细胞外基质纤维连接蛋白在小鼠肾脏发育中的表达*

细胞外基质纤维连接蛋白在小鼠肾脏发育中的表达*�

王堃1，田鹤2，王岩2，郭敏2

课题背景：课题受辽宁省教育厅基金项目资助（05L134）。本课题组观察多种细胞外基质成分在正常小鼠肾脏发育过程中表达规律，为应用小鼠作为转基因动物模型的肾脏疾病研究提供基本的实验依据。�

应用要点：以往关于纤维连接蛋白在小鼠肾脏发育中的表达多局限于定性研究，本实验采用免疫组织化学技术、体视学方法和Western blot技术检测纤维连接蛋白在小鼠肾脏发育中的表达及其含量的变化，进行了系统的定性及半定量分析。实验结果表明，纤维连接蛋白对肾脏各结构的发育以及成熟肾脏各结构的维持都起到了重要作用。

术语解析：纤维连接蛋白是细胞外基质和血浆的一种主要成分，也是某些整合素黏附受体的特异性配体。纤维连接蛋白具有多方面生理功能 ,诸如:参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连,维持细胞正常形态,保持微血管完整性,形成利于细胞运动的暂时性基质,促进细胞分化,参与伤口的愈合,阻止肿瘤细胞转移,提高网状内皮系统防御功能,调理单核巨噬细胞吞噬外来抗原,并能促进机体清除血中有害物质,包括免疫复合物、损伤的血小板、凝血产物、肿瘤细胞等。

王堃，男，1954年生，辽宁省锦西市人，汉族，1976年辽宁中医学院毕业，副主任医师，主要从事肾脏发生发育方面的研究。

通讯作者：郭敏，博士，教授，研究生导师，辽宁医学院组织胚胎学教研室，辽宁省锦州市 121001
mguo1118@yahoo.
com.cn

摘要
目的:纤维连接蛋白作为细胞外基质的重要成份，成为肾脏正常组织结构的基本组成部分。实验观察纤维连接蛋白在小鼠肾脏发育中的时空性表达，探讨纤维连接蛋白与肾脏发育的关系。
方法：实验于2006-09/2007-07在辽宁医学院组织胚胎学教研室与科学实验中心完成。①实验材料：选取成年健康昆明系小白鼠44只，体质量25~30 g。②实验过程：小白鼠雌雄（1∶1）同窝饲养，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0 d,以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0 d。分别取胚龄12，14，16，18 d胎鼠和生后1，3，7，14，21，28，42 d仔鼠肾脏，每时间点4只，常规石蜡标本制备、切片。③实验评估：采用免疫组织化学方法、体视学和Western blot技术测定不同胚龄及生后日龄小鼠肾脏内纤维连接蛋白的表达及其含量变化。实验过程中对动物的处理符合动物伦理学标准。
结果：①免疫组织化学结果：显示从胚龄14 d开始，纤维连接蛋白在除逗号小体以外的各期肾小体、肾小管、集合管的基底膜处均有表达。②体视学测量结果：显示纤维连接蛋白在除逗号小体以外的各期肾小体及肾小管、集合管基底膜处的表达量均逐渐增加。③Western blot 结果：显示纤维连接蛋白随着肾脏的发育其表达量逐渐增加。
结论：纤维连接蛋白对肾脏各结构的发育以及成熟肾脏各结构的维持均起一定的作用。
关键词：纤维连接蛋白；肾脏；发育；小鼠组织构建

王堃，田鹤，王岩，郭敏.细胞外基质纤维连接蛋白在小鼠肾脏发育中的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(11):2087-2091 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2087(ps).pdf]

