骨髓基质干细胞和神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的效果比较**☆

顾平1,2，王坤1,2，王彦永1,2，王铭维1,2，崔冬生1，耿媛1

课题背景：课题受国家自然科学基金与河北省自然科学基金资助，项目编号分别为30400138、C2004000583，目前河北省自然科学基金已结题，并取得河北省科技成果三等奖。课题前期研究发现骨髓基质干细胞可诱导新生大鼠神经干细胞分化为高比例的神经元，并促进神经元的存活，机制在于其分泌至细胞外的可溶性物质。

偏倚或不足：①细胞移植后连续观察了8周行为学变化，但是形态学只观察了移植后第8周的脑组织化学表现，还可以选移植后2，4，6，8周时间点分别取脑切片做免疫组织化学荧光染色，从而更细致地观察移植入脑的细胞的存活、分化及迁移情况。②如果条件允许，可以在对脑纹状体区石蜡切片进行免疫组织化学荧光染色后，用激光扫描共聚焦显微镜对其进行细胞计数分析，更详细地分析移植入脑的细胞在脑内存活及分化比例。

术语解析：酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成途径的关键酶，帕金森病是由于黑质纹状体多巴胺严重不足导致的一种神经变性疾病，酪氨酸羟化酶主导的多巴胺代谢调节在帕金森发生发展和治疗中起着重要作用。

1中日友好医院骨科，北京市 100029；2北京大学第三医院骨科，北京市 100083
1河北省脑老化与认知神经科学实验室，河北省石家庄市 050031； 2河北医科大学第一医院神经内科，河北省石家庄市 050031

顾平☆，女，1970年生，江苏省省无锡市人，汉族，1993年河北医科大学毕业，博士，副教授，硕士生导师，主要从事干细胞分化及移植治疗神经系统退行性疾病方面的研究。
wk9703820821@
126.com

通讯作者：王铭维，博士，教授，博士生导师，河北省脑老化与认知神经科学实验室，河北省石家庄市 050031；河北医科大学第一医院，河北省石家庄市 050031

国家自然科学基金（30400138）*；河北省自然科学基金（C200
4000583）*

摘要
目的:目前对应用神经干细胞和骨髓基质干细胞移植治疗帕金森病效果进行对比的研究很少，实验观察比较同种异体来源的中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞对帕金森大鼠行为学及损伤脑组织形态学的影响。
方法：实验于2006-03/2007-09在河北医科大学第一医院脑老化与认知神经科学实验室完成。SD大鼠麻醉后建立右侧帕金森病模型，随机分为神经干细胞组14只、骨髓基质干细胞组10只、空白对照组10只。选取右侧纹状体2个坐标点（in mm: A +0.6；R +4.0；V -5.0）、（in mm: A -0.7；R +3.0；V -5.0），前两组每个坐标点分别注入经Brd-U标记的神经干细胞悬液、骨髓基质干细胞悬液5 μL，约1×106个细胞，空白对照组注射等量磷酸盐缓冲液。细胞移植后各组大鼠腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转。
结果：①行为学改变：与空白对照组比较，移植2~8周神经干细胞组和骨髓基质干细胞组大鼠的旋转次数均明显减少（P < 0.01）。②纹状体切片免疫组织化学荧光染色鉴定：移植8周后，神经干细胞组和骨髓基质干细胞组均可见一定数量双标的神经元、星形胶质细胞和酪氨酸羟化酶阳性细胞，且后者的双标细胞相对多于前者。空白对照组未发现Brd-U阳性细胞、微管相关蛋白2阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞的表达。各组损毁侧黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞残存率基本相似（P > 0.05）。
结论：神经干细胞和骨髓基质干细胞移植均可改善帕金森病大鼠的旋转行为，且至少在脑内存活8周，并可分化成神经元、星形胶质细胞和多巴胺能神经元。
关键词：骨髓基质干细胞；神经干细胞；移植；帕金森病

顾平，王坤，王彦永，王铭维，崔冬生，耿媛.骨髓基质干细胞和神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的效果比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2221-2226 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2221(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:A
文章编号:1673-8225
(2008)12-02221-06

Comparison of neural stem cell and bone marrow stromal cell transplantation in treating Parkinson disease rats

