基因转染促骨髓间质前体细胞体外向软骨的分化**☆

王卫国1，孙伟1，鞠晓东2，娄思权2

课题背景：课题受国家自然科学基金和卫生部部属临床重点学科项目资助，在之前的研究中已顺利构建转化生长因子β2的真核表达载体，并在转染人关节软骨细胞和维持其表型的研究中获得成功。

偏倚或不足：①虽然在转染后48 h和4周均检测到目的基因的表达，但基因整合和表达的长期稳定性尚需进一步确定，采用病毒载体进行转化实验或许可以提高基因整合率和表达稳定性。②骨髓间质前体细胞在体外单层培养中可诱导表达软骨相关基因和蛋白，但尚不能证实其能分化为成熟软骨细胞，尤其不能确定其具有关节软骨的生物学特性，下一步可利用生物反应器或者进行体内实验深入分析。

术语解析：基因转染是将具生物功能的核酸（RNA或DNA）转移或运送到细胞内，并使核酸在细胞内维持其生物功能的核酸转移技术。在组织工程研究中，靶细胞不仅是作为目的基因的携带者，而且还是组织修复的细胞成分。基因转染的方法包括磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、机械法以及脂质体法等，其中脂质体转染的转染效率相对较高，操作简便，是实验常用的转染方法。

1中日友好医院骨科，北京市 100029；2北京大学第三医院骨科，北京市 100083

王卫国☆，男，1971年生，山东省临沂市人，汉族，1997年中南大学湘雅医学院毕业，博士，主治医师，主要从事关节外科方面的研究。
wweiguo1971@
yahoo.com.cn

国家自然科学基金（30672117）*；卫生部部属临床重点学科项目（2007-2009）*

摘要
目的:骨髓中包含的间质前体细胞在适宜的条件下可以被许多细胞因子诱导分化为软骨。采用基因转染技术观察转化生长因子β2对体外培养的骨髓间质前体细胞向软骨分化的影响。
方法：实验于2005-12/2007-01在中日友好医院临床研究所骨科实验室完成。①骨髓标本来源于6名志愿者，对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：志愿者局麻下行骨髓穿刺，抽取7.0~10.0 mL骨髓抗凝，以密度梯度离心法分离人骨髓间质前体细胞，通过脂质体介导转染技术，将pcDNA3.1(+)TGF-β2载体导入骨髓间质前体细胞中，体外单层培养。③实验评估：利用RT-PCR、Western Blotting和免疫组化法检测转化生长因子β2和软骨相关基因、蛋白的表达情况。
结果：①转染后48 h，可检测到明显的转化生长因子β2 mRNA表达，Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA均有轻微表达；转染后4周，转化生长因子β2 mRNA表达稍有降低，Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA表达均明显上调。②转染后48 h和4周，间质前体细胞培养上清液中均有转化生长因子β2蛋白的表达。③转染后48 h部分细胞显示Ⅱ型胶原蛋白免疫组化阳性信号，转染后4周Ⅱ型胶原蛋白阳性细胞数增加。
结论：pcDNA3.1(+)/TGF-β2真核表达载体在骨髓间质前体细胞内可获得短暂和长期表达。在单层培养的情况下，骨髓间质前体细胞可被转化生长因子β2诱导向软骨方向分化。
关键词：组织工程；软骨；TGF-β2；基因转染；间质前体细胞

王卫国，孙伟，鞠晓东，娄思权.基因转染促骨髓间质前体细胞体外向软骨的分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2211-2215 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2211(ps).pdf]

Gene transfection to induce in vitro chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells

