电穿孔介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性*☆

董少红，李江华，罗林杰，高虹，梁新剑，庞新利，张鹏

课题背景：课题得到广东省深圳市科技局赞助，项目编号200304016，赞助经费2.0万元；此外还有深圳市人民医院院配基金2.5万元，暨南大学给3个研究生3年配置的经费1.89万元。相关课题研究目前已发表4篇文章，目前已向深圳市科技局申报成果。

术语解析：骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间、具有增殖分化潜能的肌源性干细胞，平时处于未分化状态，当骨骼肌受损时能被激活进入细胞周期，然后互相之间或与受损的肌纤维融合，恢复骨骼肌的连续性及功能。

偏倚或不足：①实验在骨骼肌卫星细胞原代取材过程中，存在步骤多、操作时间长、易造成污染等缺点。今后可以将胰蛋白酶和胶原酶两者放在一起消化，摸索出两者联合消化的最佳时间，即最大产出量，最少的时间与步骤。②电转染死亡率过高，且效率低，需继续寻找最佳的电转染参数。③关于转染后的检测略显简单，如果在流式细胞仪检测方面再加上凋亡率可能更具说服力。

暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院心内科，广东省深圳市 518020

董少红☆，女，1962年生，河北省秦皇岛市人，汉族，1991年北京医科大学毕业，博士，主任医师，主要从事冠状动脉粥样硬化性心脏病的诊断与介入治疗方面的研究。
dsh266@med
mail.com.cn

摘要
目的:电穿孔的原理是应用短暂高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔，外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内。实验拟验证电穿孔法介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性和转染效率，以获得基因治疗自体移植的载体。
方法：实验于2006-10/2007-09在暨南大学医学院中心实验室完成。①材料：清洁级1~3 d龄SD大鼠3只，购于广东省医学实验动物中心，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。基因转染过程应用的pEGFP-N1质粒由本课题组保存。②实验方法：大鼠颈椎脱臼处死，在无菌条件下分离四肢肌组织，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm组织块，采用改良酶消化法分离骨骼肌卫星细胞，再以差速贴壁和非连续梯度离心法分两步进行纯化，细胞均匀增殖至培养面80%或局部增殖过度密集时胰酶消化传代。取第3代处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，消化离心后调整细胞数为2.0×107 L-1，取400 μL注入4 mm电击杯中，再加入pEGFP-N1质粒15 μg混匀，将电击杯放入电转槽静置5 mim。电击条件为电容1 050 μF，电压180 V，脉冲时间20 ms，脉冲数2次，脉冲间隔时间1 min，电击缓冲液为不含钙镁的磷酸盐缓冲液。放电后电击杯冰浴，并用不含血清的DMEM清洗，将清洗液转入培养瓶中，4 h后换用体积分数为0.1胎牛血清的完全培养基，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养。同时设不加质粒的空白对照。③实验评估：倒置显微镜下观察细胞生长状况。
免疫细胞化学检测肌动蛋白的表达。随机计数多个低倍视野，计算电穿孔pEGFP-N1质粒转染卫星细胞的效率。绘制细胞生长曲线，并用流式细胞仪测量细胞周期。
结果：①骨骼肌卫星细胞的形态：原代培养48~72 h细胞完全贴壁，呈梭形或纺垂形，长轴平行排列，胞核圆形，核仁明显。5 d时细胞可伸出一个或数个突起。随培养时间的延长，卫星细胞连接成网状。当延迟分瓶或使用分化培养基，相邻的细胞会融合成肌管，继而形成串联，且能看见肌管的跳动。传代后细胞形态呈更加一致的梭形，6 h即完全贴壁，细胞增殖速度明显加快，生长更为旺盛。传至8代卫星细胞出现老化现象。②免疫细胞化学检测：骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。③转染效率：pEGFP-N1质粒电转染8 h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞，48~72 h达高峰，阳性表达率约35%。④细胞生长曲线及细胞周期检测：电转染细胞接种后第3天进入对数生长期，第7天由于接触抑制导致增殖速度减慢，81.5%处于G0/G1期，19.3%处于S+G2+M期。未转染细胞生长曲线、细胞周期均与其相似。
结论：电穿孔法介导外源性基因表达于大鼠骨骼肌卫星细胞具有较高的转染效率，操作简便，重复性好，且对卫星细胞生物学行为无明显影响。
关键词：骨骼肌卫星细胞；基因转染；绿色荧光蛋白；电穿孔；原代培养