AIM:Few researches are conducted to compare the therapy between neural stem cell (NSC) and bone marrow stromal cell (BMSC) transplantation for Parkinson disease. In this study, we compared the effect of allogenic intracerebral NSCs and BMSCs on the behavioral and histomorphological changes of rats with Parkinson disease.
METHODS: The experiment was performed at the Brain Ageing and Cognitive Neuroscience Laboratory, First Hospital of Hebei Medical University from March 2006 to September 2007. Models of Parkinson disease at right side were established in adult healthy female SD rats under anesthesia, and then were randomly divided into NSC group (n=14), BMSC group (n=10), and control group (n=10). Two coordinate points were oriented in the right striatum (in mm: A +0.6; R +4.0; V -5.0) and (in mm: A -0.7; R +3.0; V -5.0). NSC suspension (1×106/μL, 5 μL) and BMSC suspension (1×106/μL, 5 μL) labeled by Brd-U were injected stereotaxically into the right striatum of NSC and BMSC groups, respectively, while the control group was injected with the same dose of phosphate buffer solution. Apomorphine (APO) -induced rotation behavior was observed after transplantation.
RESULTS: ①Behavioral changes: Compared with control group, the APO-induced rotation times of rats in NSC group and BMSC group decreased significantly from 2nd to 8th week after transplantation (P < 0.01). ②Immunohistochemistry and immunofluoresence identification: Some double straining neurons, astrocytes and tyrosine hydroxylase-immunoreactive (TH-IR) cells were seen in striatum of NSC group and BMSC group 8 weeks after transplantation, and the double positive cells of BMSC group were more than that of NSC group. There was no expression of Brd-U-positive cell, microtubule-associated protein-2-positive cell and TH-IR cell in control group. The survival rates of TH-IR cells in the substantia nigra of lesion side in three groups were basically similar (P > 0.05).
CONCLUSION: The APO-induced rotations are significantly improved after transplantation of NSCs and BMSCs. The transplanted NSCs and BMSCs could survive at least 8 weeks and differentiate into neurons, astrocytes, dopaminergic neurons in the brain of rats.

Gu P, Wang K, Wang YY, Wang MW, Cui DS, Geng Y.Comparison of neural stem cell and bone marrow stromal cell transplantation in treating Parkinson disease rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2221-2226
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2221(ps).pdf]

帕金森病是一种常见的慢性神经系统变性疾病,以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死和纹状体区多巴胺水平减少为主要病理特点[1]。中国帕金森病患者已超过200万，65岁以上人群患病率高达2%，严重威胁着老年人的身体健康和生活质量[2]。左旋多巴能有效缓解帕金森病的症状，但长期服用后药效下降并且会出现各种运动障碍。
目前，细胞替代疗法正成为帕金森病治疗研究的热点，其中神经干细胞由于其移植治疗帕金森病的潜能而引起了更多的关注[3]。从2000年Woodbury等[4]首次证实骨髓基质干细胞可在体外向神经元方向诱导分化后，骨髓基质干细胞已用于帕金森病、脑卒中和中枢神经退行性疾病等的治疗研究[5-8]。近年对应用神经干细胞和骨髓基质干细胞移植治疗帕金森病的研究很多，但少有将两种细胞移植效果进行比较的。本实验将同种异体来源的中脑神经干细胞和骨髓基质干细胞在体外扩增培养后，立体定向移植到帕金森病大鼠的纹状体，观察帕金森病大鼠的行为学变化以及组织形态学的改变，比较神经干细胞和骨髓基质干细胞疗效的异同，以探讨哪种细胞更具有治疗帕金森病的临床可行性。

