神经干细胞移植对老年痴呆模型鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元和学习记忆能力的影响*☆

谷海刚1，龙大宏2，李晓滨1，张贵平3，苏涛4，李佳楣2，冷水龙2

课题背景：课题受广东省自然科学基金项目资助，目前进展顺利，已取得的研究成果包括：①成功从基底前脑培养获得具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞，移植后可对基底前脑神经元产生明显的补充和保护作用。②成功制备了神经生长因子缓释微球，微球所载的神经生长因子在体外或脑内均能够持续释放4周以上。③神经生长因子缓释微球移植入基底前脑，能够保护该区的胆碱能神经元免受隔-海马伞引起的逆行性溃变。

应用要点：老年性痴呆典型的病变部位是基底前脑，特别是神经元的退行性变，除了胆碱能神经元溃变外，GABA能神经元也发生明显的溃变。实验针对某一典型疾病的特定病变部位，来获得用于细胞移植治疗的细胞来源，此外采用经典的老年痴呆模型来观察神经干细胞移植对基底前脑小白蛋白阳性神经元的影响。

偏倚或不足：①实验所用神经干细胞是从原代取材，经传代培养获得，纯度很可能低于神经干细胞系。②若能够做到单细胞克隆，试验结果的可控性会更高一些。③应进一步从分子水平观察神经干细胞移植对小白蛋白阳性神经元的影响。④小白蛋白是一种钙结合蛋白，为GABA能神经元的一个亚型，若能联合其他GABA特征性标志蛋白实验结果将更有说服力。

广州医学院，1组织胚胎学教研室，2解剖学教研室， 3药理学教研室，广东省广州市 510182；4神经科学研究所，广州医学院附属第二医院，广东省广州市 510260

谷海刚☆，男，1976年生，河南省伊川县人，汉族，2007年北京协和医学院（清华大学医学部）毕业，博士，讲师，主要从事神经系统疾病干细胞治疗和新型给药系统方面的研究。guhaigang@
yahoo.com.cn

通讯作者：龙大宏，博士，教授，广州医学院解剖学教研室，广东省广州市 510182
dahonglong88@
yahoo.com.cn

摘要
目的:基底前脑是老年性痴呆患者脑皮质下神经元丢失最严重的区域，实验拟验证经神经干细胞移植治疗后老年痴呆鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的变化以及对其空间学习记忆能力方面的影响。
方法：实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成。①动物：清洁级SD雄性大鼠28只，随机数字表法分为3组：正常对照组8只、模型对照组8只、细胞移植组12只。另取10只新生SD鼠用于神经干细胞的分离培养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：模型对照组、细胞移植组大鼠切断左侧穹隆海马伞，建立老年性痴呆动物模型。利用无血清培养技术获得鼠基底前脑神经干细胞，吸取2.5×1010 L－1细胞悬液4 μL，术后即刻细胞移植组损伤侧行细胞移植，坐标为前囟+0.6 mm，外侧+0.6 mm插入，腹侧-5.5 mm。③实验评估：移植后4周，采用Y型迷宫对各组动物进行学习记忆能力检测。麻醉后取脑制备组织切片，ABC法免疫组化染色结合图像分析观察各组大鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的变化。
结果：①对空间学习记忆能力的影响：细胞移植组空间学习能力、记忆能力均显著高于模型对照组（P < 0.05或P < 0.01），基本达到正常水平（P > 0.05）。②对小白蛋白阳性神经元的影响：与正常对照组比较，模型对照组损伤侧内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元数目分别减少62.5%和30.4%；细胞移植组降低幅度明显小于模型对照组（P < 0.01）。与正常对照组比较，模型对照组损伤侧内侧隔核、斜角带核小白蛋白阳性神经元的面积、周长、灰度均显著降低（P < 0.05或0.01）；细胞移植组上述指标较模型对照组均显著增加（P < 0.05或0.01）。③相关性分析：小白蛋白阳性神经元数目与大鼠在Y型迷宫中的学习次数呈显著负相关（r =-0.76~-0.79，P < 0.01），与记忆能力呈显著正相关（r = 0.78~0.84，P < 0.01）。
结论：神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠基底前脑退变的小白蛋白阳性神经元具有补充和保护作用，并能够明显改善其学习记忆能力，二者呈正性相关。
关键词：神经干细胞；老年性痴呆；小白蛋白阳性神经元；学习；记忆；大鼠

