两种组织的表达分布没有明显差异。③大体观察病理性瘢痕组织和正常皮肤的基底细胞刺激性G蛋白表达均为阳性，但无明显差异；真皮的成纤维细胞内和毛细血管内皮细胞内病理性瘢痕的表达强于正常皮肤。
结论：刺激性G蛋白可能参与病理性瘢痕中成纤维细胞和毛细血管内皮细胞的增殖调控。
关键词：刺激性G蛋白；病理性瘢痕；皮肤；组织构建
廖立新，王竟鹏.刺激性G蛋白在病理性瘢痕组织中的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2051-2055 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2051(ps).pdf]
中图分类号:R619.6
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02051-05
收稿日期：2007-08-17 修回日期：2007-10-13 （07-50-8-4468/N·A）
Stimulatory G protein expression in pathological scar
Abstract
AIM:To compare the expression difference in stimulatory G protein between hyperplastic scar and normal skin, so as to explore the formation mechanism of pathological scar.
METHODS: The experiment was conducted in the laboratory of Burn Center, First Affiliated Hospital of Nanchang University from September 2005 to December 2006. All-thickness normal skin and pathological scar were from patients aged 18－38 years old who underwent scar plastic operation. The expression of stimulatory G protein mRNA in sample was detected using PR-PCR method, and G protein expression was detected using immunohistochemical method. The expressions in pathological scar and normal skin were compared.
RESULTS: ①Stimulatory G protein mRNA expression was found in both tissues by PR-PCR. But gel image processing system analysis showed that pathological scar Gs α／β-action was significantly higher than normal skin Gs α／β-action (P < 0.05). ②Immunohistochemical detection suggested that the expression of stimulatory G protein was found in both pathological scar and normal skin, distributing in epidermal basal cell, hypodermal fibroblast and blood capillary endothelial cell. The distribution of expression in the two tissues had no difference. ③In gross observation, positive expression in epidermal basal cell of pathological scar and normal skin had no obvious difference. The expression in hypodermal fibroblast and blood capillary endothelial cell of pathological scar was stronger than that in normal skin.
