课题背景：猪苓多糖作为免疫增强剂在临床已有应用，猪苓多糖免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、减轻放化疗药物所致的毒副反应等药理效应已得到证实。猪苓多糖的对脐血造血干细胞扩增及移植小鼠的免疫造血重建调控作用鲜见报道。

相关链接：人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内，其理论基础是经放射线照射使小鼠骨髓枯竭，龛位腾出，为移植的脐血造血干细胞提供空间，小鼠的造血微环境又可支持人造血干细胞的生长、分化、短期内人髓系和淋巴系祖细胞从而获得繁殖。但单份脐血造血干细胞含量有限，不能满足50kg以上成人的使用，因此，脐血造血干细胞的体外扩增研究是国内外研究的热点。

应用要点：脐血造血干细胞及其相关研究较多，但多集中在细胞因子扩增脐血造血干细胞方面，中草药扩增作用研究较少，对于有效调控药物的筛选研究亦属较新颖的内容，本文基于此展开，既发现了有效调控脐血造血干细胞扩增及移植的药物猪苓多糖，又为药物筛选动物模型的建立奠定了基础。

1中日友好医院骨科，北京市 100029；2北京大学第三医院骨科，北京市 100083

1兰州大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000；2兰州大学附属第一医院，甘肃省兰州市 730000;3川北医学院免疫学与分子生物学研究所，四川省南充市 637000；4中国科学院兰州物理化学研究所，甘肃省兰州市 730000

潘万龙★，男，1975年生，甘肃省兰州市人，汉族，2006年兰州大学基础医学院毕业，硕士，助教，主要从事移植免疫，肿瘤免疫研究。
panwl12@yahoo.
com.cn

通讯作者：尹少甫，教授，兰州大学基础医学院免疫教研室，甘肃省兰州市 730000

摘要
目的:人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内，其理论基础是放射线照射使小鼠骨髓枯竭，龛位腾出，为移植的脐血造血干细胞提供空间，而猪苓多糖是从中药猪苓中提取的多糖成分，具有免疫调节抗肿瘤作用，也是一种非T细胞促有丝分裂素，对放射线照射有一定的防护作用。观察猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建效应。
方法： 实验于2004-06/2006-05在兰州大学基础医学院免疫研究所完成。①实验材料：清洁级BALB/c小鼠由兰州生物制品研究所提供，8周龄，体质量约20 g，雌雄各半，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。脐血样本由兰泰医院妇产科提供，产妇及家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。猪苓多糖由兰州大学第一医院提供。②实验方法：应用20，17.5，12.5，7.5 mg/L猪苓多糖体外扩增培养脐血造血干细胞，并测定细胞增殖率及CD34+细胞数。将BALB/c小鼠分为正常对照组：尾静脉、腹腔注射等量生理盐水；照射空白组：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合尾静脉、腹腔注射等量生理盐水；照射药物组：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合尾静脉注射等量生理盐水、腹腔注射猪苓多糖；照射移植组（n =15）：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射等量生理盐水；照射移植药物组：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射猪苓多糖。③实验评估：观察小鼠生存状况及血常规变化，流式细胞仪测定CD3、CD4、CD8、CD19水平。
结果：57只小鼠均进入结果分析。①12.5 mg/L猪苓多糖增殖效率最为显著（P < 0.01），流式细胞仪测定显示CD34+细胞数扩增了6.33倍。移植药物组小鼠死亡率最低，死亡高峰集中在照射移植后7~14 d左右。②移植药物组小鼠血象恢复正常，并且时间明显短于其他实验组（P < 0.05）。③细胞及体液免疫恢复情况，移植药物组小鼠各项指标水平与正常小鼠无差别（P > 0.05），与其他各组小鼠比较，除CD4、CD19水平与照射移植小鼠无差别外均有差别（P < 0.05）。
结论：猪苓多糖对脐血造血干细胞有明显扩增作用，并能促进脐血造血干细胞移植小鼠免疫造血重建。
关键词：猪苓多糖；脐血造血干细胞；体外扩增；动物模型；免疫重建

潘万龙，李淑萍，唐恩洁，赵粉琴，罗慧英，尹少甫.猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建的调节效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2000，12(12):2216-2220
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2216(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02216-05

收稿日期: 2007-09-20
修回日期: 2007-11-08
(07-50-9-5188/GW·Q)

