重组人血小板源性生长因子与胰岛素联合局部应用对老龄糖尿病大鼠烧伤创面的作用★�
吴 健1，薛晓东2，刘俊玲2，司小强2，杨国虎2，刘健云2
课题背景：课题经审查核实被确认为上海市科学技术成果（登记号：9312007Y1897）。体内外实验已证实雌二醇可通过成骨细胞的旁分泌信号系统导致破骨细胞凋亡，从而起到抑制破骨细胞性骨吸收的作用，但其对骨形成的作用尚不统一。�
同行评价：实验探讨了雌二醇在体外对大鼠成骨细胞的影响，结果发现雌激素可促进成骨细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性，并促使骨矿化物质在骨内沉积，这从细胞水平证实了雌激素在骨形成中的作用。
重要的概念：①原代培养的细胞纯率：指碱性磷酸酶染色的细胞与所有细胞的百分比。如纯率低于90%，说明原代培养的成骨细胞中含有其他细胞较多，将影响实验的准确性。②矿化结节：矿化结节的形成代表了成骨细胞增殖成熟并行使成骨的功能。促进骨矿化的主要细胞是成骨细胞。每个矿化结节为1个具有形成结节功能的成骨细胞经一定时期的增殖而形成
1 兰州大学医学院； 2甘肃省人民医院烧伤整形康复中心，甘肃省兰州市 730000
吴 健★，男，1969年生，河北省大成县人，汉族，兰州大学医学院在读硕士，主治医师，主要从事创面修复方面的研究。
2005yjswj@163.com
摘要
目的:文献报导单一局部应用重组人血小板源性生长因子或胰岛素对糖尿病创面的愈合具有促进作用。拟验证局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素对老龄糖尿病大鼠烧伤创面愈合的作用。
方法：实验于2006-10/2007-05在甘肃省中医学院SPF级动物实验室完成。①实验材料及分组：SPF级健康Wistar老龄大鼠88只，年龄1年以上，雌雄不限,体质量300~350 g。随机分为烫伤对照组20只，糖尿病烫伤对照组20只，糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组16只，糖尿病胰岛素对照组16只，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组16只。实验用鱼精蛋白锌胰岛素为上海第一生化药业有限公司产品；重组人血小板源性生长因子凝胶剂为北京金赛狮生物制药技术开发有限公司产品。②实验过程：除烫伤对照组外，其他组大鼠通过高脂、高蛋白、高糖饲养后腹腔注射链尿佐菌素，建立老龄Ⅱ型糖尿病动物模型，并以高脂、高蛋白、高糖饲养。8周后各组给予深Ⅱ度烫伤。③实验评估：于伤后第1，3，7，14，21天时相点测量创面面积，计算创面愈合率；观察组织形态学、检测创面羟脯氨酸含量；采用免疫组织化学检测血管内皮细胞生长因子、CD34的表达；计算微血管密度。实验过程对动物的处理符合动物伦理学标准。
结果：与糖尿病烫伤对照组、糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组、糖尿病胰岛素对照组相比，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组老龄大鼠创面愈合率加快（P < 0.05），创面上皮化加速，羟脯氨酸含量增加（P < 0.05），血管内皮细胞生长因子、CD34阳性表达，微血管密度值增加（P < 0.05）。
结论： 局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素可通过协同作用促创面胶原的合成，增加创面的血管形成，加速老龄性糖尿病大鼠创面愈合 。
关键词：老龄糖尿病；烧伤；重组人血小板源性生长因子；胰岛素；创面愈合
吴健，薛晓东，刘俊玲，司小强，杨国虎，刘健云.重组人血小板源性生长因子与胰岛素联合局部应用对老龄糖尿病大鼠烧伤创面的作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2069-2073
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2069(ps).pdf]
中图分类号:R587.1
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)11-02069-05
收稿日期：2007-08-26
修回日期：2007-11-02
(07-50-8-4636/W·A)
Influence of recombinant human platelet-derived growth factor plus insulin on burn wound healing in aging diabetic rats
Abstract
AIM:Reports have shown that local and simple application of recombinant human platelet-derived growth factor (rhPDGF) or insulin could promote wound healing in diabetes. This study evaluated the effect of the combination of rhPDGF and insulin on burn wound healing in type 2 diabetic aging rats.