CONCLUSION: Stimulatory G protein may play a role in the proliferation and regulation of fibroblast and blood capillary endothelial cell in pathological scar.
Liao LX, Wang JP.Stimulatory G protein expression in pathological scar.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2051-2055(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2051(ps).pdf]
0 引言
病理性瘢痕形成的分子生物学机制的研究多集中在血管形成、细胞成分、细胞因子、胶原代谢等方面[1]，虽然研究方向很多，但是最终要面临一个问题，这些因素是通过何种途径影响到细胞内的物质变化的呢？近年来很多研究机构开始对病理性瘢痕的细胞信号传导机制进行研究，并且取得了一些重要的进展。目前发现的病理性瘢痕的细胞跨膜途径信号转导途径很多，如蛋白酪氨酸激酶途径等等。G蛋白信号转导途径是目前已知的5条受体介导跨膜信号转导途径中的一条，大量的G蛋白偶联受体已经被证实与病理性瘢痕的形成有关，如白细胞介素1受体等[2-4]。那么对病理性瘢痕G蛋白的研究将进一步揭开和丰富病理性瘢痕细胞信号转导的机制。
1 材料和方法
设计：单一样本、自身对照设计。
单位：南昌大学第一附属医院。
材料：实验于2005-09/2006-12在南昌大学第一附属医院烧伤研究所实验室完成。
标本获取：手术切取10例18~38岁的南昌大学第一附属医院烧伤中心瘢痕整形手术患者术中剩余的全厚正常皮肤和切除的病理性瘢痕组织，每例患者取病理性瘢痕和正常皮肤各2块。均通过患者家属和本人同意。病程在烧伤创面愈合后6~9个月，在此期间没有接受针对瘢痕的各种治疗。以上标本均经过病理苏木精-伊红染色证实。将手术取下的组织标本剪小后分装迅速装入液氮罐中备用。
试剂：总RNA提取盒100 mL (TRNzol) LOT#F4104(TIANGEN公司)；异丙醇100 mL，无水乙醇100 mL，氯仿500 mL (以上3种均为上海化学试剂公司)；无RNA酶(Rnase)水25 mL LOT#21389901(美国Promega公司)；DEPC水5G DB0154 LOT 0104S04 (捷瑞生物工程(上海)有限公司)；反转录试剂盒100人次 CAT.#A3802 (美国Promega公司)；PCR反应试剂盒100人次CAT.#A3802 (美国Promega公司)；引物和β-action(内参照)均由北京均尧伟业生物技术公司合成；琼脂糖电泳10 g (美国Promega公司)；Maker Dill2000 (TIANGEN公司)；溴乙锭、溴芬蓝 (北京医学生物公司)；刺激性G蛋白兔抗人多克隆抗体(一抗) Gαs (K-20)：SC-823(美国SANTA CRUZ公司)；二抗(抗兔)(上海生物技术公司)；SP免疫组化试剂 (福建迈新生物公司)、DAB显色剂 (福建迈新生物公司)。
主要仪器：-80 ℃ 超低温冰箱，-86 ℃ UTL-FREEZER(美国THERMO FORMA公司)；超净工作台：HEAL-FORCE (上海力华科技公司)；高速低温离心机(Beckman公司)；台式高速离心机 TGL-16G (上海医用仪器厂)；微量台式加热器 REACTOR 4800(厦门安普利公司)；旋涡混合仪 HQ-601 (北方同正生物技术发展公司)；微型台式真空泵 GQL-802 (江苏海门市麒麟医用仪器厂)；PCR循环仪 P9600 (美国P公司)；电泳槽 S-60 (上海医用仪器厂)；凝胶图像处理系统 GIS (中国天能有限公司)；紫外线分光度计 T102 (上海医用仪器厂)；全自动石蜡包埋机 （苏州生物工程公司）、连续切片机（上海医用器械厂）。
设计、实施、评估者：第一、二作者完成。
方法：