Regulatory effects of polyporus umbellatus polyose on in vitro amplification of umbilical cord blood hematopoietic stem cells and immune reconstruction after umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation

Abstract

AIM:Human umbilical cord blood hematopoietic stem cells can be transplanted into mice. It is based on vacation in mice bone marrow niches by irradiation. Polyporus umbellatus polyose drown from the Chinese medicine, polyporus umbellatus, has effects on immunoloregulation, tumor and irradiation prevention. This article observes immune reconstruction of polyporus umbellatus polyose on umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation.
METHODS: Experiments were conducted at the Institute of Immunology, Basic Medical College, Lanzhou University from June in 2004 to May in 2006. ①Clear BALB/c mice, eight weeks old, weighing 20 g, of either sex, were supplied by Lanzhou Institute of Biological Products. Animal disposition met animal ethical standard. Cord blood was offered by the Lantai Hospital of Lanzhou. Parturiens and their family members signed the informed consent. The experimental procedures were approved by hospital ethics committee. Polyporus umbellatus polyose was provided by First Affiliated Hospital of Lanzhou University. ②20，17.5，12.5，7.5 mg/L polyporus umbellatus polyose was applied to culture umbilical cord blood hematopoietic stem cells in vitro. Cell proliferation rate and CD34+ cell count were measured. BALB/c mice were divided into 5 groups. Mice in the normal control group were treated with saline via caudal vein and abdominal cavity. Mice in the irradiation blank group were irradiated with 3.5Gy by 60Co gamma ray and treated with saline via caudal vein and abdominal cavity. Mice in the irradiation-drug group received 3.5Gy by 60Co gamma ray, saline via caudal vein and polyporus umbellatus polyose via abdominal cavity. Mice in the irradiation-transplantation group (n =15) were irradiated with 3.5Gy by 60Co gamma ray, treated with umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation and saline via abdominal cavity. Mice in the irradiation-transplantation-drug group received 3.5Gy by 60Co gamma ray, umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation and polyporus umbellatus polyose injection via abdominal cavity. ③Survival and changes in blood routine parameters of mice were examined. CD3, CD4, CD8 and CD19 levels were determined with a flow cytometer.
RESULTS: Totally 57 mice were involved in the result analysis. ①Proliferation efficiency was the highest in mice treated with 12.5 mg/L polyporus umbellatus polyose (P < 0.01). The results of the flow cytometer determination showed that number of CD34+ amplified 6.33 times. Death rate of mice was the lowest in the irradiation-transplantation-drug group, and a peak of death occurred at 7-14 days after the irradiation and transplantation. ②Hemogram recovered to normal in the irradiation-transplantation-drug group, and the time of recovery was shorter than that of other groups (P < 0.05). ③There was no significant difference in the recovery of cell and humoral immunity in mice of the irradiation-transplantation-drug group and normal mice (P > 0.05), so does the CD4 and CD19 levels compared with the irradiation-transplantation group. There were significant differences in other indexes (P < 0.05).
CONCLUSION: Polyporus umbellatus polyose can evidently amplify umbilical cord blood hematopoietic stem cells and promote immune and hematopoietic reconstruction in mice undergoing umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation.

Pan WL, Li SP, Tang EJ, Zhao FQ, Luo HY, Yin SF.Regulatory effects of polyporus umbellatus polyose on in vitro amplification of umbilical cord blood hematopoietic stem cells and immune reconstruction after umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2216-2220(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2216(ps).pdf]

0 引言

自1989年Gluckman等[1]首次对1例5岁Fanconi贫血男孩进行了HLA匹配脐血移植治疗获得成功以来，脐血移植在造血干细胞移植领域中越来越突显其优势。然而，单份脐血造血干细胞含量有限，不能满足50 kg以上成人的使用[2]，因此，脐血造血干细胞的扩增研究是国内外研究的热点。猪苓多糖是从中药猪苓中提取的多糖成分，其主要结构为6-支链B-1，3-葡聚糖即葡聚糖多聚体，具有免疫调节抗肿瘤作用，也是一种非T细胞促有丝分裂素，对放射线照射有一定的防护作用[3]。然而，猪苓多糖对脐血造血干细胞扩增及移植小鼠的免疫造血重建调控作用却鲜见报道。

