课题背景：课题受国家自然科学基金资助,是骨髓干细胞移植治疗心肌梗死系列研究的一部分,目前在以下一系列研究中取得了一定的进展：骨髓动员剂动员骨髓干细胞治疗心肌梗死的研究，骨髓干细胞移植后的形态学改变，不同时期骨髓干细胞移植后的心脏功能改变。下一步将就骨髓干细胞在不同心室压力下移植对心肌梗死后心功能改变的影响进行深入研究。

应用要点：①实验证明骨髓干细胞被移植到心肌梗死部位后能够在该部位存活，并可以特异性的分化为心肌细胞，有效改善心功能。②干细胞移植时机很重要，将直接影响到干细胞移植的治疗效果，心肌梗死后2周左右进行骨髓干细胞移植是比较合适的。

偏倚或不足：①实验以兔作为动物模型，其急性炎症反应的时间要比大动物的时间短一些，因此人类和大动物心肌梗死后移植骨髓干细胞的最佳时间是否也是在2周左右还需要进一步分析究。②骨髓干细胞数量的多少是否会对移植效果产生影响，即是否存在量效依赖性关系还需进行系统研究。

解放军北京军区总医院心肺中心一区，北京市 100700

陆 龙★，男，1974年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，东南大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事心脏外科方面的的研究。
bjjsfz@126.com

国家自然科学基金（30471717）*

摘要
目的:心肌梗死发生后心肌组织将经历炎症反应、心肌纤维化等复杂病理过程，在此期间移植的骨髓干细胞其分化及存活情况均会受到影响。
目的：实验选择兔心肌梗死后不同时间点行自体骨髓干细胞移植，通过心脏病变区域组织学变化分析最佳移植时机。
设计、时间及地点：随机对照细胞观察，于2005-06/2006-04在东南大学试验动物中心完成。
材料：清洁级雄性青紫蓝兔36只，随机分成细胞移植组、模型对照组，每组又设立造模后即刻、造模后2周、造模后4周3个亚组，6只/时间点。
方法：两组兔均采用液氮冷冻法建立心肌梗死模型。细胞移植组自双侧髂骨抽取骨髓，FICOLL法分离骨髓单个核细胞，加入5-氮杂胞苷予以诱导，移植前行Brdu标记，分别于造模后即刻、2周、4周在心肌梗死部位与正常心肌交界处分4点注入制备好的骨髓干细胞悬液，细胞总数1.0×107个。模型对照组按同样方式于对应时间点注入等量DMEM培养液。
主要观察指标：移植后4周心肌组织病理学变化。
结果：免疫组织化学染色结果显示，造模后2周、4周细胞移植组均可见Brdu标记细胞，造模后即刻细胞移植组呈阴性。苏木精-伊红染色结果显示，造模后2周细胞移植组出现心肌样细胞，造模后即刻、4周细胞移植组均呈阴性。模型对照组于各时间点仅观察到瘢痕、纤维组织的出现，未见特异性结构。
结论：兔心肌梗死后第2周是比较适宜的移植时机，植入后的自体骨髓干细胞可向心肌样细胞方向分化。
关键词：骨髓干细胞；自体；移植；心肌梗死

陆龙，姚建民，马凤霞.兔心肌梗死后自体骨髓干细胞移植时机的确立[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2227-2230 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2227(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02227-04

收稿日期：2007-10-20
修回日期：2008-03-24
(07-50-10-5713/ZS·Q

Optimal time of autologous bone marrow stem cell transplantation in rabbits after myocardial infarction

