离体人皮肤成纤维细胞热损伤后转归的形态学观察***★

离体人皮肤成纤维细胞热损伤后转归的形态学观察***★ �

李德全，黄晓元，杨兴华

课题背景：课题为国家自然科学基金资助项目（30772255/C3030308）；教育部博士点基金资助项目（20060533049）；解放军第三军医大学创伤，烧伤，复合伤国家重点实验室开放课题资助项目。上世纪80年代曾有零散的关于成纤维细胞生存率的报道，此后类似的工作一度停滞。受脱细胞真皮的启发，本科近年来开展的“自体薄皮片覆盖变性真皮”手术取得了良好的疗效。因此，实验设计了对热损伤后变性皮肤成纤维细胞恢复情况进行的系列研究，希望为临床治疗提供帮助。

应用要点：本实验结果为进一步研究变性真皮皮肤成纤维细胞功能改变、恢复及相关的保护机制打下了坚实的基础，有利于在细胞生物学层面上深刻理解“自体薄皮片覆盖变性真皮”手术及取得的良好效果。

偏倚或不足：①本文设计上最大的难点就是变性成纤维细胞中“变性”这一概念如何把握？即体外培养的成纤维细胞热损伤到什么程度才能最大限度地反映创面变性真皮皮肤成纤维细胞的形态及功能的变化？目前国外还没有相关的文献报道，国内专家认识也还没有达成一致。同时，与二维培养相比，三维培养成纤维细胞更能模拟皮肤中成纤维细胞的特性，三维培养成纤维细胞损伤模型也更能真实地反映创面变性真皮皮肤成纤维细胞特点。②实验设计中缺乏连续观察细胞周期中S期及凋亡的变化。

李德全★，男，1967年生，江西省宜春市人，汉族，2001年江西医学院整形外科毕业，硕士，主治医生，主要从事创面修复的研究。
lidequan661025@
163.com

通讯作者：黄晓元，教授，中南大学湘雅医院烧伤整形科，湖南省长沙市 410008
huxzhong@yahoo.
com.cn

国家自然科学基金资助项目(30772255/C3030308)*；教育部博士点基金资助项目(20060533 049)*；解放军第三军医大学创伤，烧伤，复合伤国家重点实验室开放课题资助*

摘要
目的:在以往创面愈合研究中，多注意周围正常组织或血液中成纤维细胞的迁入对伤口治愈作用。实验拟验证成纤维细胞热损伤后形态学的变化，为研究“深Ⅱ度烧伤创面自体薄皮覆盖变性真皮”新手术方式提供理论依据。
方法：实验于2006-04/2007-04在解放军第三军医大学创伤，烧伤，复合伤国家重点实验室完成。取门诊手术后废弃的小儿包皮，利用体外细胞培养技术对人真皮成纤维细胞进行传代培养，实验分2组，正常组细胞置于37 ℃ 水浴30 s，实验组细胞采用不同温度（50，51，52，53 ℃）及不同时间（30，60，90，180 s）处理，采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞生存率；倒置显微镜及透射电镜下观察不同时间（3 h，1，2，3，4，5，7 d）成纤维细胞损伤后的形态；流式细胞仪技术对烫伤细胞周期进行检测。
结果：不同温度以及同一温度不同时间条件下，各实验组成纤维细胞的生存率与正常组比较，差异均有显著性意义（P < 0.05）。与正常组相比，52 ℃ 30 s成纤维细胞的生存率50%，差异显著（P < 0.05）。透射电镜观察热损伤后成纤维细胞变圆钝，体积增大，表面有较多突起，胞浆中有大量的异常疏松透亮区。热损伤后成纤维细胞的形态有明显改变，7 d 恢复正常。流式细胞仪检测显示成纤维细胞的S期是其热损伤的敏感期，与正常组比，实验组成纤维细胞S期凋亡明显增多（P < 0.01）。
结论：热损伤后变性的成纤维细胞活性明显降低，形态学及细胞周期发生显著改变，7 d 形态基本恢复正常。
关键词：成纤维细胞；热损伤；形态学；变化；皮肤组织构建

李德全，黄晓元，杨兴华．离体人皮肤成纤维细胞热损伤后转归的形态学观察[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2056-2060 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2056(ps).pdf]

