雌激素在体外对大鼠成骨细胞的作用*★�
李 蔚1，孙宜萍1，朱国英2 华
课题背景：课题经审查核实被确认为上海市科学技术成果（登记号：9312007Y1897）。体内外实验已证实雌二醇可通过成骨细胞的旁分泌信号系统导致破骨细胞凋亡，从而起到抑制破骨细胞性骨吸收的作用，但其对骨形成的作用尚不统一。�
同行评价：实验探讨了雌二醇在体外对大鼠成骨细胞的影响，结果发现雌激素可促进成骨细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性，并促使骨矿化物质在骨内沉积，这从细胞水平证实了雌激素在骨形成中的作用。
重要的概念：①原代培养的细胞纯率：指碱性磷酸酶染色的细胞与所有细胞的百分比。如纯率低于90%，说明原代培养的成骨细胞中含有其他细胞较多，将影响实验的准确性。②矿化结节：矿化结节的形成代表了成骨细胞增殖成熟并行使成骨的功能。促进骨矿化的主要细胞是成骨细胞。每个矿化结节为1个具有形成结节功能的成骨细胞经一定时期的增殖而形成
1上海交通大学附属第六人民医院老年科，上海市 200233；2上海复旦大学放射医学研究所，上海市 200032
李 蔚★，女，1972年生，浙江省绍兴市人，汉族，1996年上海第二医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事老年医学的研究。
liwei2006sh@163.
com
通讯作者：孙宜萍，教授，硕士生导师，上海交通大学附属第六人民医院老年科，上海市 200233
sunyipings@yahoo.
com.cn
上海市科委课题(034119946)*
摘要
目的:近来研究表明雌激素除抑制骨吸收外，还具有促进成骨的作用。实验拟观察雌激素在体外对大鼠成骨细胞的影响。
方法：实验于2007-03在上海复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室完成。①实验材料：1日龄SD新生大鼠（红皮鼠）10只，清洁级，体质量约10 g 左右。雌雄不拘。②实验方法：取大鼠颅盖骨机械分离加酶消化法体外分离培养成骨细胞，取传一代细胞，以1.25×106 L-1 的密度接种于96孔细胞培养板，培养24 h 后分为两组，分别为空白对照组和10-8 mmol/L 雌激素组（加入1×10-8 mmol/L 雌二醇），继续培养72 h。③实验评估：碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞；四甲基偶氮唑盐法检测成骨细胞的增殖能力；PNPP法测定碱性磷酸酶活性。低倍镜下测量矿化结节面积并计算面积比，观察雌二醇对矿化能力的影响。
结果：①体外分离培养的成骨细胞碱性磷酸酶染色成阳性。原代培养的细胞纯率超过90%。②与空白对照组相比，10-8 mmol/L 雌激素组成骨细胞增殖能力及碱性磷酸酶活性显著提高（P < 0.01）；10-8 mmol/L 雌激素组单位细胞数碱性磷酸酶活性较空白对照组有上升趋势，但差异无显著性（P > 0.05）。③与空白对照组相比，10-8 mmol/L 雌激素组矿化面积及矿化面积比显著增加（P < 0.01）。
结论：雌二醇在体外可促进大鼠成骨细胞生长和增殖，提高碱性磷酸酶活性，并促进骨矿化物质在骨内沉积。
关键词：雌二醇；成骨细胞；增殖；矿化；组织构建
李蔚，孙宜萍，朱国英. 雌激素在体外对大鼠成骨细胞的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2061-2064
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2061(ps).pdf]
中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02061-04
收稿日期：2007-11-24 修回日期：2008-03-08 (07-50-11-6535/WL·Y)
Effects of estrogen on rat osteoblasts in vitro
Abstract
AIM:Recent researches have identified that, estrogen can not only inhibit bone resorption but also promote ossification. This study was designed to investigate the effects of estrogen on rat osteoblasts (OBs) in vitro.