1 材料和方法

设计：随机同期对照动物实验。
单位：兰州大学基础医学院免疫学研究所。
材料：实验于2004-06/2006-05在兰州大学基础医学院免疫研究所完成。猪苓多糖（兰州大学第一医院提供）。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施为第一、二、四作者，评估为第三、五、六作者。
方法：
猪苓多糖体外扩增脐血造血干细胞：脐血样本由兰泰医院妇产科提供。收集对象为无急、慢性感染及血液系统疾患的非高危妊娠产妇，且其新生儿为足月顺产，出生后皮肤红润，无感染征象，产妇及家属对实验知情同意，实验经医院伦理委员会批准。新生儿娩出后，立即断脐，消毒脐带侧，行脐静脉套管插管，脐带血借宫缩力及位差重力作用流入血袋内（内含ACD-B液），摇动混匀，直至无脐血流出为止。将采集的脐带血置于4~10 ℃冰箱中暂存。将采集所得单人份脐血60 mL左右，于4 h内，用1.077 g/mL Ficoll-Hypaque液分离单个核细胞。吸取界面层白细胞洗涤，用IMDM培养液（加入体积浓度为20%的类标准胎牛血清）采用血细胞计数板调整至细胞浓度为2×108 L-1。将调好浓度的细胞悬液置于24孔细胞培养板中培养。每孔加入细胞混悬液 1 mL。设置4个药物浓度组，在每列的四个孔中分别加入100 mg/L的猪苓多糖使每孔中所含猪令多糖终浓度为20，17.5，12.5，7.5 mg/L，一个空白对照组加等量培养液。将此培养体系置于37 ℃、体积浓度为5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养7~10 d。每4 d补充等量的新鲜培养基及半量相应的药物。
检测扩增效率：细胞培养24 ，48，72 h吹打混匀各孔细胞悬液，取适量悬液MTT法测定细胞增殖率。以只加培养液的培养皿为空白对照。计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。扩增培养前后，各取适量细胞悬液测定CD34+细胞数，双色抗体定性定量，采用Coulter Epics XL型流式细胞仪检测（USA），Coulter System Ⅱ软件分析。
实验动物模型腹腔注射猪苓多糖：选清洁级BALB/c小鼠（兰州生物制品研究所），8周龄，体质量20 g左右，雌雄各半，实验前至少饲养1周，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。分组：正常对照组 （n =6）：正常小鼠尾静脉、腹腔注射等量生理盐水；照射空白组：放射线照射联合尾静脉、腹腔注射等量生理盐水；照射药物组（n =15）：放射线照射联合尾静脉注射等量生理盐水、腹腔注射猪苓多糖；照射移植组 （n =15）：放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射等量生理盐水；照射移植药物组（n =15）：放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射猪苓多糖。将待照射小鼠装入面积为25 cm×20 cm的特制鼠盒，照射距离为75 cm，吸收剂量率为0.2Gy/min，吸收剂量为3.5Gy经60Coγ射线亚致死量照射[4]，制备免疫缺陷小鼠模型，并于2~4 h内，尾静脉注射法将0.2 mL细胞悬液（单个核细胞 1×1010~2×1010 L-1）及等量生理盐水注于小鼠体内。小鼠饲养于无菌间，定期消毒；鼠盒、垫料及饮水瓶隔日更换，清洗消毒彻底，垫料经高压灭菌。死亡小鼠及时取出以免污染。小鼠饲以辐射灭菌饲料及高压灭菌水。在脐血造血干细胞移植小鼠的饲养过程中，照射药物组、照射移植药物组小鼠每日一次腹腔注射猪苓多糖灭菌溶液每只10 g/L[5]，其余各组腹腔注射等量生理盐水。
小鼠免疫及造血重建检测：记录小鼠生存状况，统计小鼠死亡率，分析死亡原因。对死亡小鼠进行解剖观察。自脐血造血干细胞移植之日起，第1，2，3，4周各检测每组小鼠红细胞、白细胞、血小板数量1次。并于第4周断头法采集小鼠血液，肝素抗凝，流式细胞仪检测小鼠细胞免疫及体液免疫指标，以判断小鼠免疫重建及恢复状况。单色抗体定性分析，采用Coulter Epics XL型流式细胞仪检测，Coulter System Ⅱ软件分析。
主要观察指标：①MTT测定细胞增殖率。②脐血扩增培养前后FCM测定CD34+细胞数。③小鼠血常规变化及外周血CD3、CD4、CD8、CD19水平。
统计学方法：统计学处理由第一作者采用SPSS 12.0软件包完成。采用one-way ANOVA完全随机设计单因素方差分析LSD-t检验、Independent-Samples T Test两独立样本t检验、pearson相关分析。率的比较采用Pearson Chi-Square检验。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 57只小鼠均进入结果分析。
2.2 MTT测定细胞增殖率 猪苓多糖12.5 mg/L组与其余各浓度组比较均有差异（P < 0.05）。时间与扩增率相关分析，见图1：12.5 mg/L组呈直线正相关关系 （r =0.744，P < 0.01）。说明以猪苓多糖12.5 mg/L组增殖效率最为显著，细胞增殖率在48 h达到峰值，以后逐渐减缓，见表1。