谷海刚，龙大宏，李晓滨，张贵平，苏涛，李佳楣，冷水龙. 神经干细胞移植对老年痴呆模型鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元和学习记忆能力的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2235-2239
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2235(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02235-05

Effect of neural stem cells transplantation on parvalbumin-positive neurons of the basal forebrain and abilities of learning and memory in a rat model of senile dementia

AIM:The loss of neurons is the severest in the basal forebrain of senile dementia patients. This study was aimed to verify the effects of neural stem cells (NSC) transplantation on the parvalbumin (PV)-positive neurons in the basal forebrain and the abilities of leaning and memory in the rat model of senile dementia.
METHODS: This study was done in the Department of Anatomy, Guangzhou Medical College from December 2005 to July 2006.①Animals: SPF class adult male SD rats (n=28) were randomly divided into three groups: normal control group (n =8), model control group (n =8), and NSC group (n =12). Furthermore, new-born SD rats (n =10) were used to isolate and culture NSC. All the manipulations were in accordance with the animal ethnic standard.②Methods: The rats of model group and NSC group were made by left fimbria-fornix transaction. NSCs were obtained from the basal forebrain by using the serum-free culturing. And 4 μL NSC suspension (2.5×1010 L-1) was stereotaxically implanted into the injured lesion (coordinates: anterior-posterior, +0.6 mm; lateral, +0.6 mm; dorsal-ventral, -5.5 mm from bregma) instantly after fimbria-fornix transaction.③Evaluation: Four weeks postoperation, the learning and memory abilities were measured by Y-maze test. Then, the brains were taken out after anesthesia and cut on a microtome. The number of PV-positive neurons in the basal forebrain was analyzed by using ABC immunohistochemical staining method and image analysis.
RESULTS: ①Effects on learning and memory abilities: The abilities in NSC group were significantly higher than that in model control group (P < 0.05 or P < 0.01), and almost reached the normal level (P > 0.05).②Effects on PV-positive neurons: Compared with normal control group, PV-positive neurons in the medial septum (MS) and the vertical limb of the diagonal band of Broca (VDB) in model control group decreased by 62.5% and 30.4%, respectively. The decrease extent in NSC group was distinctly smaller than that in model control group (P < 0.01). The area, circumference, and gray value of PV-positive neurons in MS and VDB of model control group were significantly reduced compared with normal control group (P < 0.05 or P < 0.01). However, all the characteristic parameters in NSC group were significantly increased than those in model control group (P < 0.05 or P < 0.01).③Correlative analysis: The number of PV-positive neurons in MS and VDB was negatively correlated with the times of learning of rats (r=-0.76 to -0.79, P < 0.01) and positively correlated with the ability of memory (r=0.78 to 0.84, P < 0.01), which were measured by Y-maze test.
CONCLUSION: NSC transplantation can supply and protect PV-positive degenerative neurons in the basal forebrain and is effective on improving the abilities of learning and memory in the rat model of senile dementia. The relation of them is positive correlative.