AIM:Previous studies paid more attention to the effect of fibroblast immigration in normal surrounding tissue or blood on wound healing. This study explored the morphological character of fibroblasts after heat injury to support the new operation of autogenous epidermis overlapping denatured dermis.
METHODS: The experiment was performed at the State Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury in the Third Military Medical University of Chinese PLA from April 2006 to April 2007. The dermal fibroblast from the infant prepuce disposed after surgery was cultured in vitro, and divided into 2 groups. In normal group, the dermal fibroblasts were put in water bath at 37 ℃ for 30 seconds; the cells in experimental group were stimulated at different temperatures (50, 51, 52, and 53 ℃) for different time (30, 60, 90, and 180 seconds). Cell survival was detected by MTT; morphology of injured cells were observed under inverted microscope and transmission electron microscope at 3 hours, 1, 2, 3, 4, 5, and 7 days; cell cycle was detected by flow cytometry.
RESULTS: At different temperatures and different time, there were significant differences in the survival rate of fibroblast between the experimental groups and normal group (P < 0.05). Compared with the normal group, the survival rate at 52 ℃ for 30 seconds was 50% (P < 0.05). The transmission electron microscopic observation showed after heat injury the fibroblast became round and enlarging with many ecptoma, and many lucent regions were found in kytoplasm until the seventh day. Flow cytometry analysis suggested S was the sensitive period for injured fibroblast. Compared with normal group, apoptosis rate of cells in the experimental groups at S phase was significantly increased (P < 0.01).
CONCLUSION: Fibroblast activity is greatly reduced after heat injury. Morphology and cell cycle alter significantly until 7 days later.

Li DQ, Huang XY, Yang XH. Morphology of human skin fibroblasts after heat injury in vitro.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2056-2060(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2056(ps).pdf]

0 引言

目前，深Ⅱ度或混合度（Ⅱ度中混有Ⅲ度）烧伤患者呈明显上升趋势。深Ⅱ度创面特征之一就是含有间生态及残余的部分真皮，其中就存在热损伤后变性的成纤维细胞[1]。在以往创面愈合研究中，多注意周围正常组织或血液中成纤维细胞的迁入对伤口治愈作用，对深Ⅱ度创面残存组织中变性的成纤维细胞的作用研究甚少。为避免其他细胞的干扰，本实验选用人真皮中离体成纤维细胞培养方式模拟成纤维细胞热损伤，旨在为深Ⅱ度创面后“自体薄皮覆盖变性真皮”提供理论指导。

设计：对比观察。
单位：中南大学湘雅医院烧伤整形科。
材料：实验于2006-04/2007-04在解放军第三军医大学创伤，烧伤，复合伤国家重点实验室完成。
主要试剂及仪器：5 g/L 胰蛋白酶+0.2 g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）DMEM、新生小牛血清、四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜、250 g/L 戊二醛（Gibco BRL公司）。DZKW-4型电热恒温水浴箱（上海电气厂）；ZYJ-L超净台（国产）；BX-60倒置显微镜、JEM-100SX电子显微镜(日本)，TG25-4.5台式离心机(美国)；NVATRECO2孵箱（德国）；酶联免疫反应检测仪、COULTEREPPICSESP型流式细胞仪（Bio-Rad，美国）。
设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，干预实施为第一作者，评估为第三作者。
方法：
细胞培养[2]：将门诊手术后废弃的小儿包皮用生理盐水反复清洗3次，10 g/L 碘伏浸泡 5 min，再用生理盐水清洗3次，在含有青霉素(0.1 kg/L)的生理盐水中剪除皮下脂肪组织和筋膜，将分离后的表皮和真皮转移到5 mL 锥形瓶中剪成糊状，加入2.5 mL 5 g/L 胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA，在37 ℃、1 000 r/min 恒温器下振荡1.5 h，加体积分数为0.1胎牛血清的DMEM 2.5 mL 中和胰酶，用100目金属筛网过滤，过滤液经1 000 g 离心10 mim，收集细胞，以1×108 L-1 的密度接种于75 mL 玻璃培养瓶中，置入37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养。24 h 后倒置显微镜观察有部分细胞贴壁，更换细胞培养液，更换下来的培养液重新离心培养，前3天每日换液，以后根据细胞生长情况3~5 d换药1次，三四周左右可见细胞贴满瓶底，取第5~15代细胞用于实验。
热损伤反应：当细胞生长融合达80%时，用 5 g/L 胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA消化，分2组，每瓶含细胞悬液2×108 L-1 4 mL，正常组细胞悬液培养瓶在37 ℃ 水浴中水平面下浸泡30 s，同样操作，实验组又在同一时间（30 s）、不同温度（50，51，52，53 ℃），同一温度（52 ℃）不同时间点（30，60，90，180 s）及不同转归时间点（3 h，1，2，3，4，5，7 d）分别收集细胞进行检测。
细胞生存率测定：将正常组和实验组来源的成纤维细胞悬液分别加入96孔培养板中，每孔 100 μL，细胞密度为2×108 L-1，在终止培养前4 h 使用四甲基偶氮唑盐工作液(5 g/L)，20 mL/孔，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育4 h 后弃上清，加入150 μL 二甲基亚砜，振荡10 min
后在490 nm 波长处测吸光度（A）值，各实验组做8个复孔，以正常成纤维细胞作为正常组，计细胞存活率为100%，其余各组细胞存活率以如下公式计算：细胞存活率（%）=
。