中图分类号:R329.461
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)11-02087-05

AIM:As an important part of extracellular matrix, fibronectin is the fundamental composition of normal kidney. In this study, we observed the chronological and spatial expression of fibronectin in mouse to investigate the correlation between fibronectin and kidney development.
METHODS: The experiment was performed in the Scientific Experiment Center and Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical University from September 2006 to July 2007. ①Forty-four healthy adult Kunming mice weighing 25-30 g were selected and fed with the female and male at a ratio of 1∶1. The earliest time that vaginal suppository shed from the female mice was counted for embryonic day 0, and the earliest time that the neonatal mouse was born for postnatal day 0. The mice pregnant for 12，14, 16 and 18 days and mice born for 1, 3, 7, 14, 21, 28, and 42 days were selected with 4 mice at each time point. The kidneys were embedded in paraffin, and made into section. ②The expressions and content changes of fibronectin in embryos and postnatal mouse kidneys were examined by immunohistochemistry, stereological method and Western blot. All the procedure was accorded with animal ethical standards.
RESULTS: ①Immunohistochemical analysis showed that since pregnant for 12 days, fibronectin stained in the basal membrane of renal glomeruli, tubules and collecting duct in all developing stages except of the comma-shaped bodies. ②Stereological results suggested that the expressions of fibronectin were increased gradually in all stage of renal glomeruli and tubules, except of the comma-shaped bodies. ③Western blot results showed that the content of fibronectin was increased with kidney development.
CONCLUSION: Fibronectin plays an important role in kidney development and maturation.

Wang K, Tian H, Wang Y, Guo M.Fibronectin expression during mouse kidney development.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(11):2087-2091(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-11/11k-2087(ps).pdf]

纤维连接蛋白是细胞外基质重要的组成部分，其最重要和最根本的功能特性是参与细胞与细胞、细胞与基质之间的粘连 [1]。纤维连接蛋白表达于肾脏发育过程的多种结构中，有关纤维连接蛋白与肾脏发育的相关研究国外已有部分报道[2-3]。本实验采用免疫组组织化学技术、体视学方法和Western blot技术检测纤维连接蛋白在小鼠肾发育中的表达及其含量的变化，以探讨纤维连接蛋白与肾脏发育的关系。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。
单位：辽宁医学院组织胚胎学教研室。
材料：实验于2006-09/2007-07在辽宁医学院组织胚胎学教研室和科学实验中心完成。成年健康雌、雄昆明系小白鼠44只，25~30 g，由辽宁医学院实验动物中心提供（医动字第SCXY(辽)2003-2007号）；羊抗小鼠纤维连接蛋白多克隆抗体购自Santacruz公司，SABC试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司，PVDF膜、BSA、SDS、NBT/BCIP、Tween-20、NP-40、PMSF购自Sigma公司。
设计、实施、评估者：设计和评估为第四作者，实施者为第一、二、三作者，均受过专业培训。
技术路线：
组织取材及标本制备：取成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例1∶1同窝饲养，每日早晚8时各观察1次雌鼠怀孕情况，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄 0 d[4]。孕鼠分笼饲养2周始每日早晚8时各观察1次仔鼠出生情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0 d。分别取胚龄12，14，16，18 d胎鼠和生后1，3，7，14，21，28，42 d仔鼠肾脏，每组共计4只（每只孕鼠取 2只胎鼠或仔鼠）。孕鼠经体积分数为0.1的水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，胚龄12 d全胚固定，胚龄14，16，18 d取其左肾固定。仔鼠经体积分数为0.1的水合氯醛麻醉后，于腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾脏切开，入体积分数为0.1的中性甲醛固定，系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，做厚 5 μm连续切片[5]。取出右肾入液氮迅速冷冻，-85 ℃ 冰箱保存，以备Western blot使用。实验过程中对动物的处理符合动物伦理学标准。
免疫组织化学染色：将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，用纤维连接蛋白抗体（稀释度1∶100）进行染色，染色步骤按免疫组织化学试剂盒说明书进行。纤维连接蛋白在肾小体、肾小管及集合管处的阳性部位采用体视学方法进行面密度测定，肾脏根据肾组织切片的多少等间隔选取切片，每张切片按“S”形系统随机选取5个视野，在10×100倍光镜下应用方格测试系统，交点计数法，根据公式Sv = 2 Ix / Lc (Lc = ΣPc·a) 测算出Sv值，其中Sv为面密度值，表示纤维连接蛋白在肾小体、肾小管及集合管的基底膜处的相对含量，Ix为肾小体、肾小管及集合管处纤维连接蛋白阳性表达的基底膜与测试线的交点数，ΣPc为方格测试系统落在参照系（相应的各期肾小体、肾小管及集合管）的点数，a为方格的两点间距离，在10×100倍光镜下相当于实际长度0.01 mm[6]。
蛋白印迹分析（Western blot）：取冷冻待用的右肾组织，加入4倍体积的裂解液，超声粉碎机粉碎，0 ℃ 静置30 min，离心收集上清，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。每个样品取25 μg湿转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭，与纤维连接蛋白抗体(稀释度1∶300) 4 ℃ 孵育过夜,TBS洗脱3次,每次至少5 min；再与碱性磷酸酶标记的二抗(稀释度1∶700)室温孵育1 h，TBS溶液洗脱3次，每次至少5 min；BCIP/NBT试剂显色，扫描电泳条带，用Gene Tools软件分析电泳条带吸光度值。
主要观察指标：①免疫组织化学结果。②体视学测量结果。③Western blot结果。
统计学方法：所有实验数据采用_x±s表示，各组间采用SPSS软件应用单因素方差分析，并用q检验进行两两比较。P < 0.05有统计学意义。

