心肌梗死大鼠血管生成过程中血管生成素1及其Tie2受体的表达**☆

心肌梗死大鼠血管生成过程中血管生成素1及其Tie2受体的表达**☆�

孙丽杰，崔鸣，王佐岩，冯新恒，毛节明，陈凤荣

课题背景：治疗性血管新生是近年来缺血性疾病治疗的研究靶点，已有多种不同的血管生成因子应用于急性心肌梗死的实验性治疗。然而血管生成是一个多因子共同参与的复杂过程，盲目应用这些血管生成因子而进行的血管生成治疗必将造成严重不良后果。本实验基于此，建立心肌梗死模型，目的在于了解心肌梗死的自然病理过程中Ang1的表达情况，从而为Ang1的血管生成治疗提供一定的理论依据。

偏倚或不足：由于时间及实验条件所限，本实验仅从基因水平对Ang1和Tie2的表达水平进行初步讨论，缺乏对血管生成过程中Ang1/Tie2的蛋白表达水平及其受体后水平的分析，以及血管生成过程的其他重要因子的表达及其相互之间的复杂关系的探讨，尚需要进一步的实验来进行完善。

同行评价：实验通过结扎大鼠冠脉前降支制造心肌梗死模型来研究心肌梗死后梗死部位及其周围组织Ang1/Tie2的表达及其与血管生成的关系，为临床诊治相关疾病提供了一定思路，具有一定创新。

孙丽杰☆，女，1978年生，北京市人，2006年北京大学医学部毕业，博士，主要从事冠心病发病机制及其治疗的研究。
lijiesun@126.com

通讯作者：崔鸣，副主任医师，北京大学第三医院心内科，北京市 100083

国家自然科学基金资助项目
(30371562)*；教育部博士点基金项目
(20010001096)*

摘要
目的:通过检测正常心肌组织及心肌梗死后血管生成素1及其受体Tie2受体 mRNA的表达水平，探讨其在心肌梗死后的血管新生过程的作用。
方法：实验于2006-04/2007-04在北京大学医学部生物化学与分子生物学基因组实验室完成。将40只雄性SD大鼠随机分为急性心肌梗死组和假手术组，急性心肌梗死组通过结扎前降支建立心肌梗死模型，假手术组只穿线不结扎。于术后3，7，14，28 d 四个时间点，每组取5只处死，取心脏左室前壁同一部位，提取总RNA，用RT-PCR的方法，以GAPDH基因为内参，进行半定量分析检测正常心脏及梗死后血管生成素1及Tie2 mRNA的表达；同时用免疫组化的方法检测各时间点梗死区域以及梗死周边区域血管数量。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
结果：40只大鼠进入结果分析。血管生成素1及Tie2在正常心肌组织中均有所表达。在心肌梗死后的28 d内，血管生成素1维持在相对不变的水平，而Tie2的表达在心肌梗死后3 d略有升高，于7 d后达顶峰，14 d后恢复正常；急性心肌梗死后7 d, 梗死区及梗死周边区域的血管数量均明显增多，并不随时间的延长而改变，维持在同一水平。
结论：心肌梗死后Tie2受体的表达上调，与血管生成的时间相吻合，提示其在心肌梗死后的血管生成和稳定过程中起了一定的作用。
关键词：心肌梗死；血管生成；血管生成素1；Tie2受体

孙丽杰，崔鸣，王佐岩，冯新恒，毛节明，陈凤荣.心肌梗死大鼠血管生成过程中血管生成素1及其Tie2受体的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2079-2082 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2079(ps).pdf]

中图分类号:R542.22
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)11-02079-04

Expression of angiopoietin-1 and Tie2 receptor during angiogenesis in rats with myocardial infarction