透射电镜观察[3]：离心的细胞去除上清后沿管壁加入250 g/L 戊二醛0.5 mL，10 g/L 四氧化锇固定，常规漂洗，脱水，渗透，环氧树脂包理，醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。
流式细胞仪检测热损伤对细胞周期的影响：细胞胰酶消化后离心，加磷酸盐缓冲液1 mL 吹散细胞，移入EP管中，再以1 000 r/min 离心，弃上清，磷酸盐缓冲液200 μL 吹散，加体积分数为0.7的乙醇固定，0~4 ℃ 过夜，合并收集1×1010 L-1 密度以上细胞。500 r/min 离心5 min 后弃乙醇，将细胞悬浮于50 mg/L密度碘化丙锭（PI）及50 mg/L 核糖核酸酶的染液中，4 ℃ 避光上机检测，用Elite分析软件进行分析。
主要观察指标：①不同温度条件下及同一温度(52 ℃)不同时间各实验组成纤维细胞的生存率。②正常成纤维细胞及在52 ℃ 30 s 热损伤后细胞的转归生长曲线。③倒置显微镜和透射电镜下观察成纤维细胞热损伤后的形态。④正常成纤维细胞及热损伤后成纤维细胞周期中S期的变化。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0统计软件中χ2检验完成统计处理。实验数据以_x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.2 同一温度（52 ℃）不同时间各实验组成纤维细胞的生存率见表2。
2.3 正常成纤维细胞及在52 ℃ 30 s 热损伤后细胞的转归生长曲线见图1，图2。

2.4 倒置显微镜下观察成纤维细胞热损伤后的形态正常成纤维细胞呈梭形、三角形、个体饱满，细胞膜光滑透亮，见图3a。热损伤后成纤维细胞变圆钝，体积增大，表面有较多突起，胞浆中有大量的异常疏松透亮区，细胞核仍见分裂相，核浆比例变小，见图3b。

2.5 透射电镜观察成纤维细胞的转归正常成纤维细胞膜完整，表面少量微绒毛，内质网丰富，核仁明显，核浆比例正常，见图4。热损伤后3 h 胞膜完整，表面微绒毛较正常少，线粒体肿胀，内质网扩张，核浆比例小，核仁不明显，见图5a；损伤后第1天胞膜完整，胞浆大量空泡变性，线粒体肿胀，髓鞘样改变，核仁不明显，见图5b；第2天细胞变化基本同前，胞膜微绒毛减少，部分胞膜凹陷，胞浆线粒体髓鞘样改变减少，见图5c；第3天胞膜微绒毛较第2天多，少量线粒体髓鞘样改变，双核仁，见图5d；第4天变化同第3天，单核仁，见图5e；第5天线粒体明显增多，肿胀减轻核仁较明显，见图5f；第7天变化同正常成纤维细胞相似；见图5g。