Gu HG, Long DH, Li XB, Zhang GP, Su T, Li JM, Leng SL. Effect of neural stem cells transplantation on parvalbumin-positive neurons of the basal forebrain and abilities of learning and memory in a rat model of senile dementia.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2235-2239(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2235(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02231-04

老年性痴呆是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退变性疾病，并伴有不同程度的运动、认知、语言和人格等多方面的异常。
基底前脑是老年性痴呆脑皮质下神经元丢失最严重区域，该区不仅含有胆碱能神经元，还含有GABA能神经元。基底前脑的神经元沿隔-海马通路与海马相联系，隔-海马通路中主要是以乙酰胆碱和GABA为递质[1]。空间学习记忆能力与隔-海马通路关系密切，手术切断隔-海马通路，出现学习记忆障碍[2-3]。
在发育过程中，自我更新的神经干细胞在中枢神经系统的微环境中能够产生神经元、胶质细胞和少突胶质细胞，甚至有的学者还发现神经干细胞移植到脑内能够分化成神经胶质细胞和某一或几种具体类型的神经元。因此，神经干细胞为细胞移植治疗中枢神经神经系统疾病如老年性痴呆、帕金森病、外伤性脊髓损伤提供了一种有利的手段，它解决了胎脑组织移植治疗这些疾病中遇到的许多技术、理论和道德难题[4-6]。
本实验用神经干细胞移植治疗老年痴呆鼠，观察其对基底前脑小白蛋白阳性神经元和大鼠的空间学习记忆能力的影响。

设计：随机对照动物实验。
单位：广州医学院组织胚胎学教研室、解剖学教研室、药理学教研室，神经科学研究所，广州医学院附属第二医院。
材料：实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成。①实验动物：清洁级12周SD雄性大鼠28只(由广州医学院动物实验研究中心提供，动物质量合格证号：0018788)，体质量250~300 g，雌雄不拘，随机数字表法分为3组：正常对照组8只、模型对照组8只、细胞移植组12只。另取10只新生SD鼠（由中山大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：0008780）用于神经干细胞的分离培养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要试剂与仪器：抗小白蛋白单克隆抗体（1∶2 000，Sigma）；德国KONTRON IBAS 2.0，JVCky-F30B3-CCD彩色图像摄录输入仪。
设计、实施、评估者：设计为第一、二、三作者，干预实施为第一、四、五、六、七作者，结果评估第一、二作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
老年性痴呆动物模型的建立：模型对照组、细胞移植组大鼠造模，用1%戊巴比妥钠40 g/L腹腔注射麻醉后，采用平头颅位固定于立体定位仪上。参照大鼠脑立体定位图谱[5]，以前囟为零点，定出进刀坐标(以刀刃侧为准)，分别为前囟后（AP）1.8 mm，外侧（L）2.5 mm。手术过程分两步：第一步刀尖按坐标前囟 -1.8 mm，外侧+2.5 mm插入，深5.5 mm(即腹侧-5.5 mm)，往上抽动刀片，再往下回到原处，幅度为3 mm，如此上下来回抽20次。第二步把刀尖上升1 mm，内进2 mm，又在此位置再次上下抽动刀片，幅度还是3 mm，来回抽动20次，以保证左侧穹窿-海马伞（FF）外侧缘纤