2.1 免疫组织化学结果胚龄12 d时，纤维连接蛋白在输尿管芽的基底膜处及其周围的生后肾组织内单个间充质细胞周围表达（见图1）。

从胚龄14 d开始，纤维连接蛋白在逗号小体（Ⅰ期）的第一裂隙内未见表达（见图2），而其在S小体（Ⅱ期）、分化早期的近端小管及远端小管的基底膜处均有表达(见图3)。

从胚龄16 d至胚龄18 d，在少量出现的毛细血管袢阶段（Ⅲ期）和较成熟阶段（Ⅳ、Ⅴ期）的肾小体基底膜处，纤维连接蛋白呈阳性表达，肾小囊亦呈阳性表达；纤维连接蛋白在发育期的近端小管、远端小管及集合管的基底膜处仍有表达（见图4，5）。从生后1 d至生后3 d，纤维连接蛋白在发育各期的肾小体、近端小管、远端小管及集合管的基底膜处均有表达。从生后7 d至生后42 d，生肾区消失，纤维连接蛋白表达于较成熟阶段（Ⅳ、Ⅴ期）的肾小体、成熟期的近端小管、远端小管及集合管的基底膜处，肾小体近血管极处亦阳性表达（见图6，7）。阴性对照肾脏内无纤维连接蛋白的阳性表达。

2.2 体视学测量结果随着肾脏各结构的发育成熟，纤维连接蛋白在除逗号小体以外的各期肾小体及各期肾小管、集合管基底膜处的面密度值均逐渐增加，表明它们的表达量逐渐增加。表1，2。

2.3 Western blot结果应用Gene Tools软件对纤维连接蛋白蛋白表达电泳条带的分析显示：随着肾脏的发育，纤维连接蛋白在小鼠肾脏内表达的吸光度值逐渐增加（经统计分析，各组间数值的差异具有统计学意义，P < 0.05），表明纤维连接蛋白的表达量逐渐增加（见图8，9）。