董少红，李江华，罗林杰，高虹，梁新剑，庞新利，张鹏.电穿孔介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2206-2210 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2206(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02206-05

Feasibility of transfecting exogenous genes into rat skeletal myoblasts by electroporation

AIM:The principle of electroporation is to use the high pressure pulsed electrical currents to permeabilize cell membranes into nanometeric micropore and thereby enhance the uptake of the exogenous genes into the cells through these micropores or the redistribution of membrane component by exogenous DNA. This study aimed to verify the feasibility and transfection efficiency of exogenous genes into skeletal myoblasts by electroporation, in order to get genetically modified cells for autograft.
METHODS: The experiment was completed in the Central Laboratory of Medical College of Jinan University from October 2006 to September 2007.①Materials: Three 1-3 days old clean SD rats were bought from the Medical Experimental Animal Centre of Guangdong Province, and the disposal to animals fit the animal ethical standard. The pEGFP-N1 plasmid was stored by this laboratory.②Methods: Rats were sacrificed by luxatio of the cervical vertebra. Under sterile conditions, the skeletal muscles of the extremities were excised from the rats, and were cut into pieces that the volume within 1 mm × 1 mm×1 mm. Rat skeletal myoblasts were obtained by modified enzyme digestion, and were purified by preferential attachment method and discontinuous percoll gradient centrifugation. When the cells grew to 80% confluence or proliferated densely in local site, digestion of the cells was performed with trypsin. The skeletal myoblasts of the third generation at logarithmic growth phase were obtained by digestion and the density were adjusted into 2.0×107 L-1. 400 μL cells were removed into the 4-mm-wide electrode, then mixed with 15 μg pEGFP-N1 plasmid. The electrode was put into the bucket for 5 minutes. Shock conditions were: electric capacity 1 050 μF, voltage 180 V, pulse duration 20 ms, 2 electric pulses, interval pulses 1 minute. The electroporation buffer was phosphate buffer saline without Ca and Mg. After discharge, the electrode with cells and plasmid were put into the ice, and were washed by DMEM without fetal bovine serum. The washed solution was removed into the culture flask, and the DMEM was changed into the complete medium with 10% fetal bovine serum. The cells were cultured in the sterile incubator with 0.05 volume fraction of CO2 at 37 ℃. Meanwhile the blank contrast without plasmid was set up.③Assessments: The morphological character of cells was observed in the inverted microscope. The expression of actin was tested by immunocytochemistry. Several low power fields were selected at random to count the efficiency of transfecting pEGFP-N1 plasmid into skeletal myoblasts. The growth curve of skeletal myoblasts was drawn, and the cell cycle was tested by the flow cytometry.
RESULTS: ①Morphology of skeletal myoblasts: After 48-72 hours primary culture, the cells were completely attached and gradually extended in the shape of spindle with the round nucleus, paralleled along their longitudinal axis and appeared chromatospherite. After 5-day culture, the cells stretched out one or several apophyses. As the culture time prolonged, the cells interconnected into a net. The closed cells could fuse, form the myotubes and then cascaded if delaying the passage or culturing with differential medium. The well-differentiated myotubes gave rise to spontaneous pulsation and contraction. Six hours after cell passaging, the cells completely attached to the wall of the flask, showing obviously accelerated proliferation and more coherent spindle. The cells began aging when passaging to the eighth generation.②Immunocytochemistry showed sarcomeric actin positive expression.③Transfection efficiency: Eight hours after pEGFP-N1 plasmid electroporation, several cells showed green fluorescence, which achieved a peak 48-72 hours after transfection. The positive expression rate was about 35%.④Cell growth curve and cell cycle: On the third day after electroporation, the cells entered logarithmic growth phase but the rat of proliferation slowed down at the 7th day due to contact inhibition. 81.5% in the G0/G1 phase and 19.3% in the S+G2+M phase. The growth curve and cycle of the untransfected cells were similar to the that of the transfected cells.
CONCLUSION: The efficiency of transfecting exogenous genes into skeletal myoblasts is high, with convenient operation and good reproducibility, moreover the electroporation has no obvious influences on the biological behavior of skeletal myoblasts.