AIM:Bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells could be induced by various cytokines to differentiate into chondrocytes under specific condition. This study investigated the effect of human transforming growth factorα2 (TGF-α2) on mesenchymal progenitor cell chondrogenesis in monolayer culture.
METHODS: The experiment was performed at Clinical Institute Orthopaedic Laboratory of China-Japan Friendship Hospital from December 2005 to January 2007. ①Bone marrow was harvested from 6 volunteers. Informed consents of treatment and experiment were signed previously, and the experiment was approved by medical ethics committee of the hospital.②Bone marrow aspiration was performed under local anesthesia and 7.0-10.0 mL of marrow was harvested from each volunteer. Mesenchymal progenitor cells were isolated by density gradient centrifugation. Recombinant pcDNA3.1(+)/TGF-β2 was transfected into mesenchymal progenitor cells by liposome technique, and cells were cultured in monolayer in vitro. ③RT-PCR, Western blotting and immunohistochemistry analyses were performed to identify the expression of TGF-β2 and cartilage associated genes and proteins.
RESULTS: ①RT-PCR results showed that marked expression of TGF-β2 and slight expression of both type Ⅱ collagen A1 (COL2A1) and Aggrecan mRNAs were detected in transfected cells after 48 hours. At the culture interval of 4 weeks, the expression of TGF-β2 was slightly decreased, and the expression of COL2A1 and Aggrecan was significantly up-regulated. ②Western blotting suggested that TGF-β2 protein was detected in the culture medium of transfected cells at both 48 hours and 4 weeks after transfection. ③Immunohistochemistry suggested that type II collagen protein was detected in some of the transfected cells 48 hours after transfection. More cells with positive signal were detected 4 weeks after transfection.
CONCLUSION: Transfection of pcDNA3.1(+)/TGF-β2 into mesenchymal progenitor cells is able to provide transient and persistent expression. The differentiation of human marrow-derived mesenchymal progenitor cells into chondrocyte in monolayer culture is feasible and may be induced by TGF-β2.

Wang WG, Sun W, Ju XD, Lou SQ.Gene transfection to induce in vitro chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2211-2215
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2211 (ps).pdf]

骨髓中包含的间质前体细胞具有多向分化潜能，在适宜的条件下可以分化为软骨，对于软骨组织工程是一种很有前景的种子细胞[1]。间质前体细胞的软骨分化可以被许多细胞因子诱导，其中绝大多数属于转化生长因子β或其超家族[2-4]。哺乳动物软骨组织中已经分离出3种转化生长因子β的亚型，其中转化生长因子β1的研究最广。转化生长因子β2与转化生长因子β1的作用相似，在成人或胚胎的生长发育中起重要作用，尽管有研究发现转化生长因子β2可以促进体外软骨细胞的增殖和再分化，然而其对前体细胞软骨分化的作用、在前体细胞中的表达情况以及在软骨组织工程中的应用价值尚未被完全确定[5-6]。本实验使用基因转染的技术来观察转化生长因子β2对单层培养间质前体细胞的生物学活性，通过检测软骨相关基因和蛋白的表达来确定转染细胞的软骨分化。