Abstract

AIM:After myocardial infarction, inflammatory reaction and myocardial fibrosis can be detected in myocardium. During this process, differentiation and survival of transplanted bone marrow stem cells can be affected.
OBJECTIVE: To study the optimal time for bone marrow stem cell transplantation in rabbits after myocardial infarction by analyzing histological changes in cardiac lesion region.
DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized control cell investigation was performed at the Experimental Animal Center of Central South University from June 2005 to April 2006.
MATERIALS: Totally 36 clean male pigmented rabbits were divided into model control group and cell transplantation group. Each group was divided into 3 subgroups according to time points (immediately, 2 weeks and 4 weeks after establishing models), 6 rabbits in each time point.
METHODS: Rabbit models of myocardial infarction were established by liquid nitrogen frozen in both groups. Bone marrow was extracted from bilateral iliac bone in the cell transplantation group. Mononuclear cells were harvested from bone marrow by FICOLL method, induced by 5-aza and labeled by Brdu. Subsequently, bone marrow stem cell suspension (number of cells 1.0×107) was injected into the juncture between infracted region and normal myocardium at 4 points immediately, 2 weeks and 4 weeks after establishing models. Using the same methods, DMEM of the same volume was injected into rabbits of the model control group at the corresponding time points.
MAIN OUTCOME MEASURE: Pathological changes in myocardium 4 weeks after transplantation.
RESULTS: Immunohistochemical staining demonstrated that Brdu-labeled cells were detected in the cell transplantation group 2 weeks and 4 weeks after establishing models, whereas Brdu-labeled cells were negative in the cell transplantation group immediately after establishing models. Hematoxylin and eosin staining confirmed that myocardium-like cells were found in the cell transplantation group 2 weeks after establishing models, whereas negative in the cell transplantation group immediately and 4 weeks after establishing models. Only scar and fibrous tissues were detected, but no specific structure was presented in the model control group at each time point.
CONCLUSION: The optimal time for bone marrow cell transplantation is at week 2 after myocardial infarction in rabbit models. Autologous bone marrow stem cells can differentiate into myocardium-like cells after transplantation.

Lu L, Yao JM, Ma FX.Optimal time of autologous bone marrow stem cell transplantation in rabbits after myocardial infarction.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2227-2230(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2227(ps).pdf]

0 引言

骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的研究主要集中在以下几个方面：①骨髓干细胞移植改善心肌功能机制的研究。②提高干细胞分化效率及移植后存活率的研究。③骨髓干细胞移植途径的研究。④骨髓干细胞移植最佳时机的研究。⑤骨髓干细胞移植改善心脏功能机制的研究。本实验着眼于选择性地在心肌梗死后的不同时机、不同病理变化时期将自体骨髓干细胞移植于心脏病变区域，分析骨髓干细胞移植的最佳时机。