Dong SH, Li JH, Luo LJ, Gao H, Liang XJ, Pang XL, Zhang P.Feasibility of transfecting exogenous genes into rat skeletal myoblasts by electroporation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2206-2210(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2206(ps).pdf]

骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间、具有增殖分化潜能的肌源性干细胞，平时处于未分化状态，当骨骼肌受损时能被激活进入细胞周期，然后互相之间或与受损的肌纤维融合，恢复骨骼肌的连续性及功能[1-4]。
由于骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖和分化能力，并且取材方便，免疫原性低和耐缺血缺氧能力强[5]，故应用于组织工程[6]、基因治疗[7]等方面，特别是将骨骼肌卫星细胞进行体内移植后在宿主心肌中能够很好生长，可在心肌环境诱导下分化，改善心脏功能[8-11]，因此是对心肌梗死后心肌进行细胞移植治疗和基因治疗的理想靶细胞。本实验尝试用两步法纯化大鼠骨骼肌卫星细胞，观察其生长特性，并采用电穿孔的方法导入增强型绿色荧光蛋白基因，为将携带有酸性成纤维细胞生长因子的载体转染骨骼肌卫星细胞心肌移植提供实验依据。

设计：细胞观察实验。
单位：暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院心内科。
材料：实验于2006-10/2007-09在暨南大学医学院中心实验室完成。清洁级1~3 d龄SD大鼠3只（购于广东省医学实验动物中心，动物质量合格证号：0021124），雌雄不拘，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。pEGFP-N1质粒由本课题组保存；DMEM培养基（GIBCO公司）；胎牛血清（HYCLONE公司）；胶原酶Ⅰ，胰蛋白酶（Sigma公司）；percoll分离液（Sigma公司）；α-sarcometric actine单克隆抗体，SABC试剂盒，DAB试剂盒（博士德公司）；质粒小量提取试剂盒（天根）；ECM2001电穿孔仪（BTX公司）。
设计、实施、评估者：实验设计、干预实施为第二作者，结果评估为第一作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
卫星细胞的分离：大鼠颈椎脱臼处死，置于体积分数为0.75的乙醇中浸泡5~10 min。移至超净工作台，在无菌条件下分离四肢肌组织，无菌冷D-Hank’s冲洗3次，小心剔除筋膜、肌腱、脂肪、神经和血管等组织。将组织块剪碎成1 mm3大小，移入无菌离心管中，无菌冰冷的D-Hanks反复吹打3次，静置1 min，弃去上层组织和漂浮物。向组织中加入2 g/L胶原酶Ⅰ，置于细胞培养箱中消化60 min，每10 min吹打1次。弃上清，再加入2.5 g/L胰蛋白酶，置于细胞培养箱中消化30 min，每10 min吹打一次。将所得的细胞悬液1 500 r/min离心5 min，弃上清，用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞悬液依次经100目和200目滤网过滤。
卫星细胞的初步纯化：将上述过滤获得的细胞滤液接种于塑料培养瓶中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中，静置培养2 h。