AIM: To investigate the role of angiopoietin-1 (Ang1) and Tie2 receptor in angiogenesis after myocardial infarction through detecting their mRNA expression in normal and infracted myocardium.
METHODS: The experiment was conducted in the laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, Medical Department of Peking University from April 2006 to April 2007. Forty male SD rats were randomly divided into acute myocardial infarction model group and sham-operation group. The myocardial infarction model was established in the rats of model group through the ligation of left anterior descending artery, while the rats in sham operation group were braided of the left anterior descending artery without ligation. Five rats in both groups were executed at 3, 7, 14, and 28 days after model establishment. RNA was extracted from the same site of left anterior wall, and the polymerase chain reaction was used to semiquantitatively analyze the Ang1 and Tie2 receptor mRNA expression with GAPDH gene as internal control; meanwhile, the immunohistochemistry was used to detect vascular density in and around infarction area. All the treatments for animals were accorded with the animal ethical standards.
RESULTS: All 40 rats were included in the final analysis. Both Ang1 and Tie2 receptor were expressed in normal myocardium. In the 28 days after myocardial infarction, Ang1 expression kept at almost the same level without changing, but Tie2 receptor expression was slightly elevated at 3 days, reached peak value at 7 days, and returned to the baseline value at 14 days. The vascular density increased both infarction and peri-infarction area at 7 days after acute myocardial infarction, and did not change with time.
CONCLUSION: Tie2 receptor expression is elevated and coincided with angiogenesis after myocardial infarction. It may play a role in the development and stabilization of the blood vessel after myocardial infarction.

Sun LJ, Cui M, Wang ZY, Feng XH, Mao JM, Chen FR.Expression of angiopoietin-1 and Tie2 receptor during angiogenesis in rats with myocardial infarction.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2079-2082(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2079(ps).pdf]

血管生成素(angiopoietin ,Ang) 是近来发现的促血管生成的细胞因子,其家族成员包括Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，其中研究最多的是Ang1及其受体Tie2。与血管内皮生长因子不同,Ang1/Tie2系统作用于血管生成的晚期阶段，诱导和维持内皮细胞迁移、存活，在血管新生及其稳定的过程中起了重要的作用。本文通过结扎大鼠冠状动脉前降支制造心肌梗死模型来研究心肌梗死后梗死部位及其周围组织Ang1/Tie2的表达及其与血管生成的关系，从而为临床治疗提供思路。

1 材料和方法

设计：完全随机分组设计。
单位：北京大学第三医院心内科。
材料：实验于2006-04/2007-04在北京大学医学部生物化学与分子生物学基因组实验室完成。选用清洁级雄性SD大鼠，体质量200~250 g（许可证SYXK 2002-2002），购自北京大学医学部实验动物部，饲养环境为温度22~ 25 ℃，湿度50%~60%，自然光照。将40只大鼠随机分为急性心肌梗死组和假手术组2组，各组均分为3，7，14，28 d 4个时间点，每时间点5只大鼠。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。
TRIzol试剂购自Gibco公司、反转录酶、多聚酶购自invitrogen公司。PCR引物由上海生工公司合成。兔抗人Ⅷ因子及小鼠抗大鼠alpha-SMA抗体购自中山生物试剂公司。
设计、实施、评估者：为全部作者，均经过专业培训，未采用盲法评估。
方法：
动物模型建立：按照Zhang 等[1]的实验方法制备动物模型。将心肌梗死组SD大鼠乙醚麻醉后，经胸骨左缘第四肋间横切口取出心脏，于肺动脉与左心耳之间冠状动脉走行处距肺动脉根部3 mm处结扎前降支，以左室前壁变白为标志制成急性前壁心肌梗死模型，回纳心脏，依次缝合。于手术3 d后经超声检查证实室壁节段性运动异常再次筛查，排除小面积心肌梗死及未梗死者。同时以前降支穿线但不进行结扎制备假手术组作为对照组。
心脏功能检测：各组实验大鼠于心肌梗死后的3，7，14，28 d进行超声心动图检查（北京大学第三医院心内科超声心动图室）。使用Seaquoia C256超声仪（Acuson Co.）线阵探头频率8MHz，探测深度2 cm。腹腔内注射复合麻醉剂（3 mL/kg）全身麻醉，胸部备皮，仰卧固定。超声探头置胸前，二维显示心脏短轴乳头肌水平，在二维超声指导下用M型超声测定心脏结构，包括舒张末期左室内径（LVDD）等，应用Teichholtz公式法计算左室射血分数（EF）。每组原始数据取连续3个心动周期的平均值，由专科医生分析。
组织学检测：于各时间点，复合麻醉剂麻醉处死动物，迅速取其心脏，自结扎线下横断，取2 mm厚度断面进行40 g/L多聚甲醛固定，制备石蜡切片，同时取部分进行OCT包埋，投入液氮30 s，制成冰冻切片-20 ℃ 长期保存。免疫组化检测梗死区域以及梗死周边区域血管数量——Ⅷ因子代表血管总数，α-SMA代表肌性小动脉数量。每组取5只动物，每只动物制备5张切片，每张切片随机观察3个视野，高倍镜下计数血管密度，取其平均值。
心肌组织总RNA的提取：剩余心脏部分取其梗死心肌组织，利用Trizol提取总RNA（详见TRIzol试剂说明书），经电泳鉴定其完整性，利用紫外光分光光度计测定A260与A280的比值，并计算其浓度。
Ang1/Tie2 mRNA水平检测：各取2 μg总RNA经反转录反应生成cDNA，以2 μL cDNA为模板进行RT-PCR，总体积为50 μL，检测Ang1，Tie2表达水平随时间的变化情况。Ang1引物序列：5’-GGA GCA TGT GAT GGA AAA TTA-3’/5’-TGT GTT TTC CCT CCA TTT CTA-3’；Tie2引物序列：5’-ATG GAC TCT TTA GCC GGC TTA-3’/5-CCT TAT AGC CTG TCC TCG AA-3’；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照，其引物序列为：5’-GGA AAG CTG TGG CGT GAT GG-3’/5’-GTA GGC CAT GAG GTC CAC CA-3’。扩增片段的长度分别为360 bp，337 bp，413 bp。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分析。每个时间点各取5只大鼠，每只取3次电泳结果进行计算及图像处理，以GAPDH为参照进行半定量。
主要观察指标：大鼠急性心肌梗死后心功能，梗死区域及其梗死周围血管生成随时间的变化以及梗死心肌组织中Ang1/Tie2 mRNA的表达。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0 统计软件进行独立样本t检验，结果以_x±s表示，P < 0.05认为差异具有显著性意义。