METHODS: The experiment was performed at the SPF Animal Experimental Laboratory of Gansu College of Traditional Chinese Medicine from October 2006 to May 2007. ①Eighty-eight aging SPF Wistar rats of more than one year old, either female or male and 300-350 g were selected and randomly divided into burn control group (n =20), diabetic burn group (n =20), diabetic rhPDGF control group (n =16), diabetic insulin control group (n =16) and diabetic rhPDGF and insulin therapy group (n =16). Protamine Zina insulin was the product of Shanghai No. 1 Biochem. & Pharma. Co., Ltd. and rhPDGF was provided by Beijing Golden Sets Biopharmaceutical Technology Co., Ltd. ②Except for the burn control group, all aging rats were fed with high-fat, high-protein and high-sugar food, then intraperitoneally injected with streptozotocin (STZ) to establish animal model of type 2 diabetes. Then the rats were still feed with high-fat, high-protein, and high-sugar food. After eight weeks, the rats in each group were given man-made deep second-degree burn. ③The wound area was measured in 1, 3, 7, 14, and 21 days after burn to calculate the rate of wound healing. Morphology and hydroxyproline (OHP) content were observed. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and CD34 were detected by immunohistochemical staining to calculate microvascular density (MVD). The experimental procedure was accorded with animal ethical standards.
RESULTS: Compared with diabetic burn group, diabetic rhPDGF control group, and diabetic insulin control group, the wound healing of aging rats in diabetic rhPDGF and insulin therapy groups was significantly faster (P < 0.05), the epithelization was accelerated; moreover, OHP content, the expression of VEGF, CD34, MVD in wound tissue were significantly increased (P < 0.05).
CONCLUSION: The combination of rhPDGF and insulin in local wound tissue can accelerate the wound healing in aging diabetic rats by promoting wound collagen synthesis and increasing wound vasifaction.
Wu J, Xue XD, Liu JL, Si XQ, Yang GH, Liu JY.Influence of recombinant human platelet-derived growth factor plus insulin on burn wound healing in aging diabetic rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2069-2073(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2069(ps).pdf]
0 引言
老龄糖尿病烧伤创面由于自身的特点，其愈合速度明显低于一般烧伤，因此促进老龄糖尿病烧伤创面愈合成为治疗上的一个难点。基因重组技术的问世,为使用生长因子治疗老龄糖尿病创面难愈提供了可能。文献报道单一局部应用重组人血小板源性生长因子或胰岛素对糖尿病创面的愈合具有促进作用,但联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素对老龄糖尿病烧伤创面的影响报道尚不多见。老龄糖尿病烧伤创面难愈与自身的免疫低下，糖代谢紊乱[1]，创面愈合过程胶原形成不良，上皮迁移延迟及炎症反应异常，血管形成能力减退，以及细胞外基质、生长因子等生物学行为发生改变有关[2-5]。本实验从炎症反应、胶原合成、新生血管的形成及协同作用等角度来探讨其可能的作用机制。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