设计：随机对照动物实验。
单位：河北省脑老化与认知神经科学实验室，河北医科大学第一医院神经内科。
材料：实验于2006-03/2007-09在河北医科大学第一医院脑老化与认知神经科学实验室完成。封闭群清洁级成年雌性SD大鼠和SD新生鼠（均由河北医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：705168），体质量（220±10）g，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。SR-6N大鼠脑立体定向仪为日本Narishige公司产品。石蜡切片机为德国Leica公司产品。6-羟基多巴胺、阿朴吗啡、碱性成纤维细胞生长因子、Brd-U和Brd-U小鼠单克隆抗体均购于美国Sigma公司。维生素C、水合氯醛购于晶美公司。B27添加剂、DMEM/ F12 ( 1∶1)、Neurobasal和DMEM培养液购于Gibco公司。胎牛血清为杭州四季青公司产品。Nestin兔单克隆抗体和微管相关蛋白2兔单克隆抗体购于Santa Cruz公司。胶质原纤维酸性蛋白兔单克隆抗体购于NeuMarker公司。酪氨酸羟化酶兔单克隆抗体购于 Chemicon公司。山羊抗小鼠IgG/FITC、山羊抗兔IgG/TRITC、DAB显色试剂盒和过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptaidin/Peroxidase）染色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
设计、实施、评估者：由第一、二、三作者设计，第二、三、六作者进行实施，第四、五作者负责评估，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
帕金森病动物模型的制作及分组：成年SD大鼠经10％水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后，借助脑立体定位仪并参照文后参考文献[9]，选取右侧黑质致密部(SNc)坐标为（in mm: A +4.4；R+1.2；V-7.8），中脑腹侧被盖(VTA)坐标为（in mm: A +4.8；R +1.0；V-7.8），向两点各注射4 mg/L 6-羟基多巴胺2 μL，注射速度1μL/min，留针 10 min，缓慢退针，术后用牙科乳胶覆盖钻孔，并连续1周腹腔注射青霉素3万U/d以预防感染。

术后第14，21天腹腔注射阿朴吗啡0.5 mg/kg，记录其行为学变化，将第21天平均转速大于7 r/min的大鼠视为造模成功，随机数字表法分为神经干细胞组14只、骨髓基质干细胞组10只、空白对照组10只。
中脑神经干细胞的分离培养和收集：取SD新生鼠，中脑剥离脑膜后将组织剪碎，用火焰刨光的玻璃吸管机械分离制成单细胞悬液。以5×107 L-1密度种植于25 mL培养瓶中，加入含2%B27、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMFM/F12(1∶1)培养基，置于37℃、5%CO2/95%O2孵箱中孵育，此后每3 d换液1次，每六七天传代1次，传代时采用机械分离法，培养液同前。传至第3代时，用含Brd-U （1 mL/L）的培养液培养24 h，将神经干细胞收集于离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2次，收集于离心管中，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液重悬，刨光的玻璃吸管反复吹打，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×1011 L-1，移植备用。
骨髓基质干细胞的分离培养和收集：SD大鼠以10%水合氯醛麻醉致死，75%乙醇浸泡10 min，无菌条件下取出大鼠的股骨和胫骨，剪去骨的两端，用磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔两三次，将洗出的细胞悬液移入离心管，800 r/min离心5 min。将细胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM悬浮，接种于培养瓶内，将培养瓶置于37 ℃、5% CO2/95% O2中孵育。待培养七八天细胞长满瓶底时进行细胞传代，此时细胞呈长梭形。传至第3代时，用含Brd-U（1 mL/L）的培养液培养24 h，将骨髓基质干细胞用0.25%胰酶消化后收集于离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清，用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤2次，收集于离心管中，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液重悬，刨光的玻璃吸管反复吹打，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×1011 L-1，移植备用。