卫星细胞的再次纯化：取15 mL无菌离心管，从下至上分别轻轻铺制60% percoll工作液2 mL，20% percoll工作液6 mL，最上层轻柔加入经初次纯化得到的含未贴壁细胞的培养基2 mL，4 000 r/mim离心5 min。无菌长尖头吸管轻轻吸取60%和20% percoll工作液交界面的乳白色混浊带约1 mL，移至另一无菌离心管，用无血清培养基1 000 r/mim离心清洗2次，5 min/次，弃上清，用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种于培养瓶中，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养。3 d后首次换液，以后每2 d换液1次。
卫星细胞的传代培养：纯化后的细胞均匀增殖至培养面80%或局部增殖过度密集时，用2.5 g/L胰酶消化传代，以1:3的比例进行传代，每2 d换液一次，倒置显微镜下观察细胞生长状况。
免疫细胞化学检测：收获培养至第3代的卫星细胞，消化后以1.0×105个细胞/孔接种入预铺制盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基培养，待细胞80%汇合时改用分化培养基进行培养，待肌管形成后取出盖玻片，常规处理后进行α-sarcometric actine免疫组织化学染色，以成纤维细胞为阴性对照。
质粒的制备及鉴定：将pEGFP-N1质粒转化感受态TOP10大肠杆菌，取菌液20 μL接种到5 mL含 100 mg/L卡那霉素的LB培养基中，37 ℃摇床上振荡过夜。按照质粒小量提取试剂盒说明用碱裂解法提取纯化质粒DNA，紫外分光光度计测吸光度（OD 260 nm：OD 280 nm=1.8），测量浓度为0.36 g/L，置于-20 ℃备用。取少量质粒用EcoRI和xbal酶切，0.9%琼脂糖电泳鉴定酶切结果。质粒经EcoRI和xbal酶切后电泳显示有两条带，分别位于770 bp和4.7 kb处，与物理图谱相一致，故可验证所获得质粒即为pEGFP-N1。
电转染骨骼肌卫星细胞：取第3代处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心10 min收集细胞。用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，1 000 r/min离心10 min收集细胞，调整细胞数为2.0×107 L-1。取细胞400 μL小心注入4 mm电击杯中，再加入15 μg质粒pEGFP-N1轻轻混匀，冰浴10 min。将电击杯放入电转槽静置5 min。设置电击条件：电容1 050 μF，电压180 V，脉冲时间20 ms，脉冲数2次，脉冲间隔时间1 min，电击缓冲液为不含钙镁的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）。放电后电击杯冰浴10 min，用20倍不含血清的DMEM清洗电击杯，将清洗液转入培养瓶中，4 h后换用体积分数为0.1胎牛血清的完全培养基，于 37 ℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养。同时设不加质粒的空白对照。随机计数多个低倍视野（×100）中相差显微镜及转换荧光观察的同一视野中的细胞数量。
卫星细胞生长曲线MTT法测：收获生长旺盛的第3代卫星细胞和电转染48 h的细胞，以1.0×103个/孔的密度接种于96孔板，每孔体积200 μL，设3个复孔。次日开始每天固定时间向各孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，4 h后吸弃，每孔再加入DMSO 150 μL，用酶标仪测定每孔吸光度（A），以时间（d）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
流式细胞仪测量细胞周期：2.5 g/L胰蛋白酶消化收集电转染48 h的卫星细胞，磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，制备单细胞悬液，70%预冷的乙醇固定，等体积细胞悬液和碘化丙啶（PI）混合，300目尼龙膜过滤后用流式细胞仪测定细胞周期比率，同时以未转染的细胞为对照。
主要观察指标：①骨骼肌卫星细胞的形态。②免疫细胞化学检测。③电转染pEGFP-N1质粒效率。④细胞生长曲线。⑤细胞周期检测。