mRNA 提取：①按照TRIZOL法进行提取。匀浆处理病理性瘢痕和正常皮肤：取组织100 mg加入1 mL TRNzol，用匀浆器进行匀浆处理，因为组织较硬所以力度和时间加强，样品的体积一般不超过TRNzol体积的10%。②将匀浆样品在15~30 ℃ 放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。③ 4 ℃ 10 000 r/min 离心10 min，取上清。④每使用1 mLTRNzol加0.2 mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。⑤ 4 ℃ 10 000 r/min离心10~15 min，样品会分为3层：黄色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相约600 μL转移到新管中。⑥在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20~30 min。⑦ 4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。⑧加入1 mL体积分数为0.75的乙醇洗涤沉淀，每使用1 mL TRNzol至少用 1 mL体积分数为0.75的乙醇对沉淀进行洗涤。⑨ 4 ℃ 5 000 r/min离心3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。⑩室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后很难溶解，晾干2.0~3.0 min即可），加入50 μL无核酶水，反复吹打、混匀充分溶解RNA。
对提取的mRNA进行纯度检测：取10 μL RNA 样品，15 g/L琼脂糖凝胶上样进行电泳(电泳60 V，30 min)，检查RNA 的完整性。紫外分光光度法测定RNA 样品的A260和A280值，确定样品纯度。提取的RNA 进行琼脂糖凝胶电泳5S，18S，28S 清晰可见，且28S 比18S 带亮度大两三倍，带与带之间无明显拖尾现象，表明RNA无降解，无明显的DNA污染，RNA 样品A260，A280 的比值均在1.8~2.0，说明RNA 未被蛋白质、酚污染。
反转录(cDNA获取)：①严格按照操作说明进行，而且所用器皿均和总RNA提取一样（DEPC水浸泡，高压，烘烤）。总反应体积20 μL。②样品混合物制备：样品 4 μL +随机引物1 μL，总体积5 μL，放入-70 ℃ 冰箱5 min，然后放-35 ℃ 冰箱保存。③反转录酶混合物的制备：无核酶水 6 μL、5×buffer 4 μL、MgCl2 (25 mmol/L)2.4 μL、DNTP(10 mmol/L) 1 μL、Ribonidoner inhibitor 0.6 μL反转录酶(RT)1 μL 总共15 μL。要严格操作加液要准确和快速。④将上述的两种混合物混匀。25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。提前在金属浴仪上设定。
PCR扩增：①引物。Gsα引物：上游引物 5’-TCT GTG GGA GGA TGA AG-3’，下游引物 5’-CGG TTG GTC TGG TTG TC-3’，预计扩增片段339 bp；β-action 引物：上游引物5’-CCG CCC TAG GCA CCA GGG TG-3’，下游引物5’-GGC TGG GGT GTT GAA GGT CTC AAA-3’，预计扩增片段286 bp。②按照引物说明书操作：引物配制成10 g/L。在PCR循环仪上设定好PCR 反应的变性、退火和延伸条件94 ℃ 60 s，58 ℃ 90 s 和 72 ℃ 120 s 共35 个循环。③将反转录来的cDNA进行PCR扩增反应。反应体积50 μL。反应体系如下：10×buffer 5 μL、MgCl2（25 mmol/L）2.4 μL、DNTP （2.5 mmol/L）1 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、CDNA产物5 μL、无核酶水 29.5 μL taq酶 0.5 μL。总共 50 μL。用枪头反复混匀。放入PCR扩增仪中，设定 PCR反应的变性、退火和延伸条件分别为 94 ℃ 60 s、58 ℃ 90 s 和72 ℃ 120 s 共35个循环。
扩增产物电泳与分析：①产物电泳制备：电泳缓冲液:5×TBE，再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE(工作液浓度)。0.6 g琼脂糖+40 mL电泳缓冲液，微波炉中火30 s至沸腾熔化的琼脂物冷却至60 ℃ 时加入10 g/L溴化乙锭4 μL，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30~45 min后进行电泳。②将梳子小心拔出，maker 8 μL和样品分别加到孔中。将凝胶置入电泳槽中，进行电泳。电压80~100 mV，20~30 min。在紫外线分光计下观察，如有目标条带出现。将凝胶置入凝胶图像分析系统，进行分析。记录目标条带和内参的灰度比值。③病理性瘢痕和正常皮肤的苏木精-伊红染色和免疫组织化学（SP法）染色。