细胞移植：神经干细胞组大鼠经10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后固定于脑立体定位仪，参照文后参考文献[8]选取右侧纹状体2个坐标点（in mm: A +0.6；R+4.0；V -5.0）、（in mm: A -0.7；R +3.0；V -5.0），各注入制备的神经干细胞悬液5μL（即每只鼠共移植约1×106个细胞），注射速度为1 μL/min ，留针10 min，缓慢退针，术后用牙科乳胶覆盖钻孔，并连续1周腹腔注射青霉素3万U/d预防感染。骨髓基质干细胞组同法注入骨髓基质干细胞悬液5μL，空白对照组注入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液5μL。
行为学检测：分别于细胞移植后1~8周各组大鼠腹腔注射阿朴吗啡0.5 mg/kg诱导旋转，连续观察并记录大鼠每分钟内的旋转次数。
免疫组织化学荧光染色：细胞移植后第8周，将各组大鼠用4%多聚甲醛灌注固定，取脑做连续冠状石蜡切片，片厚5μm，依据实验目的对纹状体移植区脑片进行4种双标。由于移植细胞中含有Brd-U，用抗Brd-U异硫氰酸荧光素(FITC)结合的IgG可进行免疫标记。另外所用一级抗体分别为nestin抗体、胶质原纤维酸性蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体和酪氨酸羟化酶抗体进行免疫双标，依据一抗的动物来源，分别用相应的罗丹明结合的IgG进行结合反应。用荧光显微镜观察脑切片。同时黑质区脑切片做酪氨酸羟化酶免疫组化，并进行酪氨酸羟化酶阳性细胞(TH-IR)计数。方法如下：每只大鼠中脑黑质区做连续冠状石蜡切片，隔10片取1片，计数两侧黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞数，黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞残存率（%）=损毁侧黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞／对侧黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞×100%。
主要观察指标：①帕金森病大鼠行为学改变。②免疫组织化学荧光染色结果。
统计学方法：由第二作者采用SPSS 12.0软件包进行统计学处理，数据均以_x±s表示，动物旋转次数和酪氨酸羟化酶阳性细胞数比较行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 帕金森病大鼠行为学改变与细胞移植前比较，阿朴吗啡诱导2~8周神经干细胞组和骨髓基质干细胞组大鼠的旋转次数均明显减少（P < 0.05），空白对照组无明显变化（P > 0.05）。与空白对照组比较，阿朴吗啡诱导2~8周神经干细胞组和骨髓基质干细胞组大鼠的旋转次数均明显减少（P < 0.01），此两组间各时间点比较差异无显著性意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 免疫组织化学荧光染色结果
2.2.1 Brd-U免疫组织化学染色及移植细胞迁移细胞移植后8周，神经干细胞组和骨髓基质干细胞组大鼠脑内均有Brd-U阳性细胞的存在，以纹状体移植区居多，表明神经干细胞和骨髓基质干细胞在移植后至少可存活8周，见图1。此外Brd-U阳性细胞沿同侧胼胝体发生迁移，见图2。
2.2.2 免疫组织化学与荧光双标染色细胞移植后8周，神经干细胞组和骨髓基质干细胞组大鼠纹状体脑切片均可见一定数量双标细胞（Brd-U/nestin，Brd-U/GFAP，Brd-U/MAP-2，Brd-U/TH）的存在，说明移植细胞在脑内可以分化为神经元、星形胶质细胞和酪氨酸羟化酶阳性细胞，且骨髓基质干细胞组的双标细胞相对多于神经干细胞组，见图3，4。空白对照组未发现Brd-U阳性细胞、微管相关蛋白2阳性细胞及酪氨酸羟化酶阳性细胞的表达，仅有少量nestin 阳性和胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞表达，见图5。