2.3 流式细胞仪检测CD34+细胞 见图2，3。流式细胞仪测定扩增培养前后CD34+细胞数显示猪苓多糖扩增6.33倍（P < 0.01）。扩增前CD34+细胞数（3.00±1.00）× 106 L－1，扩增后CD34+细胞数（19.00±1.00）×106 L-1。

2.4 小鼠生存状况 实验过程中死亡小鼠无严重感染及其它特异性排斥反应症状，解剖所见黏膜无充血水肿，腹腔脏器亦无明显肿大等病理表现，肝、脾颜色大小适中。移植药物组小鼠15只，死亡3只，死亡率20%，死亡高峰集中在照射移植后7~14 d左右。正常组小鼠6只无一死亡；照射空白小鼠6只全部死亡；照射药物组小鼠15只，死亡9只，死亡率60%；照射移植组小鼠15只，死亡5只，死亡率33.3%。各组间死亡率差别有统计学意义（P < 0.05）。
2.5 小鼠红细胞、白细胞、血小板检测 移植药物组与正常小鼠组红细胞（见表2）、白细胞（见表3）、血小板（见表4）水平相当或恢复时间明显短于其他实验组 （P < 0.05）。移植药物组与照射移植组小鼠血象均恢复正常，然而，移植药物组小鼠血象在第1周即恢复正常，明显快于照射移植组小鼠，见图4。照射移植组白细胞在四周内回升至正常小鼠水平，照射移植组白细胞虽有回升，但仍低于正常水平，照射药物组小鼠白细胞则维持在一个较低的水平，见图5。移植药物组血小板恢复较快，照射移植次之，照射药物组恢复不明显，且处于一个较低水平，见图6。
2.6 流式细胞仪检测CD3、CD4、CD8、CD19 见表5。

移植药物组小鼠各项指标水平与正常小鼠无差别（P > 0.05）；而与其他各组小鼠比较，除CD4、CD19水平与照射移植小鼠无差别，均有差别(P < 0.05）。

3 讨论

本文以CD34作为脐血造血干细胞较特异表面标志作为扩增检测指标[6]，结果表明，猪苓多糖能够有效扩增脐血造血干细胞，CD34+细胞扩增倍数为6.33。此扩增效率虽不及细胞因子构建扩增体系及同类研究药物壳聚糖[7-10]，但也为其体内研究及应用奠定了基础。天然药物的调控机制复杂，或以类细胞因子的方式发挥作用，或调控细胞的某些生物学特性，抑或与药物本身的结构有着密不可分的关系，因此，何种药物扩增效率最好，调控效果最佳，如何筛选药物，还有待更多更大量的相关研究加以总结,本文即是一种初探。
猪苓多糖应用于体内能更有效的促进脐血造血干细胞移植免疫缺陷小鼠的免疫及造血恢复。其作为免疫增强剂在临床已有应用，猪苓多糖免疫调节、抗肿瘤[11]、抗辐射[12]、减轻放化疗药物所致的毒副反应等药理效应已得到证实。如聂红等[13]研究了复方猪苓多糖对小鼠免疫功能的调节。本文体内研究证实猪苓多糖对脐血造血干细胞移植小鼠免疫及造血重建，无论在时间上还是在效果上均优于单纯移植小鼠，其中生存率、血象恢复时间及水平，CD3、CD4、CD8、CD19水平都显示出明显的差异。
人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内，其理论基础是经放射线照射使小鼠骨髓枯竭，龛位腾出，为移植的脐血造血干细胞提供空间，小鼠的造血微环境又可支持人造血干细胞的生长、分化、短期内人髓系和淋巴系祖细胞从而获得繁殖[14]。本文所用该模型与致死量制备动物模型相比具有良好的抑制移植排斥反应作用[15-16]，实验条件相对容易控制，在各项指标的检测中也显示出其作为一种研究工具的可靠性，另外，亦避免了化疗药物所致免疫系统毁损的不完全[17]。