单位：兰州大学医学院和甘肃省人民医院烧伤整形康复中心。
材料：实验于2006-10/2007-05在甘肃省中医学院SPF级动物实验室（BSL-4）完成。SPF级健康Wistar老龄大鼠88只(日龄1年以上，由甘肃省中医学院试验动物繁育中心提供，许可证号：SCXY2004-007)，雌雄不限,体质量300~350 g。实验仪器和试剂：光学显微镜（日本），电热恒温水浴箱，快速血糖检测仪（美国琼森），链脲佐菌素(美国Sigma公司)；乳酸钠林格注射夜（广州大冢制药有限公司），鱼精蛋白锌胰岛素（上海第一生化药业有限公司，批号051202），重组人血小板源性生长因子凝胶剂（北京金赛狮生物制药技术开发有限公司），羟脯氨酸（南京建成生物工程研究所，批号：2007112）试剂盒，抗CD34抗体、辣根酶标记链霉卵白素免疫组织化学染色（SP）试剂盒（武汉博士德生物工程公司），血管内皮细胞生长因子抗体（福州迈新生物工程公司）。
设计、实施、评估者：实验设计者为第一作者，实验干预者为全部作者。
技术路线：
老龄糖尿病动物模型合并烫伤模型制作：大鼠88只，采用随机数字法分成5组, 为烫伤对照组20只，糖尿病烫伤对照组20只，糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组16只，糖尿病胰岛素对照组16只，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组16只。造模前1个月，除烫伤对照组外，其余各组大鼠喂以高脂、高蛋白、高糖饲料，以诱导出胰岛素抵抗。高脂、高蛋白、高糖饮食1个月后，糖尿病模型组禁食不禁水14 h后腹腔注射链尿佐菌素（溶于0.1 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中pH 4.5，新鲜配制）以30 mg/kg体质量，72 h后尾静脉采血测定血糖。糖尿病动物模型在诱导前和诱导后均经尾静脉采血,用快速血糖仪测基础血糖和随机血糖水平。同时对诱导后大鼠的体质量进行观察,若诱导前基础血糖水平< 8.9 mol/L,诱导后血糖水平> 16.7 mol/L，大鼠体质量明显下降，即可视为糖尿病模型诱导成功[6]。凡不达标者，3 d后补注链尿佐菌素（以10~20 mg/kg剂量腹腔注射），并仍喂以高脂、高蛋白、高糖饲料8周，每周测体质量，血糖。老龄性糖尿病大鼠模型诱导成功后8周进入深Ⅱ度烫伤模型制作程序：各组烫伤前24 h，给予25 g/L戊巴比妥钠(35 mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，背部用硫化钡混合物脱去背部体毛，脱毛后24 h用电热恒温水浴箱，设定致伤温度80 ℃，时间15 s。予大鼠背部造成约占体表总面积(TBSA)10%的深Ⅱ度烫伤,同时腹腔注射 10 mL林格氏液抗休克,分笼饲养[7]。糖尿病烫伤对照组，糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组，糖尿病胰岛素对照组，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组大鼠试验期间自由进食、饮水,每周监测体质量和血糖。
给药方法与标本获取: 于烫伤后，①糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组用注射器将重组人血小板源性生长因子按实验设计剂量为7.0 μg/cm2 均匀涂于相应创面[8]，无菌纱布包扎，换药1次/d，直至伤口愈合。②糖尿病胰岛素对照组创面下局部浸润注射胰岛素（用灭菌生理盐水配制成含鱼精蛋白锌胰岛素0.1U的溶液 2 mL）[9]，1次/d。③糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组先创面下局部浸润注射胰岛素0.1 U 2 mL后用注射器将重组人血小板源性生长因子7.0 μg/cm2均匀涂于创面，1次/d。④同时在烫伤后1，3，7，14，21 d麻醉后处死大鼠，每组每时相点4只，取大鼠背部全层皮肤标本进行各项检测。病理标本固定于40 g/L甲醛溶液，制成石蜡块保存。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
创面愈合观察：于伤后第7，14，21天用透明方格纸描绘创面。用计算机图像分析软件计算面积，计算公式:创面愈合率=（烫伤面积－各时相点面积）/烫伤面 积×100% 。组织学观察：标本固定后按常规脱水、包埋、切片, 苏木精-伊红染色光镜下观察创面组织炎症反应，胶原改变，创面上皮化等变化。皮肤组织中羟脯氨酸含量检测:应用碱水解法测定羟脯氨酸含量，具体按试剂盒说明进行测定。使用血管内皮细胞生长因子抗体、兔抗CD34多克隆抗体和辣根酶标记链霉卵白素免疫组织化学染色（SP）试剂盒，按辣根酶标记链霉卵白素免疫组织化学染色（SP）染色法进行，实验操作按试剂盒说明书进行，磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照,光镜观察，结果以胞浆或/和胞核着棕色者为阳性染色。抗CD34抗体对标本免疫组织化学染色，操作步骤按辣根酶标记链霉卵白素免疫组织化学染色（SP）试剂盒说明书进行,根据CD34表达并Pareek等[10]的方法计算微血管密度。
主要观察指标：①计算创面愈合率。②创面组织炎症反应、胶原改变、创面上皮化等变化。③检测局部组织中羟脯氨酸含量。④创面血管内皮细胞生长因子和CD34的表达。⑤微血管密度计数。
统计学方法：数据均以_x±s表示。由本文作者采用SPSS 13.0软件分析，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠88只，分为5组，全部进入结果分析。
2.2 不同时间点各组大鼠创面愈合率 见表1。