维被完全切断，然后退刀至外侧2.5 mm，向上抽出刀片。
神经干细胞的分离培养[7]：新生鼠在无菌条件下取脑，分离出基底前脑，置于1.25 g/L胰蛋白酶中消化，37 ℃ 30 min，加10%小牛血清终止消化，用细嘴吸管反复吹打制成细胞悬液，离心；加入D-Hank’s液5 mL，吹打、离心，反复3遍。用含B27的DMEM/F12培养基 6 mL稀释，然后经200目不锈钢筛网过滤使细胞充分分离，成单细胞悬液。取少量悬液样本，加等量4 g/L锥虫蓝吹打3次使其均匀混合，用血球计数板在倒置显微镜下计数活细胞，再将单细胞悬液接种于盛有10 mL含B27的DMEM/F12培养基的50 mL培养瓶中，每瓶40万~ 60万个细胞，加入终浓度均为10 μg/L的表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。培养瓶放入37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。每天镜下观察，待原代克隆形成后机械分离成单细胞悬液，按上述条件继续培养。以后每5~7 d分离克隆传代一次，方法同前。
神经干细胞的移植[8]：老年性痴呆动物模型建立后，细胞移植组大鼠即刻行损伤侧神经干细胞移植。坐标为前囟+0.6 mm，外侧+0.6 mm插入，腹侧-5.5 mm。用10 μL或25 μL的微量注射器吸取2.5×1010 L-1细胞悬液4μL，将注射器固定在立体定位仪上，按选好的坐标进针，细胞悬液在10 min内注射完，留针5 min，最后在10 min内缓慢拔出针头。
学习记忆能力Y型迷宫检测：细胞移植后4周，采用Y型迷宫对各组动物进行空间学习和记忆能力的检测。本实验采用的Y型迷宫由三等分辐射式迷宫箱组成，箱的每支臂顶端装有信号灯，灯光示此臂为安全区。每天分上、下午两个时间段，每个时间段每只大鼠训练10次，待大鼠逃避到安全区的正确率达90%以上为学会标准，记录大鼠达到学会标准的学习次数；24 h后再进行10次检测，记下正确逃避电击次数以衡量其记忆能力。
形态学观察：大鼠用1%戊巴比妥钠按40 g/L体质量腹腔注射麻醉后，开胸经心尖插管至主动脉根部，快速连续灌注生理盐水约250 mL，4 ℃的40 g/L多聚甲醛约300 mL（用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液配置，pH值为7.4）按先快后慢的速度于30~40 min灌注完。迅速开颅取脑，置于4 ℃同样固定液中后固定2~3 h，然后将大鼠脑组织移入体积分数为0.3的蔗糖溶液中置4 ℃冰箱过夜，用恒冷箱切片机作冠状连续切片，片厚 30 μm，每隔3张取1片，按ABC法行抗小白蛋白免疫组化染色，DAB显色1~2 min，染色后进行脱水、透明、封固。
图像分析：①细胞计数：每只大鼠取内侧隔核-斜角带核（SDB）复合体的5个代表平面，在显微镜下计数内侧隔核(MS)和斜角带核(VDB)的小白蛋白阳性细胞数，并算出损伤侧占非损伤侧细胞数的百分比。②形态学参数：每只大鼠取以距离前联合前缘约400 μm的平面为代表平面，用全自动图像分析系统对阳性细胞的面积、周长以及灰度进行定量检测。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 12.0软件包进行统计处理分析，所得实验数据均以_x±s表示，组间比较采用t检验分析，两变量的相关性采用直线相关回归分析。
主要观察指标：①细胞形态观察。②神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠空间学习记忆能力的影响。③神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的影响。④小白蛋白阳性神经元数目与大鼠学习记忆能力的相关性。

2.1 细胞形态观察原代培养2~3 d后细胞明显减少，可见大量的细胞碎片，部分细胞开始分裂，形成数个细胞的团块；5 d后细胞明显增多，细胞团体积增大；1周左右培养瓶中出现许多由数十到数百个细胞组成的悬浮生长的神经干细胞球。
2.2 神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠空间学习记忆能力的影响 Y型迷宫测试结果显示，细胞移植后4周与正常对照组比较，模型对照组大鼠空间学习能力、记忆能力均显著下降（P < 0.05，P < 0.01）。细胞移植组空间学习能力、记忆能力均显著高于模型对照组（P < 0.05，P < 0.01），基本达到正常水平（P > 0.05）。见表1。

2.3 神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的影响正常对照组内侧隔核小白蛋白阳性神经元范围较小，密集地靠近中线，分布密度、细胞大小、免疫反应染色的深浅不尽相同，多数呈梭形或卵圆形，也有多边形；斜角带核小白蛋白阳性神经元分布范围较广，细胞数量较多，分布形态与神经生长因子受体阳性神经元相似，呈“人”形，中间背部的细胞与内侧隔核小白蛋白阳性神经元无明显界限，细胞形态多为中小型的卵圆形或梭形。各组内侧隔核小白蛋白阳性神经元形态学观察见图1，斜角带核小白蛋白阳性神经元形态学观察见图2。