METHODS: The experiment was carried out at Department of Bone Metabolic, Institute of Radiation Medicine, Fudan University in March 2007.①Materials: Ten 1-day-old SD rats, irrespective of genders, cleaning grade, weighed 10 g, were used in this study.②Methods: Rat OBs were separated and cultured in vitro with the skull of mechanical separation and enzyme digestion. OBs of the first generation were transferred to 96-hole culture plate at the density of 1.25×106 L-1. After 24-hour culture, these cells were divided into blank control group and estrogen group containing 1×10-8 mmol/L estradiol (E2). Then cells were cultured for another 72 hours.③Evaluation: OBs were verified by alkaline phosphatase (ALP) staining; Proliferation ability of OBs was examined by MTT; Activity of ALP was determined by PNPP. Area and area ratio of mineralized nodus were also measured and calculated through low power lens, from which the effects of E2 on mineralization was concluded.
RESULTS: ①Positive of ALP dying, the OBs culture in vitro were regarded as positive. Cell purity of primary culture was over 90%.②Compared with the blank control group, proliferation of OBs and ALP activity of E2 group were significantly raised (P < 0.01). For ALP activity of unitary cell population, an upward tendency was showed, but there was no significant difference (P > 0.05).③Area and area ratio of mineralized nodus were significantly higher in E2 group than in blank control group (P < 0.01).
CONCLUSION: E2 can stimulate the growth and proliferation of rat OBs in vitro, raise ALP activity, and promote the deposition of bone mineralized substances in skeleton.
0 引言
绝经后妇女由于卵巢功能衰退，雌激素分泌不足，引起绝经后骨质疏松（Postmenopausal osteoporosis，PMO）。体内外实验已证实雌二醇（Estradiol，E2）可通过成骨细胞的旁分泌信号系统导致破骨细胞凋亡，从而起到抑制破骨细胞性骨吸收的作用[1]，但其对骨形成的作用尚不统一。一些体内实验报道雌激素介导骨形成的增加，而另外一些结果则相反[2]。这可能与复杂的体内环境有关，它牵涉许多激素和因子的相互作用，故难以了解雌激素作用的实质。本实验旨在探讨雌二醇在体外对大鼠成骨细胞的影响作用。
1 材料和方法
设计：细胞学研究，对照观察。
单位：上海交通大学附属第六人民医院老年科，上海复旦大学放射医学研究所。
材料：实验于2007-03在上海复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室完成。1日龄SD新生大鼠（红皮鼠）10只，清洁级，体质量10 g 左右。雌雄不拘，由复旦大学放射医学研究所动物房提供（动物合格证号：34）。