2.6 正常成纤维细胞及热损伤后成纤维细胞周期中S期的变化见图6，图7。

与正常组比，实验组成纤维细胞S期凋亡明显增多（P < 0.01），实验组的凋亡比例是正常组的30倍，但其占细胞总数不超过10%。

随着人们安全意识的提高，成批的大面积烧伤患者愈来愈少，而散在的、突发的、局部深Ⅱ度或混合度烧伤患者呈上升趋势，尤其是儿童患者明显增多，其临床诊断和治疗一直是烧伤界的难点。受脱细胞真皮的启发[4]，本科近年来开展的“自体薄皮片覆盖变性真皮”这一手术方式取得了良好的近、远期疗效，已在一些基层医院开展了此项工作[5]。与传统削痂相比，其削痂层次浅、出血少、供区瘢痕少，尤其适用于手等功能部位，而其价格优势又是脱细胞异体真皮所无法比拟的。然而该手术的理论根据一直是笔者探索的目标。至今为止，本科已完成了“自体表皮覆盖变性真皮”的动物模型[6]，现在正着手进行深Ⅱ度烧伤成纤维细胞损伤模型的建立，从细胞分子生物学水平对热损伤后成纤维细胞的转归进行观察。
成纤维细胞是创面修复的主要细胞[7]。O’Connell-Rodwell等[8]研究了小鼠Swiss品系3T3细胞对热损伤的敏感性，发现3T3细胞在51.5 ℃ 30 s 生存率为90%，热休克蛋白70RNA表达最高（约正常的三四倍），因此，他认为51.5 ℃ 是研究出细胞热损伤变性的最合适温度。本实验选择不同的温度（50~53 ℃）和不同的时间（30~180 s）反复实验，52 ℃ 30 s 热损伤后其生存率为58%~48%，接近半数致死量。一般的成纤维细胞热水损伤模型多选择42~45 ℃，时间为30~60 min[9]。实际上临床深Ⅱ度热损伤特点是温度高，时间短（以秒计算），损伤重[10-11]。因此，传统的热损伤模型并不十分符合临床实际情况。一般而言，半数致死量能充分反映毒理因素的作用，有充足理由认为半数致死量能较好地反映深Ⅱ度创面中成纤维细胞热损伤特点。所以笔者选择了52 ℃ 30 s 这一热损伤模型来闸述深Ⅱ度创面中成纤维细胞热损伤后的变化。
从其转归来看，成纤维细胞除第1天增殖受到明显抑制而下降外，其余的时间点增殖均呈上升趋势，第2天就可达到损伤前的细胞数量，其生长曲线与正常成纤维细胞生长曲线基本相似，这意味着成纤维细胞损伤后第1天是其转折点，可能与这一时段细胞本身释放各种细胞因子有关[12-15]。
从电镜图像来看，成纤维细胞的热损伤主要体现在细胞膜及胞浆中，胞浆中线粒体、内质网损伤严重，数量锐减，胞浆中异常物质明显增多，胞膜改变主要在胞膜凹陷。随着成纤维细胞的逐渐恢复，上述情况逐步好转，第5天胞膜及胞浆中细胞有非常明显的恢复，第7天成纤维细胞恢复到正常形态，这表明成纤维细胞热损伤后恢复时间为7 d，与动物模型中成纤维细胞恢复时间一致[6]，与SD大鼠的神经细胞热损伤后恢复时间相似[16]，其原因可能与热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)，尤其是热休克蛋白70与热休克蛋白90有关[17-19]。
流式细胞仪技术的结果显示成纤维细胞的S期是其热损伤的敏感期，这与他人实验结果一致，同时凋亡比例增加，但不超过其总数的10%，残存真皮中部分成纤维细胞处于G0/G期，对热损伤不敏感，存活率高。部分成纤维细胞处于S期或M期，对热损伤敏感。因此，细胞的周期也是细胞存活的重因素[20]。
总之，从细胞的生存率、转归及电镜观察来看，笔者认为52 ℃ 30 s 热浴水损伤模型是目前较好的一种深Ⅱ度离体成纤维细胞热损伤模型，它为今后深入探讨热损伤后成纤维细胞的功能、保护机制、信号传导及相互间的调控机制打下坚实的基础。

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