设计：细胞观察实验。
单位：中日友好医院骨科，北京大学第三医院骨科。
材料：实验于2005-12/2007-01在中日友好医院临床研究所骨科实验室完成。骨髓标本来源于志愿者6人，其中髋臼骨折1人、脊柱骨折3人、腰椎滑脱1人、胫骨骨折1人，年龄19~37岁，平均28.6岁，全部为实验期间住院患者，对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。主要试剂和仪器：含有pcDNA3.1(+)-TGFβ2质粒的菌种由作者在之前的研究中制备并保存[7]；质粒抽提纯化试剂盒(QIAGENE)；Histoplaque 1077梯度液、胰蛋白酶、G418、转化生长因子β2蛋白纯品（Sigma）；胎牛血清、DMEM、脂质体转染试剂盒、TRIzol试剂、RT反应试剂盒（Invitrogene）；Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（BOSTER）；ECL显色试剂盒(Amersham)；PCR引物（TaKaRa公司合成）。9600热循环PCR仪（PEKIN ELMER）；DU640分光光度计及各种型号离心机（BEKMAN）；GS-700分子成像分析系统(BIO-RAD)；CO2恒温培养箱（Thermo Forma）；IMT-2相差倒置显微镜（OLYMPUS）。
设计、实施、评估者：实验设计为全部作者，实施和评估为第一、二作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
骨髓间质前体细胞的分离培养[8]：志愿者局麻下行骨髓穿刺，抽取骨髓7.0~10.0 mL至抗凝注射器，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以含15％胎牛血清的DMEM重悬细胞团，锥虫蓝染色计数活细胞。调整细胞浓度为1×109 L-1，将细胞悬液接种于培养瓶中，于 37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养，48 h后更换培养基。每天于相差显微镜下观察细胞生长情况，两三天更换1次培养基。当细胞汇合成单层时，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化，按1∶2传代。一次传代的细胞生长至融合后再次用上述消化液消化、计数，以1×105密度接种到25 cm2培养瓶(5× 105/瓶)或直径30 mm的培养皿(2×105/皿)中，培养皿中预置多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）包被的盖玻片。
骨髓间质前体细胞的pcDNA3.1(+)-TGFβ2转染：取含有pcDNA3.1(+)-TGFβ2质粒的菌种扩增培养，以QIAGEN Plasmid Mega Kit(2500)试剂盒抽提纯化质粒DNA备用。选用传至第2代的骨髓间质前体细胞，细胞生长至汇合率达70%~80%时进行转染。每25 cm2细胞按以下试剂量操作：配制溶液A：pcDNA3.1(+)-TGFβ2质粒DNA 12μg及Plus反应液55μL，加入无血清DMEM至终体积250μL。配制溶液B：脂质体(Lipofectamin) 12.5μL，加入无血清DMEM至终体积250 μL。室温下放置15 min后，将溶液A和溶液B混合，室温放置15 min；吸去培养瓶中的原培养基，用5 mL无血清DMEM漂洗1次；将上述A、B混合液0.5 mL移入培养瓶中；另加入2 mL无血清DMEM，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。
筛选及检测方案：转染后3 h，将用于Western blotting检测的培养瓶和培养皿中的培养基更换为无血清的DMEM，其余细胞更换含15%胎牛血清的DMEM后继续培养。转染后48 h，以未转染细胞为对照进行RT-PCR、Western blotting和免疫组化检测。为获得转染阳性细胞，未检测的转染细胞更换培养基，加入G418 使其终浓度为200 mg/L。以后用含G418及15%胎牛血清的DMEM培养基维持筛选培养。细胞阳性克隆生长到一定数目后原瓶消化，重新贴壁。转染后25 d，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化细胞，计数。以1×108 L-1密度接种到培养瓶和培养皿中的玻片上。转染后28 d重复RT-PCR、Western blotting和免疫组化检测。
RT-PCR半定量检测：取长有转染和未转染细胞的 25 cm2培养瓶，用TRIzol试剂处理，抽提细胞总RNA，测定RNA浓度。用RT试剂盒对相同剂量（1μg）的RNA进行反转录。以β肌动蛋白（β-actin）为内对照，采用半定量PCR法检测转染前后软骨细胞中转化生长因子β2、Ⅱ型胶原A1（COL2A1）和Aggrecan转录表达的差异。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min 30 s，共30个循环，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
Western blotting检测：取样前2 d将细胞培养基更换为无血清的DMEM。采集无血清培养基，真空抽滤浓缩 10倍。取浓缩后的样本与变性缓冲液混合，99.9 ℃变性5~10 min。以转化生长因子β2蛋白纯品为对照，10％聚丙烯酰胺凝胶200 V恒压电泳36 min。100~120 V电泳90~ 120 min转膜、封闭后与兔抗人转化生长因子β2杂交。洗涤后与山羊抗兔IgG反应。ECL(enhanced chemiluminescence)显色试剂盒显色，常规显影、定影、烤干。
Ⅱ型胶原免疫组化检测：取转染及未转染间质前体细胞的细胞爬片，用ⅡI型胶原免疫组化试剂盒进行免疫组化检测，DAB显色，苏木精轻度复染，显微镜下观察、照相。
主要观察指标：①骨髓间质前体细胞的一般生物学特性。②软骨细胞特异性基因mRNA表达RT-PCR检测结果。③转化生长因子β2 蛋白的生物合成Western blotting检测结果。④Ⅱ型胶原蛋白表达免疫组织化学检测结果。