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3 讨论

哺乳动物肾发生的标志是输尿管芽长入未分化的间充质相互诱导的过程（上皮-间充质相互诱导机制）。与此同时，未分化的间充质细胞在输尿管芽诱导下形成最初的生后肾组织，然后进一步发育形成由逗号小体（Ⅰ期）和S小体（Ⅱ期）所构成的生肾区，经毛细血管袢阶段（Ⅲ期）肾小体从而分化形成较成熟阶段（Ⅳ、Ⅴ期）的肾小体以及近端小管、远端小管、髓袢等结构[7-8]。本实验观察到在胚龄12 d时纤维连接蛋白在输尿管芽及其周围的生后肾组织的基底膜处表达，Ekblom等[2]也报道纤维连接蛋白在输尿管芽及未分化的间充质周围均有表达，黄松明等[3]在研究人胚胎肾时也提出纤维连接蛋白在输尿管芽细胞周围呈弱阳性，所以推测纤维连接蛋白参与上皮-间充质相互诱导过程的发生。本实验也观察到纤维连接蛋白在除逗号小体以外的各期肾小体基底膜处均有表达，其面密度值均逐渐增加，表明它们的表达量逐渐增加。在以往的研究中，S小体期内纤维连接蛋白是否表达存在争议。Ekblom等[2]提出逗号小体内未检测出纤维连接蛋白，而在S小体的第一裂隙内可检测出纤维连接蛋白。而黄松明等[3]则提出纤维连接蛋白在逗号小体及S小体内均未见表达。并且在体外培养的正常内皮细胞、系膜细胞也可分泌纤维连接蛋白[9-11]。结合本实验的结果纤维连接蛋白在除逗号小体以外的各期肾小体基底膜处均有表达，且表达量逐渐增加，因此推测纤维连接蛋白参与肾小体发育成熟的过程，并在维持肾小体形态方面发挥作用。纤维连接蛋白未表达于逗号小体，推测可能是由于纤维连接蛋白未参与原始血管（内皮细胞）侵入小泡体出现第一裂隙的过程。纤维连接蛋白可促进微血管内皮细胞的迁移[12]，而纤维连接蛋白又表达于S小体的第一裂隙及S小体以后的各期肾小体的基底膜处，推测纤维连接蛋白可能参与了肾小体内微血管的分化。同时，纤维连接蛋白在肾小体血管极处也有表达，说明纤维连接蛋白也参与了血管极的形成过程。
朱平等[13]对32例人胚胎肾进行研究表明：肾小管的发育成熟程度与所属肾小体的发育程度相一致。他们将肾小管发育过程分为3期：分化早期、发育期、成熟期。集合管发育也大致可以分为此3期，但是其分化早期可认为是输尿管芽阶段。本实验观察到纤维连接蛋白在各期的肾小管及集合管的基底膜处均有表达；并且随着肾脏的发育，纤维连接蛋白在各期肾小管及集合管的面密度值均逐渐增加，表明它们的表达量逐渐增加。有学者也曾提出纤维连接蛋白在小管基底膜弥漫表达[3]，并且在体外培养的正常小管上皮细胞也可分泌纤维连接蛋白[14-15]。根据上述，推测纤维连接蛋白参与肾小管及集合管发育成熟的过程，并在维持肾小管及集合管形态方面发挥作用。
除了对各期肾小体、肾小管及集合管内纤维连接蛋白的表达量进行分析以外，实验还应用Western blot技术检测各组小鼠肾组织内纤维连接蛋白的相对含量。电泳条带的分析显示：随着肾脏的发育，纤维连接蛋白在小鼠肾脏内表达的吸光度值逐渐增加，表明纤维连接蛋白的表达量逐渐增加。因此，推测纤维连接蛋白不但在整个肾脏发育过程中始终起到了重要的作用，而且对成熟肾脏功能结构的维持起重要作用。
在非极性的间充质细胞转化为上皮细胞的过程中,细胞与基底膜黏附，导致细胞表面和分子结构的不对称,也就具有了极性[16]。郭敏等[17]曾提出层粘连蛋白参与细胞极性的形成。层粘连蛋白、纤维连接蛋白是基底膜的重要成分，纤维连接蛋白也是多种细胞外基质蛋白质整合的关键因子[18]。有学者也曾提出纤维连接蛋白调节极性细胞的延伸[19]，并且本实验也观察到单个间充质细胞周围以及肾小管上皮细胞基底膜处均有纤维连接蛋白的表达，作者认为纤维连接蛋白也参与了细胞极性的形成。
综上所述，纤维连接蛋白对肾脏各结构的发育以及成熟肾脏各结构的维持都起到了重要作用，但是纤维连接蛋白对肾脏发育的作用机制以及对肾脏各结构发育作用的程度有待进一步阐述[20]。

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