1 材料和方法

设计：随机对照细胞观察。
时间及地点：实验于2005-06/2006-04在东南大学试验动物中心完成。
材料：清洁级雄性青紫蓝兔36只（由东南大学医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SYXK军2005-2007），20周龄，体质量2.2~2.8 kg，随机分为细胞移植组、模型对照组，每组又设立造模后即刻、造模后2周、造模后4周3个亚组，6只/时间点，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。血球记数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)；DMX1200型显微镜数码摄象机系统（NIKON日本）；LXJ-Ⅱ离心沉淀机(涟水电讯电机厂)；呼吸机（Evita 4，德国Drager公司）； GBB16 CO2细胞培养箱(上海跃进医疗器械厂)；Feicoll淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司)；BrdU (SIGMA公司)；抗BrdU (NEO MAKERS公司)；5-aza(SIGMA公司)。
方法：
兔心肌梗死模型的建立：两组兔均造模，切开气管，将气管插管一端插入2.0~2.5 cm，另一端与呼吸机相连。呼吸频率为30次/min，潮气量15~20 mL/kg体质量，呼气时间：吸气时间=1.25∶1。采用正压通气，氧气流量6 L/min。沿左侧第5肋间隙开胸，充分暴露左心室。将直径为0.5 cm的铜棒置于液氮中冷冻后取出，铜棒贴于兔左室前壁约30 s。5 min后再次冷冻 30 s。反复3次，以确保形成透壁心肌梗死。
自体骨髓干细胞的分离培养：细胞移植组每只兔自双侧髂骨分别抽出骨髓2 mL，并用0.7 mL肝素和 1.3 mL生理盐水稀释至4 mL，充分混匀。将骨髓稀释液缓慢注入FICOLL淋巴细胞分离液中，分离3次。离心后骨髓内加入DMEM细胞培养液4 mL、小牛血清1 mL，于37 ℃、95% O2及5% CO2环境中培养。培养3 d后，更换细胞培养液时弃去未贴壁细胞，在新更换的培养液中加入终浓度为10 μmol/L的5-氮杂胞苷，24 h后再次换液弃去5-氮杂胞苷，以后每3 d天换液1次。当细胞长至90%融合后，用0.05%的胰酶消化，以1∶3传代继续培养。培养24~26 d后，待细胞总量长至约1.0×107时，于移植前使用0.05%的胰酶消化，磷酸盐缓冲液反复冲洗、离心2次，最后在细胞中加入磷酸盐缓冲液 1.5 mL制成骨髓干细胞混悬液以备移植时使用。
细胞移植：取各时间点细胞移植组兔，分别于造模后即刻、2周、4周在心肌梗死部位与正常心肌交界处分4点注入制备好的骨髓干细胞悬液，共1.0×107个细胞，在心肌梗死中心部位亦注入一针（0.2×107个细胞）。各模型对照组按同样方式于对应时间点注入等量DMEM培养液。检查无活动性出血后逐层关胸。胸穿抽出胸腔气体，使左肺复张。拔除气管插管后，缝合气管及颈部皮肤。术后给予利多卡因50 mg/只静脉注射，青霉素80万U/只肌肉注射，术后抗炎3 d。
心肌组织病理检测：移植后4周，兔麻醉后取心肌组织制备病理切片。将清洁载玻片浸入10%多聚赖氨酸溶液中浸泡5 min，捞片后放置60 ℃烤箱烤片30~ 60 min，以使切片紧密黏附，防止脱片。石蜡切片脱腊和水化，自来水冲洗后，蒸馏水冲洗一两次，再用磷酸盐缓冲液冲洗3次，3 min/次。除去磷酸盐缓冲液，在每张切片加入100 μL的混匀胰酶试剂，37 ℃孵育15 min，对抗原进行修复。磷酸盐缓冲液冲洗3次，3 min/次。每张切片滴加50μL的过氧化物酶阻断溶液，室温孵育30 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。磷酸盐缓冲液冲洗3次，3 min/次。除去磷酸盐缓冲液，每张切片加一滴或50μL的非免疫性动物血清，室温孵育10 min。除去血清，每张切片加一滴或50μL第一抗体：鼠抗-BrdU抗体，4 ℃过夜。磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次。除去磷酸盐缓冲液，每张切片加一滴或50μL的生物素标记的第2抗体，室温下孵育10 min。磷酸盐缓冲液冲洗3次，3 min/次。除去磷酸盐缓冲液，每张切片加一滴或50μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液。室温孵育10 min。磷酸盐缓冲液冲洗3次，3 min/次。除去磷酸盐缓冲液，每张切片加2滴或100 μL新鲜配制的DAB溶液，室温下染色约3~10 min。自来水冲洗终止DAB染色反应，苏木精轻度复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，磷酸盐缓冲液返蓝。切片经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明1~2 min，中性树胶封固。阴性对照片以磷酸盐缓冲液代替一抗，阳性对照片为大鼠小肠石蜡切片，采用DAB显色，染色结果阳性呈棕黄色。
主要观察指标：心肌梗死后不同时间自体骨髓干细胞移植心脏组织学变化。
设计、实施、评估者：设计为第二作者，实施及评估为第一作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 两组兔均进入结果分析，中途无脱落。
2.2 心肌梗死后不同时间自体骨髓干细胞移植心脏组织学变化检测结果 模型对照组在各时间点仅观察到瘢痕、纤维组织的出现，没有其他特异性结构。造模后即刻、2周、4周细胞移植组的心脏组织学发生了变化。