2.1 骨髓间质前体细胞的一般生物学特性锥虫蓝染色显示骨髓中分离的单个核细胞存活率为89%~100%左右。在原代培养中，接种后3~5 h有部分细胞开始贴壁。贴壁细胞初始为小圆形，培养1周后转变为梭形或成纤维样形态。细胞生长稳定，增殖速度较快，传代后3~5 d达对数生长期，平均1代时间为六七天左右。转染后48 h约10%细胞死亡（细胞汇合率由70%~80%减少为60%~70%），用G418筛选后细胞死亡速度和数量增加，1周内约有70%细胞死亡（细胞汇合率约20%）。筛选2周可见阳性细胞克隆形成，继续培养10 d后可按1∶2传代。转染后骨髓间质前体细胞生长旺盛且排列有序。
2.2 软骨细胞特异性基因mRNA表达RT-PCR检测结果转染后48 h，可检测到明显的转化生长因子β2 mRNA表达，Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA均有轻微表达；转染4周后仍可检测到转化生长因子β2 mRNA表达，灰度值比转染48 h时稍有减低，Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA表达均明显上调。对照实验中，未转染细胞中未检测到上述基因的表达。作为内对照，β-actin在各种细胞中恒定表达。见图1。

2.3 转化生长因子β2 蛋白的生物合成Western blotting检测结果转染后48 h和4周，间质前体细胞培养上清液中均有转化生长因子β2蛋白的表达，见图2。相同培养时期的未转染细胞内未检测到转化生长因子β2蛋白的表达。

2.4 Ⅱ型胶原蛋白表达免疫组化检测结果转染后 48 h，部分细胞显示免疫组化阳性信号；转染后4周，阳性细胞数增加。作为对照的未转染细胞未检测到Ⅱ型胶原蛋白的合成。