与糖尿病烫伤对照组，糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组，糖尿病胰岛素对照组相比，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组伤后7，14，21 d创面愈合率显著增加（P < 0.05）；与烫伤对照组相比有增加的趋势。
2.3 各组大鼠创面组织学观察结果 ①烫伤对照组1~ 3 d真皮层可见大量炎性细胞浸润，胶原纤维变性坏死，排列紊乱，真皮深部仍见残余毛囊汗腺。伤后14 d可见上皮细胞自创口边缘长入。②与烫伤对照组相比, 糖尿病烫伤对照组皮肤薄,表皮层次少,真皮胶原萎缩,伴有大量炎性细胞浸润,伤后14 d可见极少上皮长入，伤后21 d仍有大量坏死组织，创面未愈。③糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组伤后3~7 d，微血管扩张，创口边缘已有薄的上皮长入，血管增生、肉芽组织形成及上皮细胞爬行出现的早，伤后21 d，创面上皮完全上皮化，上皮细胞分化较好，新生胶原较多。④糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组、糖尿病胰岛素对照组伤后14 d，可见上皮细胞自创口边缘长入，真皮层真皮胶原萎缩减轻，坏死组织与正常组织分界较迟，新生胶原较多。与糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组相比，新生上皮细胞生长速度缓慢，新生胶原排列紊乱，伤后21 d仍有少量坏死组织，上皮组织修复尚未结束。糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组和糖尿病胰岛素对照组相比，创面炎症减轻，肉芽组织形成出现较迟。见图1。
2.4 各组大鼠皮肤组织中羟脯氨酸含量检测 见表2。
2.5 各组大鼠创面血管内皮细胞生长因子和CD34的表达 见图2，3。
2.6 各组大鼠微血管密度（MVD）计数 见表3。
3 讨论
创面局部应用胰岛素可充分发挥其药效，减少用量以及对全身代谢的影响，但胰岛素的渗透性不强，创面下浸润注射0.1 U胰岛素不会对血糖造成明显的影响[9]。
本实验局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素后，老龄糖尿病烧伤创面上皮细胞爬行出现的早，创面炎症减，肉芽组织形成亦早，与糖尿病烫伤对照组，糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组，糖尿病胰岛素对照组相比创愈合率显著增加（P < 0.05），提示局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素能明显促进创面愈合。其作用机制可能为：胰岛素通过降低炎症前细胞因子水平，增加烧伤后抗炎细胞因子水平，从而缓解炎症反应及阻止过度的炎症反应, 并抑制免疫细胞内蛋白质的降解,提高免疫反应的质量[11]；当组织受到损伤时，血小板源性生长因子便从α颗粒中释放出来，低浓度的血小板源性生长因子对中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等产生趋化作用，吸引这些细胞向损伤部位迁移，一方面使创面聚集了大量的炎性细胞和组织修复细胞，另一方面又可作为一种强有力的血管扩张剂使局部产生充血反应，这些都是有利于促进创口修复的早期病理生理过程[12]。
创面中的胶原也是创面愈合的一个指标，而羟脯氨酸在胶原中所占比例相对恒定[13]，测定羟脯氨酸含量可间接反映胶原的含量，检测结果显示：伤后14，21 d，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组明显高于糖尿病烫伤对照组，糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组，糖尿病胰岛素对照组，表明局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素能明显促进创面胶原的合成、加速细胞外基质的重建。其作用机制可能为：胰岛素能使成纤维细胞功能活跃，细胞周期提前及促进胶原沉积[8]，加快了创伤愈合速度[14]；局部应用重组人血小板源性生长因子不仅刺激成纤维细胞增殖，而且诱导成纤维细胞合成胶原增加，从而促进创面肉芽组织形成[8]。
CD34是血管形成的重要标志，新生血管的CD34呈高表达，抗CD34抗体标记能很好地区分新生血管和成熟血管[15]，根据CD34表达计算出的微血管密度是新生血管形成的量化指标。本实验中，糖尿病烫伤对照组与烫伤对照组相比，创面中的血管内皮细胞生长因子、CD34的表达及微血管密度降低，提示老龄糖尿病烧伤创面血管形成不足，糖尿病重组人血小板源性生长因子、胰岛素治疗组老龄大鼠各时相点创面均显著高于糖尿病烫伤对照组，伤后21 d显著高于糖尿病重组人血小板源性生长因子对照组，糖尿病胰岛素对照组，提示局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素可促进老龄糖尿病烧伤创面血管形成，其作用机制可能为：胰岛素可增加一氧化氮的合成与释放，而内皮型一氧化氮在血管内皮生长因子促进血管形成过程中发挥重要作用,而血管内皮细胞生长因子具有明显的促进血管形成作用[16]。而生长因子是促细胞分裂剂，对细胞具有趋化作用，调节细胞间的相互作用,影响细胞外基质的合成和组分，血管生成的有力刺激，重组人血小板源性生长因子能明显促进创面愈合和新生血管形成，可能是由于血小板源性生长因子促进内皮前体细胞大量增加形成的[17]。
本实验结果均说明局部联合应用重组人血小板源性生长因子和胰岛素具有良好的促进老龄糖尿病烧伤创面愈合的作用，其作用机制可能为：胰岛素具有协调生长因子的作用[18]，①胰岛素可以增加胰岛素样生长因子Ⅰ的水平，从而增加其生物可利用性，而胰岛素样生长因子Ⅰ与血小板源性生长因子协同作用能增强表皮细胞再生[19]，更有利于创面愈合。②胰岛素可增强角质细胞分泌表皮生长因子和层黏蛋白的功能[20]，而表皮生长因子与血小板源性生长因子协同作用加速了创面的愈合。
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