2.1 实验动物数量分析入选大鼠共46只，实验中因动物死亡等各种原因脱失共6只，共有40只大鼠进入实验结果分析，每组中各检测时间点均为5只。
2.2 两组大鼠心肌的超声影像学表现死亡心肌梗死后3 d即可看到梗死室壁节段性运动异常，并随时间推移出现心室内径进行性扩张，心功能进行性恶化。具体指标见表1。

2.3 心肌梗死后梗死部位及其梗死周围区域的血管生成情况急性心肌梗死后7 d， Ⅷ因子染色阳性的血管数量于梗死区及梗死周边区域均明显增多，这种数量增多并不随时间的延长而改变，维持在同一水平；α-SMA染色阳性血管计数有相似表现。见表2。�

电泳结果表明：提取的总RNA呈现清晰的28S和18S条带，两者比例约为1.5∶1。A260/A280均大于1.7。根据A260值计算RNA的含量。RT-PCR的结果显示，Tie2，Ang1在假手术组心肌组织中均有不同水平的表达，急性心肌梗死组中二者的表达随时间变化而不同: Ang1的表达在各时间点并无显著变化；Tie2受体表达3 d略有升高，于7 d后达峰，14 d后恢复正常，见图2。

3 讨论

血管新生是近年来治疗缺血性疾病的重要研究方向。Ang1是近年来发现的血管内皮选择性酪氨酸激酶 Tie2受体的配体[2]，在胚胎血管发生过程中，Ang1与血管内皮生长因子一样拥有重要的地位，不同的是Ang1作用于血管生成的晚期阶段，促进了初级血管的成熟和稳定，从而形成成熟的血管结构。急性心肌梗死作为一种严重缺血性疾病，治疗性血管新生改善梗死心脏功能已经成为一种重要手段。然而盲目的血管生成治疗也会造成严重不良后果[3]。研究证明Ang1同样参与了成体组织血管生成的病生理过程，能够对抗血管内皮生长因子形成渗漏血管的弊病[4]，从而使得治疗性的血管新生成为可能。
本实验建立大鼠急性心肌梗死模型，采用RT-PCR方法检测急性心肌梗死后心肌组织Ang1/Tie2表达水平随时间的变化，结果发现正常心肌组织中可见Ang1/Tie2的表达，在心肌缺血缺氧的病理条件下，Ang1的表达水平无明显变化，而Tie2表达呈现一定的时相性变化，早期表达有所升高，随时间延长而逐渐恢复到正常水平。
体外试验表明，缺氧和血管内皮生长因子能够调节不同细胞的Ang1/Tie2 水平的表达。例如，缺氧和血管内皮生长因子能够促进视网膜 pericytes 细胞Ang1 mRNA水平在短时间内迅速表达，然后迅速下降，而Tie2 mRNA的表达能够持续较长时间；在牛的主动脉内皮细胞中则发现，Ang1和Tie2水平在缺氧和血管内皮生长因子刺激的情况下均无明显变化[5]。Willam等[6]的体外实验则证明炎症和缺氧能够诱导人冠状微血管内皮细胞Tie2受体的表达上调，并呈现时间依赖性。