2.1 骨骼肌卫星细胞的形态刚消化下来的细胞呈球形或者椭圆形，折光性强但是看不到细胞核。原代培养14 h大部分开始贴壁，细胞形态改变不明显，仍为球形。48~72 h已完全贴壁，细胞呈梭形或者纺垂形，长轴平行排列，胞核圆形，核仁明显。培养至5 d时卫星细胞可伸出一个或者数个突起。随培养时间的延长，卫星细胞增殖、迁移沿一个方向平行的排列，连接成网状。当延迟分瓶或使用分化培养基，或局部细胞密度高于80%，相邻的细胞会融合成一长条形的肌管。继续延迟分瓶或使用分化培养基则可形成大量的肌管，相邻的肌管可形成串联，且能看见肌管的跳动。
传代细胞30 min开始贴壁，细胞形态比原代细胞呈更加一致的梭形，6 h贴壁完全，细胞增殖速度明显加快，生长较原代细胞更为旺盛。当传代至8代左右卫星细胞出现老化现象，倒置显微镜下表现为细胞形态呈多样性，细胞边缘不规则，突起明显增多，胞浆出现大量颗粒。
2.2 免疫细胞化学检测结果在卫星细胞胞浆内可见棕黄色沉着，骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。作为对照的成纤维细胞呈阴性反应。经计算肌动蛋白免疫细胞化学染色阳性率为95%。
2.3 电转染pEGFP-N1质粒效率电转染pEGFP-N1质粒8 h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞；48~72 h发荧光的细胞达高峰，阳性表达率约35%。绿色荧光在胞浆中均匀分布，有的细胞胞核中荧光表达呈强阳性。随着细胞的传代培养，未转染成功的细胞呈优势生长，发荧光的细胞比例逐渐下降，至转染后20 d仍有少许散在的荧光存在。
2.4 细胞生长曲线绘制细胞接种后第3天开始进入对数生长期，第7天由于接触抑制导致增殖速度减慢。电转染后的细胞与未转染细胞生长曲线基本一致。
2.5 细胞周期检测结果应用流式细胞仪检测3次，未转染的卫星细胞处于G0/G1期比例分别为82.2%，80.2%，79.6%，处于S+G2+M期比例分别为17.8%，19.8%，20.4%；电转染后处于G0/G1期的细胞分别为83.8%，81.4%，79.3%，处于S+G2+M期的细胞分别为16.2%，18.6%，20.7%。以上数据说明转染和未转染的卫星细胞周期变化不大，且多数细胞处于静止期。