自体软骨细胞用于软骨缺损的修复存在一些不足：软骨细胞相对稀少，体内来源有限，体外的大量扩增导致种子细胞的老化和生物学功能的退化，修复的关节软骨远期效果也不理想，同时还容易出现软骨供区的远期并发症。这些因素都限制了软骨细胞在组织工程中的应用。以往的研究发现，在适当的培养条件下，骨髓中分离的间质前体细胞或称间质干细胞具有分化成软骨细胞、成骨细胞及其他细胞的能力[6,9]。间质前体细胞有多个组织来源，而骨髓间质前体细胞是最容易分离获取的。文献中描述的分离方法略有差别，基本的依据是骨髓细胞密度梯度和底物黏附特性。本实验利用密度梯度离心的方法，首先将骨髓通过1.077 g/mL的Percoll液上离心分离，分离细胞的活力较高（89%~100%），然后根据间质前体细胞与血系细胞贴壁性能的差异，更换培养基时除去未贴壁细胞，达到分离纯化的目的。所得的间质前体细胞稳定增殖，而且在之后的实验中表现出分化的潜能。
细胞分化需要细胞与细胞、细胞与环境间相互作用，许多生长因子，如转化生长因子β1、BMPs、IGF-1和bFGF等，在各种实验中已被尝试用作骨髓基质细胞分化的调节因子[10-12]。这些生长因子中很多属于转化生长因子或其超家族，其成员是一族具有多种生物学功能的蛋白多肽，通过与细胞膜上的I、Ⅱ两种类型的跨膜丝氨酸激酶受体相互作用而发挥作用。转化生长因子相关分子先与Ⅱ型受体结合，然后结合I型受体，在细胞表面形成一个异源复合物。此复合物中I型受体上的丝氨酸和苏氨酸残基经Ⅱ型受体的激酶活性磷酸化而被激活，I型受体激活后通过SMADs蛋白将信号从细胞浆转移到细胞核中[13-14]。哺乳动物软骨组织中已经分离出3种转化生长因子β的亚型，这3种亚型的转化生长因子β与核心蛋白多糖均具有很高的亲和力。其中转化生长因子β1是研究最广的，在多种结缔组织中起不同的作用[2,15-16]。转化生长因子β3也具有促进骨髓间质干细胞软骨分化的作用[17-18]。转化生长因子β2的生物学功能与转化生长因子β1相似，对软骨和成骨分化具有调节作用[5-6,19]。有研究已证实，用转化生长因子β2处理去分化的软骨细胞后，细胞重新表达葡糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，恢复了其软骨表型；软骨膜中分离的前体细胞在含有转化生长因子β2 和IGF-1的培养基中培养后产生软骨基质，表现出软骨分化的潜能[6,20]。然而转化生长因子β2对骨髓间质前体细胞分化的影响尚未被完全确定。本实验对Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达进行了检测，这两种基质成分被认为在骨髓前体细胞的软骨分化过程中被特异性表达[21]。结果发现Ⅱ型胶原和Aggrecan在转染后48 h均有表达，而且4周后在转染阳性细胞中其表达水平被明显上调。免疫组化结果也显示Ⅱ型胶原在短暂转染和转染阳性细胞中均有合成，而对照组未转染细胞中没有检测到。实验结果说明，转化生长因子β2可以启动或促进骨髓间质前体细胞的软骨分化。当然，关于转化生长因子β2、前体细胞以及外部环境的相互作用尚需进一步研究，以揭示该生长因子作为软骨分化刺激因子的相关机制，以及作为一种可能的促进因素在软骨损伤修复中的使用价值。
外源性生长因子可以影响体外培养细胞的增殖和分化，但随着培养基的更换，这种诱导作用会逐渐降低直至消失。要维持其生物学作用，必须不断加入新的生长因子。目前生长因子蛋白的使用还存在许多未统一的问题，如使用多长时间为适合的时限？生长因子的最佳浓度是多少？这些不确定因素限制了生长因子的应用。如果将某些编码特定蛋白的基因转染到细胞，这些携带目的基因的细胞可以通过自身增殖合成内源性生长因子，对靶细胞产生持续的生物学作用。这些细胞可以不单是作为目的基因的携带者，同时可能作为组织修复的细胞成分。具有软骨分化潜能的骨髓间质前体细胞是体外基因转染和体内植入的合适候选者[22]。既往的研究中使用腺病毒或质粒载体携带转化生长因子β1或BMPs转化或转染骨髓间质细胞获得成功，目的基因在宿主细胞内稳定表达，对靶细胞的软骨分化产生明显的促进作用[14,23]。在以往的研究中，利用重组DNA技术构建了pcDNA3.1(+)/转化生长因子β2表达载体，并将其转染关节软骨细胞获得成功[7,24]。本实验将pcDNA3.1(+)/转化生长因子β2转染至单层培养的骨髓间质前体细胞，结果显示：短暂转染（48 h）和4周后传代的阳性细胞中均有转化生长因子β2的高表达。这说明部分载体/目的基因重组体已与宿主基因组DNA整合，产生了稳定的表达，而且促进了宿主细胞的软骨分化。虽然这种诱导作用的稳定性尚不能完全确定，诱导的软骨是否将继续分化成其终末表型—肥大软骨细胞也需要进一步研究。但这一结果对于扩增骨髓来源的前体细胞用于软骨修复显示了良好的应用前景，所使用的方法对于进一步研究骨髓间质前体细胞的诱导分化，以及结合基因转染技术探讨软骨分化的早期机制均具有重要的参考价值。

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