不同时间经不同染色方法鉴别心脏组织学变化
组别：
造模后即刻细胞移植组○
造模后2周细胞移植组●
造模后4周细胞移植组△

免疫组织化学染色：
未见Brdu标记细胞○
可见Brdu标记的棕黄色细胞●
可见少量Brdu标记细胞△

苏木精-伊红染色：
可见纤维组织形成，无心肌样细胞出现○
可见纤维组织形成，瘢痕区出现心肌样细胞●
可见纤维组织形成，无心肌样细胞出现△

各组切片免疫组织化学染色及苏木精-伊红染色结果见图1~3。

3 讨论

骨髓干细胞是一种多能干细胞，可以向多种方向分化[1-3]。实验证明骨髓干细胞被移植到心肌梗死部位后可以在该部位存活，并可以特异性的分化为心肌细胞，能够形成缝隙连接，可以与宿主心肌细胞共同收缩，增强瘢痕区的弹性，有效地改善心功能[4-6]。实验证明经过骨髓干细胞移植治疗的心肌梗死，其心功能与对照组相比均有明显的改善[7-11]。胞移植治疗心肌梗死的试验中，为提高干细胞分化效率，需要将细胞在体外进行孵化。在此阶段，将5-氮杂胞苷（5-aza）加入孵化液中，可以诱导骨髓干细胞分化为肌肉细胞以及肌管样组织[12]。
心肌梗死发生后心肌组织将经历炎症反应、心肌纤维化等复杂病理过程[13]，在此期间移植的骨髓干细胞其分化及存活率都会受到此病理过程的影响。本实验中，造模后即刻细胞移植组与模型对照组相比，未见有5-溴脱氧尿核苷（Brdu）标记过的细胞。苏木精-伊红染色切片中可以观察到有纤维组织的形成，但并没有观察到有心肌样细胞的出现。这可能是因为心肌梗死形成后的第1个48 h内是急性炎症反应期，在此期间进行细胞移植，植入的骨髓干细胞更多的是参与了炎症反应，而不是参与心肌与血管再生，因而不利于细胞的生长。
在心肌梗死发生后第4周，已经度过了急性炎症反应期，并且心肌梗死区的坏死组织也逐渐被成纤维细胞和纤维组织所替代[14]。由于心肌梗死后瘢痕组织的形成，瘢痕区内部的毛细血管数量减少，瘢痕组织的血液供应也相应的减少。此时在瘢痕内进行骨髓干细胞的移植，似乎并不利于移植后细胞的生长。但骨髓干细胞是一种多能干细胞，不但可以分化为心肌样组织，还可以向成血管细胞方向分化[15-16]。同时，骨髓干细胞还可以分泌多种促进血管再生的因子，在这些成血管细胞和各种促进血管再生的因子的共同作用下，可以有效地促进在缺血的心肌梗死后瘢痕区的内部产生再血管化的效应。在本实验中，可以观察到的在瘢痕区内出现了一些的经5-溴脱氧尿核苷标记过的细胞。但在苏木精-伊红染色的切片中，并没有发现有心肌样细胞的形成。其原因可能是局部血供的减少，导致了各种促使骨髓干细胞转化为心肌细胞的因子无法到达移植的部位，影响了骨髓干细胞的进一步增殖、分化[17-20]。
在心肌梗死模型形成后第2周，已经度过了心肌梗死后的急性炎症反应期。此时心肌梗死区内已没有了急性炎症反应期时的各种活性细胞，也没有了各种细胞活性物质的释放，因而在此时进行骨髓干细胞移植，进入心肌梗死区的骨髓干细胞将不会遭受到炎性细胞以及蛋白水解酶的攻击。另外，在心肌梗死后第2周，虽然已经开始了心肌梗死区的纤维化过程，在心肌梗死区内出现了成纤维细胞以及胶原组织，但这仍处于心肌纤维化的初期。在此时期，成纤维细胞尚不成熟，纤维组织还没有完全充填心肌梗死区，还没有形成成熟的瘢痕，梗死区内仍有瘢痕形成初期时的较多的毛细血管，此时的心脏尚没有心肌重构的出现。在此时期进行骨髓干细胞移植，既避免了急性炎症反应期遭受到炎性细胞以及蛋白水解酶的攻击，也避免了由于瘢痕形成所造的心肌梗死区血供血不足的问题。本实验观察到，造模后2周细胞移植组的免疫组织化学切片中可见5-溴脱氧尿核苷标记过的细胞，而且苏木精-伊红染色病理切片中出现了心肌样细胞，这一现象是造模后即刻与4周细胞移植组都没有的。此外，虽然造模后2周与4周细胞移植组的免疫组织化学切片中均发现有5-溴脱氧尿核苷标记过的细胞，但只有2周组的苏木精-伊红染色病理切片中才有心肌样细胞出现。
在急性炎性反应已经消退、纤维化过程刚刚开始的这一时期，也就心肌梗死后2周左右进行骨髓干细胞移植是比较合适的。

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