4 参考文献

1 Gluckman E，BroxmeyerHE，Auerbach AD，et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.N Engl J Med 1989；321（17）: 1174
2 Bomstein R，Flores AI，Montalban MA，et al.Modified cord blood collection method achieves sufficient cell levels for transplantation in nmst aduh patients.Stem Cell 2005；23：324-334
3 Jing LY，Liu LM.Shequ Yixue Zazhi2004；2（4）：29-30
荆丽艳, 刘令梅.辐射防护药物的研究现状[J].社区医学杂志，2004，2(4): 29 -30
4 Rice AM, Wood JA, Milross CG, et al. Conditions that enable human hematopoietic stem cell engraftment in all NOD-SCID mice.Transplantation 2000；69(5):927-935
5 Du XN，Wang RT，Liu DW，et al.Zhonghua Weishengwuxue Yu Mianyixue Zazhi 2001;21(3):296-297
杜肖娜, 王润田, 刘殿武，等.中药猪苓多糖抑瘤作用机理的初探[J].中华微生物学和免疫学杂志，2001, 21(3):296-297
6 Zhang ZQ,Gao SZ,Liu XP,et al.Jichu Yixue Yu Linchuang 2004;24(3):310-313
张子强，高顺宗，刘雪平,等.G-CSF动员自体造血干细胞在大鼠MCAO/R模型分化为神经元样细胞[J].基础医学与临床,2004,24（3）：310-313
7 Flores-Guzmán P, Gutiérrez-Rodríguez M, Mayani H.In vitro proliferation, expansion, and differentiation of a CD34+ cell-enriched hematopoietic cell population from human umbilical cord blood in response to recombinant cytokines.Arch Med Res 2002；33(2)：107-114
8 Yao CL，Chu IM，Hsleh TB，et a1.A systematic strategy t0 0Dtimize exvivo expansion medium for human hematopoietic stem cells derived from umbilical cord blood mononuclear cells. Exp Hematol 2004；32(8)：720-727
9 Gilmore GL，DePasquale DK，Lister J，et aL.Ex vivo expansion of human umbilical cord blood and peripheral blood CD34 hematopoietic stem cells.Exp Hematol 2000；28(11)：1297-1305
10 Zhao FQ,Luo SB,Luo HY,et al.Fushe Fanghu 2007;27(1):25-31
赵粉琴，罗树彬，罗慧英,等.壳聚糖协同脐血造血干细胞对小鼠的免疫恢复研究[J].辐射防护,2007,27(1):25-31
11 Hhuang DN,Hou G,Zhu QF.Zhongxiyi Jiehe Xuebao 2004;2(5):350-352
黄迪南，侯敢,祝其锋.猪苓多糖对小鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶活性及mRNA表达的影响[J].中西医结合学报，2004，2(5)：350-352
12 Hu MB.Hubei Yike Daxue Xuebao 1996;17(1):27
胡名柏.猪苓多糖对受辐射损伤的大鼠造血功能及免疫功能的影响[J].湖北医科大学学报, 1996, 17(1)：27
13 Nie H,Xu ZS.Xibao Yu Fenzi Mianyixue Zazhi 2000;16(5):384-386
聂红，许周善.复方猪苓多糖对小鼠免疫功能的调节[J].细胞与分子免疫学杂志，2000，16(5)：384-386
14 Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A，et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N EngI J Med 1998； 339(22):1566-1577
15 Hu XB,Xu WR,Zhang XR,et al.Linchuang Jianyan Zazhi 2004;22(1):6-8
胡嘉波，许文荣，张锡然,等.脐血造血干/祖细胞体外扩增及移植动物模型分析[J].临床检验杂志,2004，22（1）：6-8
16 Wang MJ,Yang CL,Fu RY,et al.Sichuang Yixue 2002;23(8):831-833
王嵋景，杨崇礼，符仁义,等.人脐血干细胞对裸小鼠移植的实验研究[J].四川医学,2002，23（8）：831-833
17 Xu HG,Fang JP,Huang SL,et al.Zhongshan Yike Dxue Xuebao 2002;23(6):414-418
徐宏贵，方建培，黄绍良，等.环磷酰胺预处理脐血移植小鼠模型的建立及其对骨髓龛位的影响[J].中山医科大学学报,2002，23（6）：414-418