苏木精-伊红染色：取制备好的标本以苦味酸固定24 h以上。用体积分数为0.5的乙醇反复漂洗直到无黄色出现，乙醇脱水共2 h，二甲苯透明30 min，浸蜡3 h，包埋。石蜡连续切片。捞片可用常规玻片。60 ℃ 温箱中烤片30 min。脱蜡30 min，体积分数为0.95的乙醇过两次，体积分数为0.8的乙醇过一次。Mayer’s 苏木精染色5~ 10 min，流水冲洗 10 min，伊红染色片刻。体积分数为0.95的乙醇过两次，体积分数为1的乙醇过一次，石碳酸- 二甲苯中浸泡1.0~2.0 min，二甲苯过两次，不需烘干，即可用中性树胶封固。置于光镜下观察病理性瘢痕和正常皮肤的结构并拍照。
免疫组织化学染色：取制备好的标本以苦味酸固定24 h以上。用体积分数为0.5的乙醇反复漂洗直到无黄色出现，乙醇脱水共2 h，二甲苯透明30 min,浸蜡3 h，包埋。石蜡连续切片。作免疫组化需用硅化玻片。将石蜡切片常规脱蜡，体积分数为0.03的H2O2-甲醇室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，滴加正常山羊血清工作液封闭，室温孵育 30 min，甩去多余液体，放入高压锅内进行热修复,使抗原充分暴露。15 min后取出。加入1∶100稀释的一抗（兔抗人），30 min。PBS冲洗，滴加生物素标记二抗工作液（抗兔），37 ℃ 孵育20 min，PBS冲洗3次，用DAB显色，苏木精复染，常规脱水、封固，显微镜下观察。细胞膜胞浆侧染成黄色为阳性。判断标准：所有细胞均无黄染为阴性；部分细胞黄染为弱阳性；全部细胞黄染为阳性；全部细胞黄染且颜色加深呈黄褐色或褐色为强阳性。结合蛋白表达特性进行鉴定。
主要观察指标：①刺激性G蛋白在病理性瘢痕中的基因表达：记录目标条带和内参的灰度比值。②病理性瘢痕和正常皮肤的苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色显示的刺激性G蛋白表达情况。
统计学方法：由第一作者用SSPS统计软件进行t检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。
2 结果
2.1 总RNA提取 提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳 5S，18S，28S 清晰可见，且28S比18S带亮度大两三倍，带与带之间无明显拖尾现象，表明RNA 无降解，无明显的DNA污染；RNA样品A 260/A 280的比值均在1.8~2.0，说明RNA未被蛋白质、酚污染。
2.2 PCR扩增产物电泳结果 目标条带和内参条带清晰，无明显拖尾现象。和MAKER对照，目标条带和内参条带的相对分子质量符合要求，为实验所需条带(图1，2)。
分别记录各条带的灰度值，并记录目标条带和内参条带灰度值比值，病理性瘢痕组为0.73±0.04，正常皮肤组为0.49±0.03，两组比较差异有显著性意义（P < 0.05）。
2.3 苏木精-伊红染色结果 与正常皮肤比较，病理性瘢痕表皮角化严重，较厚、无皮脂腺、汗腺、毛囊。真皮层较厚，含有大量的胶原纤维，排列紊乱，含有较多成纤维细胞，及毛细血管。所取标本符合实验需要(图3)。
2.4 刺激性G蛋白的表达 见图4。
从免疫组织化学染色来看，病理性瘢痕和正常皮肤均有细胞胞浆侧黄褐色细胞存在，均分布在表皮的基底细胞内、真皮的成纤维细胞内和毛细血管的内皮细胞内，两者无差异。根据黄染的深浅评估：病理性瘢痕和正常皮肤的刺激性G蛋白在表皮的基底细胞内表达情况相似，无明显差异。真皮的成纤维细胞内和毛细血管的内皮细胞内病理性瘢痕的表达强于正常皮肤。
3 讨论
G蛋白是能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有水解GTP生成GDP即具有GTP 酶活性的蛋白，位于细胞膜胞浆面的外周蛋白，一般是指与膜受体偶联的异源三聚体[5]，由三个亚基组成它们是α亚基、β亚基、γ亚基，至少有21种不同的α亚基，5种β亚基和8种γ亚基[6]。G蛋白分类有许多种，常根据其对腺苷酸环化酶（AC）的作用，可分为激动型G蛋白（Gs），抑制型G蛋白（Gi）和磷脂酶C型G蛋白（Gp）。由于Gs 和Gi 分别具有刺激和抑制腺苷酸环化酶的作用，因此腺苷酸环化酶的活性与两种G蛋白的表达水平有关,在许多细胞系中均发现G蛋白的含量与腺苷酸环化酶/cAMP信号系统的激活直接相关[7]。由于刺激性G蛋白分类比较单一，而且其作用在很多疾病中的研究中已经得到验证，所以本实验以病理性瘢痕和正常皮肤中刺激性G蛋白的表达为研究对象。