主要试剂：MEM培养基干粉、胎牛血清(GIBCO BRL U.S.A)；胰蛋白酶（华美生物工程公司）；17β-雌二醇（美国Sigma公司产品，配成浓度为1×10-8 mmol/L）；胶原酶Ⅱ、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）染色试剂盒（Sigma公司）。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施为第一、二、三作者，评估为第一作者。均经过正规培训，采用单盲法评估。
方法：
大鼠成骨细胞分离培养与鉴定：
成骨细胞分离培养（机械分离加酶消化法）：将大鼠用自来水冲洗后放入体积分数为0.75的乙醇浸泡20 s，无菌剪开头部皮肤，手术刀切下颅盖骨，清除骨表面的结缔组织，磷酸盐缓冲液反复冲洗至骨组织发白，用剪刀将骨组织剪碎至1 mm×1 mm 骨片，2.5 g/L 胰蛋白酶5 mL 37 ℃ 预消化20 min，间歇振荡四五次。弃消化液，将骨片移入含1 g/L Ⅱ型胶原酶10 mL 的安玻瓶中，37 ℃ 恒温水浴振荡消化60 min。移取消化液，1 000 r/min 离心10 min，弃上清，加入适量培养液，制成细胞悬液，混匀，以1.2×104 cm-2 的密度接种于25 cm2 培养瓶，置体积分数为0.05的CO2，37 ℃ 条件下培养，24 h 后换液1次，以后每2天换液1次，细胞汇合后，2.5 g/L 胰蛋白酶消化，以1.2×104 cm-2 的密度分瓶接种于25 cm2 培养瓶，继续培养，汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。
各项指标的检测：
成骨细胞碱性磷酸酶活性（PNPP法）：底物、显色剂与缓冲液按1∶1∶50比例混合配制孵育液，接种在玻片上的细胞培养1周，25 g/L 戊二醛4 ℃ 固定7 min，蒸馏水冲洗，浸入孵育液，37 ℃ 条件下孵育60 min，蒸馏水冲洗，晾干，中性树胶封固，光镜观察、摄片。成骨细胞1.25×106 L-1×200 μL/孔接种于96孔细胞培养板，培养24 h 后分为两组，分别为空白对照组和10-8 mmol/L 雌激素组。培养72 h，弃上清液，磷酸盐缓冲液冲洗，每孔加PNPP底物150 μL，37 ℃ 孵育30 min，加入0.2 mol/L 的NaOH 50 μL 终止反应，酶标仪405 nm 波长检测吸光度（A）值，样品A值表示碱性磷酸酶活性。以AALP/AMTT的比值表示单位细胞数碱性磷酸酶活性。
成骨细胞增殖能力（MTT法）：成骨细胞培养72 h，弃上清液，每孔加无血清MEM培养液100 μL，四甲基偶氮唑盐10 μL，37 ℃ 孵育4 h，加入20%的十二烷基硫酸钠（SDS） 150 μL，37 ℃ 温育2 h，酶标仪570 nm 波长检测吸光度（A）值。
成骨细胞矿化结节形成功能（茜素红染色）：汇合后的成骨细胞经含抗血酸、β-甘油磷酸钠矿化诱导液培养，每2天换液1次，继续培养3周，形成不透光的矿化结节，茜素红染色鉴定。染色步骤如下：吸弃培养液，磷酸盐缓冲液洗涤2次，体积分数为0.95的乙醇固定 10 min，弃乙醇，磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入0.2%茜素红染液2 mL，染色30 min，自来水轻轻冲洗，光镜下观察。以红染，边界清晰，周围有明显细胞堆积，短径大于20 μm 的标准，低倍镜下计数每个视野下的矿化面积、矿化面积百分比。每组计算20个视野。
主要观察指标：10-8 mmol/L 雌激素组和空白对照组的成骨细胞碱性磷酸酶活性、成骨细胞增殖能力和矿化面积、矿化面积百分比。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件完成统计处理，实验数据以_x±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 成骨细胞形态学分析 原代细胞培养第2天，见成骨细胞贴壁展开呈多种形态。培养3~5 d，细胞体积增大，见较多细胞分裂相；胞浆丰富，向外伸展，伸出多个伪足，与周围细胞的伪足相互连结，细胞半融合。培养 1周左右，细胞融合成铺路石状。
成骨细胞的鉴定：碱性磷酸酶染色成阳性，可见胞质内蓝紫色阳性颗粒，核不着色，位于细胞一侧，可见一二个核仁。以胞浆呈明显蓝紫色颗粒为阳性细胞，无着色或和背景一致为阴性细胞。原代培养的细胞纯率（指碱性磷酸酶染色的细胞与所有细胞的百分率）超过90%（纯率低于90%，说明原代培养的成骨细胞中含有其他细胞较多，将影响实验的准确性），符合本实验的要求。见图1。
2.2 雌二醇对成骨细胞碱性磷酸酶活性及增殖能力的影响 见表1。
与空白对照组相比，10-8 mmol/L 雌激素组成骨细胞增殖能力及碱性磷酸酶活性显著提高（P < 0.01）；10-8 mmol/L 雌激素组单位细胞数碱性磷酸酶活性较空白对照组有上升趋势，但差异无显著性（P > 0.05）。