在体内试验中，Shyu等[7]发现，在急性心肌梗死大鼠的非梗死心肌组织中Tie2 的表达水平没有变化，梗死心肌周围Tie2的水平明显上调，而Ang1的水平无论在梗死组织或者梗死周围组织中均无明显变化。本实验结果与之相似。同样，在缺血再灌注后的心肌组织中，也发现了Tie2 受体的上调而Ang1的表达水平不变[8]。另有部分研究显示不同结果，大鼠梗死区及梗死周围区心肌组织中的Tie2 水平在梗死后持续性增高，而Ang1水平下降[9]，分析该结果可能与试验所采用的时间点不同所致，本文采用了心肌梗死后3 d作为最初的观察点，而该研究观察的则是心肌梗死后的24 h的变化。
本实验同时发现，心肌梗死后存在自发性的血管生成，其生成时间与Tie2表达的升高呈现一定的相关性，但并不随Tie2表达水平的逐渐正常化而消退。血管内皮生长因子与 Ang1/Tie2参与了缺血组织的血管生成过程。已有文献报道急性心肌梗死组织及血循环及其梗死心肌组织间液中的血管内皮生长因子水平升高[10-11]，心肌梗死后内源性的血管内皮生长因子高表达促进内皮细胞分裂，形成渗漏性血管。本研究发现梗死心肌组织中Tie2水平升高，这一结果再一次提示不同的血管生成因子与其受体共同参与梗死后心肌组织的血管新生。心肌梗死后Tie2水平的增高可能是缺血缺氧导致内源性的血管生成保护机制的激活。由于Ang1/Tie2在血管生成和维持过程中是一个完整的体系，作者推测上调的Tie2受体与内源性Ang1的结合促进血管成熟、稳定可能是血管生成和小动脉生成的重要原因，但仍需进一步的Tie2受体阻断实验来证明。Tie2主要表达在内皮细胞上，在成体的血管组织中，Tie2起了重要的作用，它能够在缺血、缺氧以及炎症存在的情况下上调[5]。同时Tie2也表达在内皮细胞的前体细胞上[12]，这些细胞在血管的发育过程中必不可少[13]，因此不能排除内皮祖细胞动员在心梗后血管生成过程中的作用。另外，有研究表明血管内皮生长因子可以促进血管平滑肌细胞Tie2受体水平的上调，从而促进Ang1介导的Tie2受体的磷酸化从而发挥其生物学效应，同时也能够促进肌细胞Tie2受体的表达，从而在Ang1的作用下产生迁移[14]。而Tie2受体激活后，Ang1从内皮细胞表面释放，并且聚集在周围的基质当中[15]。因此，在血管内皮生长因子和Ang1的共同作用下，能够直接对肌细胞或者他们的前体细胞起作用，从而形成新的稳定的血管。
近年来不同的研究领域，如大脑[8，16]，肢体[17]，心脏等组织中[15，18]，已经陆续有报道在缺血缺氧条件下，增加血管内皮生长因子或Ang1/Tie2水平能够促进血管生成，改善组织重构，改善器官功能。本研究通过对急性心肌梗死后梗死心肌组织中Ang1/Tie2表达水平进行研究表明，Tie2受体的表达在某种程度上上调，而Ang1表达的不充分。已知Tie2受体的作用与其配体Ang1密不可分，后者表达不充分可能为有效血管生成不足的原因之一。本实验为临床急性心肌梗死Ang1基因治疗性血管生成提供了一定的理论基础，同时也提示了在血管生成过程中、诸多血管生成因子参与的复杂环境下，如何合理应用各种因子使其发挥最佳的血管生成作用将成为今后研究的重大课题。

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