2.2.3 酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色通过对移植后黑质区酪氨酸羟化酶阳性细胞的定量分析可发现，各组损毁侧黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞数均有所减少，组间黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞残存率基本相似 (P > 0.05)，见图6。

细胞移植治疗帕金森病的临床策略现在主要集中在对纹状体的神经重支配和基底节区环路重新建立上。目前用于移植的供体细胞可分为两类：神经细胞和非神经细胞。20世纪80年代初人们首次通过骨髓培养发现，除造血干细胞外的另外一类细胞，被称为骨髓基质干细胞，是中胚层发育的早期细胞，这类细胞可以在一定的环境和条件下可分化为多种造血以外的组织，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经胶质细胞和神经细胞等[10-12]。自1992年Reynold等[13]从成年小鼠纹状体分离出能自我更新和具有多分化潜能的神经干细胞以来，有研究发现外源性的神经干细胞植入脑内后，可在脑内特定的微环境的作用下存活并分化成神经元且与宿主细胞发生整合，甚至于有功能方面的恢复[14-15]，但困难在于很难获得足够数量的外源神经干细胞以满足疾病治疗的需要。近年来，对应用神经干细胞和骨髓基质干细胞移植治疗帕金森病的研究有很多，但少有将两种细胞进行比较研究的。

本实验将Brd-U标记的神经干细胞和骨髓基质干细胞分别通过立体定向移植至帕金森病大鼠损毁侧纹状体中，在移植后1-8周时间点分别观察阿朴吗啡诱导的旋转行为，发现这两组阿朴吗啡诱导的旋转次数从第2周开始明显少于空白对照组，在行为学上均有明显改善，这与国内外类似的研究报道结果是一致的[6,16-18]；而这两组间并无明显统计学差异。叶民等[18]研究发现移植骨髓基质干细胞的脑组织切片中有少量Brd-U/nestin、Brd-U/GFAP和Brd-U/NSE双标的细胞存在，但未发现有明显的Brd-U/TH双标细胞的存在。在本实验中，细胞移植8周后取脑组织做石蜡切片通过免疫组化方法观察发现神经干细胞移植组和骨髓基质干细胞移植组在纹状体移植区均有部分Brd-U/nestin、Brd-U/GFAP、Brd-U/MAP-2和Brd-U/TH双标细胞存在，说明神经干细胞和骨髓基质干细胞在脑内均可以分化为星形胶质细胞、神经元样细胞和酪氨酸羟化酶阳性细胞，这些细胞整合到局部组织，可能参与了多巴胺神经环路的重建，从而改善了动物的行为学指标。已有研究表明，帕金森病时的病理刺激可以激活黑质区神经干细胞的增殖[19-22]。本实验中观察到在空白对照组也有部分nestin阳性细胞和胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞，但未见到微管相关蛋白2和酪氨酸羟化酶阳性细胞，这可能是移植过程中机械损伤引起自体内源性神经干细胞激活并发生分化所致，但由于其脑内微环境的限制及其细胞数量的缺乏而未能改善动物的行为学指标。同时发现移植入脑的细胞大部分在毁损侧纹状体内散在分布，部分细胞可以沿胼胝体发生迁移，这与国内外类似的研究报道结果是一致的[18,23]。另有学者研究发现，移植到脑内的细胞可扩散至纹状体、胼胝体、大脑皮质、黑质、嗅球及小脑等多种脑组织[24-26]。出现上述差异的原因可能为：①观察时间点的选择，选择移植后8周作为观察时间点，而其他学者最长选择6个月为观察时间点。②移植细胞的数量和种类也存在差异。③实验动物的选择也有差异。以上结果证实神经干细胞和骨髓基质干细胞在帕金森病脑的环境内可以存活至少8周并发生分化和迁移，且可以显著改善帕金森病大鼠的行为学症状，说明神经干细胞和骨髓基质干细胞均可以作为帕金森病细胞替代疗法的有效载体。
在本课题前期研究结果发现：①骨髓基质干细胞可诱导新生大鼠中脑神经干细胞分化为高比例的神经元。②骨髓基质干细胞对神经干细胞分化的神经元有明显的促存活作用。③骨髓基质干细胞对神经干细胞分化的调节作用源于其分泌至细胞外的可溶性物质构建的微环境。④骨髓基质干细胞分泌至细胞外的可溶性物质对神经干细胞分化的调节作用无脑区特异性。⑤骨髓基质干细胞分泌至细胞外的可溶性物质可诱导中脑神经干细胞分化为具有电兴奋性和突触形成能力的神经元。⑥骨髓基质干细胞分泌至细胞外的可溶性物质可调节神经干细胞分化的神经元的表型，可诱导中脑神经干细胞分化为高比例的多巴胺神经元，并且分化的多巴胺神经元具有维持多巴胺转运的功能[27-31]，这些结果表明骨髓基质干细胞分泌至细胞外的可溶性物质确实具有促神经干细胞存活和分化的能力[32]。在本实验中，骨髓基质干细胞组移植后在脑纹状体内分化为酪氨酸羟化酶阳性细胞的数量相对多于神经干细胞组，而对照组未发现有明显的酪氨酸羟化酶阳性细胞，其机制可能为：一是骨髓基质干细胞自身可以向神经元甚至酪氨酸羟化酶阳性神经元分化，并与局部组织整合，来行使细胞替代功能；二是骨髓基质干细胞分泌的可溶性物质为局部脑组织中的神经干细胞提供了促其分化的微环境，促使内源性神经干细胞的激活并向神经元分化。
而鉴于神经干细胞在临床上较难获得且在伦理学上存在一定的问题，而骨髓基质干细胞可以作为同种同体来源细胞，较易获得且不存在伦理问题；作为移植供体细胞骨髓基质干细胞和神经干细胞同样具有以下特性：①可以在体外迅速扩增。②无或低免疫原性。③能够在宿主脑内长期存活并与宿主神经元整合形成突触联系。④可以发生稳定的分化并长期表达外生性基因例如酪氨酸羟化酶。此外，骨髓基质干细胞对神经干细胞还有着明确的促存活和分化的能力[27]。骨髓基质干细胞较神经干细胞更具临床优势，有可能作为自体细胞应用于组织工程和作为良好的移植细胞应用于替代治疗。

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