2.3 雌二醇对成骨细胞矿化结节形成功能的影响 见表2。
与空白对照组相比，10-8 mmol/L 雌激素组矿化面积及矿化面积比显著增加（P < 0.01）。各组矿化结节的形成见图2，图3。
3 讨论
由于原代培养的成骨细胞在体外实验中比人成骨细胞株更具有代表性[3]，因此本实验采用了原代培养的成骨细胞作为观察对象。碱性磷酸酶染色鉴定了原代分离培养的成骨细胞，纯率在90%以上，符合本实验的要求。碱性磷酸酶不仅是成骨细胞生长和发育早期的重要标志，同时也是成骨细胞功能状态的体现，是检测骨形成的常用指标之一。本实验结果显示，雌二醇促进成骨细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性，使矿化面积和矿化面积比显著增加。
近年来在成骨细胞和成骨细胞样骨肉瘤细胞上发现了特异性雌激素受体，尽管相对数量少，其出现仍提示成骨细胞可作为雌二醇的直接靶器官。与此同时，刺激破骨细胞上的雌激素受体，将提高骨细胞的活性[4]。目前研究发现，雌激素能通过受体途径促进破骨细胞的
凋亡[5]，同时可促进成骨细胞Bcl-2(抗凋亡基因)转录[6]，从而对成骨细胞表现为抗凋亡作用。雌二醇抑制成骨细胞凋亡是通过雌激素受体并由细胞外信号调节激酶的快速激活介导。也有报道雌激素通过增加热休克蛋白27的产生以减少肿瘤坏死因子α诱导成骨细胞的凋亡[7]。又证实雌激素可阻断糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡[8]。但对于雌激素受体α被敲除的小鼠，雌激素仍能促进成骨细胞分化，提示雌激素的作用不完全通过雌激素受体α[9]。本实验结果提示雌二醇促进成骨细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性，促使骨基质矿化，这也证明成骨细胞是雌二醇的直接靶器官。传统的雌激素受体途径是配体通过结合胞内受体调控细胞反应，目前认为还存在另一种调节反应，称为非基因或快速反应。快速反应可激活丝裂原激活的蛋白激酶途径，腺苷酸环化酶、蛋白激酶C、G蛋白途径等。
进一步实验发现，雌激素可以抑制成骨细胞产生刺激破骨细胞增殖、分化和活化的细胞因子。如白细胞介素1、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，肿瘤坏死因子α[10]。体内实验也证明随着雌激素水平的下降，白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α呈上升趋势[11]。其中，白细胞介素6和肿瘤坏死因子是已知最有效的骨吸收刺激因子。动物实验证明血清血管内皮细胞生长因子随雌激素而下降，同时骨密度也呈下降趋势[12]。雌激素还可直接通过雌激素受体上调成骨细胞中骨保护素mRNA的表达，且呈剂量和时间依赖关系。在骨微环境中骨保护素的局部增高是雌激素降低骨吸收的重要机制之一[13-14]。同时雌激素可刺激成骨细胞分泌胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子结合蛋白3，促进成骨细胞合成转化生长因子β。转化生长因子β反过来又促进雌激素受体的表达[15]。研究发现，胰岛素样生长因子Ⅰ基因是雌激素作用的靶器官，胰岛素样生长因子Ⅰ介导雌激素对骨的作用。它与骨骼中受体结合发生受体自身磷酸化后激活酪氨酸蛋白酶，促使胰岛素受体底物的磷酸化，从而调节细胞的生长、增殖和代谢[16]。胰岛素样生长因子Ⅰ对参与骨转换的所有细胞均具有刺激有丝分裂和/或启动分化的活性，尤其增加成骨细胞数目和功能。雌激素和生长激素可引起占胰岛素样生长因子结合蛋白活性95%的胰岛素样生长因子结合蛋白3增多，与激素促进骨细胞生长、胰岛素样生长因子Ⅰ分泌一致。反之雌激素缺乏，生长激素分泌减少引起血清胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子结合蛋白水平下降，骨转化异常[17]。但新近实验结果显示，经年龄、体质量指数校正后胰岛素样生长因子结合蛋白1和骨密度关系不大[18]。
综上所述，虽然以往已有很多细胞实验、动物实验和临床试验证明，雌激素通过抑制骨吸收发挥抗骨质疏松作用[19]，但近来研究表明除抑制骨吸收外，雌激素还具有促进成骨的作用。本实验结果提示，雌激素能促进成骨细胞的增殖，提高碱性磷酸酶活性，并促使骨矿化物质在骨内沉积。这从细胞水平为雌激素应用于绝经后骨质疏松的防治提供了基础理论依据。雌激素促进成骨的机制较复杂[20]，尤其是在细胞因子方面。体内环境复杂，细胞因子众多，雌激素究竟是通过何种途径促进或抑制哪些细胞因子的分泌以及这些细胞因子之间又是如何相互影响的有待于进一步探讨和研究。
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