G蛋白偶联的信号传导系统由G蛋白偶联受体(GPRS)，G蛋白和效应器 (腺苷酸环化酶、磷脂酶C、Ca离子通道、K离子通道等) 组成。GPRS是已知3类涉及跨膜信号传导的膜受体之一。目前已有2 000多种GPRS得到确认[8]。这构成了人体最大的蛋白质超家族。G蛋白传导由GPRS接受的信号，再以G蛋白解离亚基作为传导物，活化相应酶和离子通道，产生重要的第二信使从而引起胞内相应的生物反应。GPRS是一类重要的细胞表面受体，跨过细胞双磷脂层，并能传导各种细胞外的蛋白质超家族[9-11]。
一般认为，在信号转导过程中G蛋白主要起到以下作用[12-13]：①信号放大作用：通常情况下，一个细胞外信号激活的受体可以激活许多G蛋白，从而向细胞内传递更多的信号，起到级联作用；另外，在一些情况下，细胞外信号与受体结合的时间比较短，不能产生足够的放大作用，但是与之相比，G蛋白结合GTP而被激活的时间长一些，有10~15 s，所以虽然受体与外界信号已经分离，但是G蛋白仍在激活相关酶系统，源源不断地向细胞内传递信号。②分子开关作用：信号转导过程中，G蛋白提供了一个重要的调节控制作用，它与GTP的结合开启了信号转换通路。另外，G蛋白自身共价修饰及浓度的改变也都会影响受体和酶之间偶联的有效性，细菌毒素效应能很好地说明该观点。正常的生理条件下，G蛋白与GTP、GDP结合状态的可逆变化使一些信号转导精确而适度、不是持续的而是对细胞外信号的瞬间的反应，一旦破坏了这种正常的正、负反馈机制，细胞就会发生病变。虽然，G蛋白在信号转导过程中具有信号放大的作用，但是，这种放大作用不能无限地大，必须受到适度的控制，这就体现了G蛋白的分子开关作用[14]。另外G蛋白也可诱导细胞凋亡[15]。
许多研究证实伤口液中bFGF、TGF-β和PDGF 等多肽生长因子的含量明显升高，这种高浓度的生长因子在瘢痕增生时持续存在，而瘢痕成熟后则恢复正常水平[16]。近年的研究表明，生长因子信号主要通过Ras -通道传递,还涉及Ca2+、IP3、DG - PKC 通道，而这些通道也存在于G蛋白偶联的信号传导系统中，主要成分也是G蛋白偶联的信号传导系统中重要的效应器，至于是由Gs还是其他的G蛋白介导需要进一步的研究。Gs已经证实可以激活Ca2+通道，跨膜信号转导是一个很复杂的系统，多条信号传导途径并存和存在交叉，多条信号传导途径可能通过同一效应器起作用，也可能一条信号传导途径通过多个效应器起作用。生长因子可活化Ras通道，还活化热休克蛋白25/27并影响肌动蛋白形成和分泌，后者与瘢痕挛缩有关。结果显示瘢痕增生越明显PKC活性升高越显著,揭示病理性瘢痕组织中PKC活化缺乏对细胞生长的负反馈抑制。FasR-Fas在调控细胞增殖和凋亡中所起的重要作用在众多研究领域中已得到广泛的重视。而且Fas介导的凋亡还被认为是成纤维细胞内死亡信号传递的最主要通道[17]。这表明瘢痕疙瘩这种Fas介导的凋亡抗性是导致瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖(高增殖 低凋亡)的细胞生物学机制之一[18]。G蛋白也参与了多种细胞的凋亡过程，然而它是通过Fas介导的凋亡，还是另有通道这还需进一步的研究。但是PKC作为G蛋白偶联的信号传导系统中重要的效应器，在细胞的信号传导中起着非常重要的作用。本实验病理性瘢痕的真皮成纤维细胞和血管内皮细胞刺激性G蛋白表达明显高于正常皮肤，是否刺激性G蛋白与PKC相偶联，由于前者的高表达引起PKC 活性升高，从而缺乏对细胞生长的负反馈抑制，引起成纤维细胞的过度增殖，促进病理性瘢痕的形成。还需进一步的研究。
从本实验的结果来分析，病理性瘢痕和正常皮肤中刺激性G蛋白主要表达在真皮的成纤维细胞内。病理性瘢痕的真皮成纤维细胞刺激性G蛋白表达明显高于正常皮肤，而且刺激性G蛋白在很多细胞系中都起到促进细胞增殖的作用。从而认为，这可能与成纤维细胞增殖有关。对于什么原因引起刺激性G蛋白的高表达，其具体机制尚有待于进一步的研究。
本实验的免疫组化结果显示病理性瘢痕和正常皮肤中刺激性G蛋白在毛细血管内皮细胞内存在显著差异的表达，病理性瘢痕的表达明显高于正常皮肤的表达，表明刺激性G蛋白可能参与增生性瘢痕中血管内皮细胞的增殖，而且刺激性G蛋白可能对血管内皮细胞的增殖存在促进作用。但是其具体机制还有待于进一步研究。
总而言之，病理性瘢痕和正常皮肤均有刺激性G蛋白的表达；其表达在表皮的基底细胞内无明显差异；但在真皮的成纤维细胞内和毛细血管内皮细胞内的表达存在明显差异。前者高于后者。这可能与病理性瘢痕中成纤维细胞和毛细血管内皮细胞的增殖有关。
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