3.1 骨骼肌卫星细胞的分离纯化自1961年发现以来，骨骼肌卫星细胞原代取材培养的方法有很多种，如组织块法、Dorfman法[12]、Johnson法[13]以及在上述各方法基础上进行改良的方法[14-15]。但这些方法有的所得细胞产量不高，有的所得细胞纯度不高。本实验综合各种方法的利弊，采用酶消化联合两步纯化法来分离纯化骨骼肌卫星细胞。首先利用胶原酶对细胞间质有较强的消化作用，可使细胞与胶原成分脱离而分离出单根肌纤维，采用胶原酶消化1 h，起到分离肌束的作用；再用胰蛋白酶消化30 min使卫星细胞从肌膜与基底膜之间释放出来。胰蛋白酶对细胞有较大杀伤作用，消化30 min既能达到最大的产出率又不影响细胞的贴壁率。
原代取材骨骼肌含有大量的杂质细胞，即使是新生大鼠，杂质细胞也将近70%，主要的杂质细胞为红细胞、成纤维细胞和少量的血管内皮细胞。红细胞不贴壁，可通过换液除去，而成纤维细胞与卫星细胞形态比较相似，较难区分。现在国内外大都用差速贴壁法和percoll法（非连续梯度密度离心法）除去成纤维细胞。差速贴壁法利用成纤维细胞与卫星细胞贴壁能力的差异不同达到目的。成纤维细胞30 min即开始贴壁，2 h贴壁完全，而卫星细胞则2 h开始贴壁。但差速贴壁分离出来的细胞纯度不高。因此很多人利用percoll法来分离成纤维细胞。本课题组发现在使用percoll分离法离心后用巴斯德吸管吸取60%和 20% percoll工作液之间的混合液时，极易把邻近的成纤维细胞混悬液吸进去，造成分离出的细胞仍含有较多的成纤维细胞。经过多次尝试以后，将差速贴壁法和percoll法两者联合起来，先用差速贴壁法除去大部分的成纤维细胞，再用percoll法进一步分离，这样得到的卫星细胞纯度高达95%以上，完全合乎组织工程移植的要求。
3.2 骨骼肌卫星细胞的增殖、分化和鉴定很多文献报道，骨骼肌卫星细胞的贴壁能力较差，一般都要使用L-多聚赖氨酸或者胶原促进贴壁[16-17]，否则会因为贴壁失败而死亡。本课题组在实验中未使用类似促进贴壁的物质，而是提高了培养血清的浓度，卫星细胞的贴壁能力明显增强。卫星细胞经原代培养24 h已经贴壁、延展，一般经过3~4 d的生长潜伏期，在此期间较少见分裂相。此后进入对数生长期后增殖加快。当传代至8代左右时，细胞出现老化现象，表现为细胞形态呈多样性，胞浆出现较多空泡。当降低血清浓度或者延迟分瓶，卫星细胞倾向于分化为肌管。肌管的形成是卫星细胞分化的标志，也是形态学上鉴定卫星细胞指标之一。开始一般形成一条或者数条肌管，胞核位于肌管中央，很难看见肌管的跳动。当继续培养大约10 d，卫星细胞融合成大量的肌管，排列的方向较一致，可以看见肌管的收缩。
除了肌管作为卫星细胞的鉴定指标外，部分骨骼肌特异性蛋白的合成和表达也可作为卫星细胞的鉴定指标。α-sarcometric actine和myosine是骨骼肌的结构蛋白和功能蛋白，也是骨骼肌所特有的蛋白。本实验采用的是α-sarcometric actine蛋白单克隆抗体进行免疫组化染色，单个细胞为弱阳性，说明分化的初始阶段表达的蛋白量少；而肌管染色为强阳性，说明分化后期特异性蛋白表达量多。
3.3 电转染参数设置将质粒导入细胞内的方法很多，有磷酸钙法、脂质体法、DEAE-葡聚糖法、基因枪、电穿孔等。
电穿孔的原理是应用短暂的高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔，外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内，具有操作简便，转染效率高，适用范围广，重复性好，对细胞基本无毒副作用等优点[18-19]。影响电穿孔的因素主要有细胞因素（细胞的类型、大小、生长的时期、密度等）、物化因素（电穿缓冲液的pH、离子成分、外源DNA的浓度、形状、电穿前后对细胞的处理方式）和电参数（脉冲类型、电压、脉冲时间、脉冲次数）。其中电参数尤为重要。电压越高，转化效率越高，但细胞存活率越低。因此找到转化效率和存活率的平衡点是电击追求的最佳效果。
本课题组在选取参数时综合参考了国外学者Marco Sandri [20]所提供的例子以及BTX公司网上推荐方案，并结合自身实验室的实际情况而制定。在电击完成后48 h内，大约有50%的细胞死亡，出现大量的细胞碎片，电击后的卫星细胞的在6 h贴壁完全，24 h有大量的荧光表达，48 h达高峰，此时的转染率约为35%，存活率约为50%，与文献上报道[20]的结果相近，且表达的时间可以持续20 d，基本满足基因修饰后的心肌移植要求。在设定的电穿条件下，电转染后卫星细胞的生长曲线，细胞周期分布与未进行转染的细胞相比较没有明显的变化，说明转入pEGFP-N1基因后对卫星细胞的生物学行为影响不大。
本实验成功将外源基因以较高效率安全导入了骨骼肌卫星细胞，为以后进一步将携带有促血管生成基因的表达载体导入骨骼肌卫星细胞并用于心肌移植提供了很好的实验学依据。

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