与正常对照组比较，模型对照组损伤侧内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元数目分别减少62.5%和30.4%；细胞移植组分别下降22.5%和14.4%，降低幅度明显小于模型对照组（P < 0.01），小白蛋白阳性神经元得到补充和保护。见表2。

与正常对照组比较，模型对照组损伤侧内侧隔核、斜角带核小白蛋白阳性神经元的面积、周长、灰度均显著降低（P < 0.05或0.01）。细胞移植组上述各项指标均较模型对照组显著增加（P < 0.05或0.01）。见表3。

2.4 小白蛋白阳性神经元数目与大鼠学习记忆能力的相关性分析小白蛋白阳性神经元数目与大鼠在Y型迷宫中的学习次数呈显著负相关（内侧隔核r=-0.76， P < 0.01；斜角带核r=-0.79，P < 0.01），与记忆能力呈显著正相关（内侧隔核r=0.78，P < 0.01；斜角带核r=0.84，P < 0.01）。提示小白蛋白阳性细胞数减少越严重，大鼠的空间学习记忆能力损害越明显。

老年性痴呆大脑神经元丢失严重，有大量中间神经元丢失，其中包括顶叶、颞叶皮层和海马的小白蛋白免疫阳性细胞丢失以及细胞萎缩，不同的脑区、不同的亚群的GABA能神经元对衰老的反应不同，内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元在衰老时明显减少。小白蛋白是一种钙结合蛋白，为GABA能神经元的一个亚型，因此可作为GABA能神经元的标志[9-10]。本实验显示，模型对照组内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元数目明显减少，并且伤侧斜角带核的小白蛋白阳性神经元丢失的程度较内侧隔核轻；细胞体面积及周长显著缩小、细胞灰度含量明显降低。这是因为切断穹窿海马伞同样切断了隔-海马GABA通路，致使内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元也发生逆行性溃变。
神经干细胞能够在体外持续扩增，具有较强的增殖能力和较强的可塑性，能够在成年宿主中枢神经系统中存活、迁移、分化以及与宿主组织整合较好[11-13]。有资料显示，神经干细胞移植到脑内不同部位后，能够根据宿主脑内的微环境分化为不同脑区的神经细胞[14-16]。Modo等[17]将MHP36系神经干细胞移植进行脑内多点移植，移植12周后观察到大约30%的移植细胞分化为神经元，多数细胞迁移到距移植区较远的部位，迁移到隔区和纹状体的细胞与迁移到躯体感觉区的细胞相比有较多的移植细胞分化成神经元；他们还发现移植的细胞不仅可以分化成中间神经元，还可以分为GABA能神经元，表达DARPP-32阳性。用双侧不对称试验、旋转测量法、水迷宫等多种方法检测其行为学疗效，发现治疗鼠的行为学得到了明显的改善。本实验显示源自基底前脑的神经干细胞移植4周后，内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元得到了明显的补充和保护，与模型对照组相比，小白蛋白阳性神经元面积、周长明显增大以及小白蛋白阳性神经元灰度含量明显增多，并且小白蛋白阳性神经元数目明显增加。也就是说移植的神经干细胞对老年性痴呆模型鼠基底前脑退变的小白蛋白阳性神经元具有补充和保护作用。因此本实验中神经干细胞移植入基底前脑不仅能够存活、迁移，还能够分化为小白蛋白阳性神经元[18-19]。
隔-海马通路除了胆碱能神经纤维以外，还有GABA能神经纤维，而这些GABA能神经纤维释放的GABA除了作用于海马非GABA能的锥体细胞及齿状回的颗粒细胞，还作用于海马的GABA能中间神经元，抑制了GABA能中间神经元，即是一种去抑制现象（disinhibition）[20-21]，即GABA与其他神经递质一起参与对学习记忆功能的调节。在基底前脑有GABA能神经元表达NGFmRNA，提示基底前脑的胆碱能神经元不仅受自身所支配的靶区的营养，还受局部GABA能神经元的供养[22-23]。移植的神经干细胞使基底前脑胆碱能神经元数目明显增加，胆碱能神经元和小白蛋白阳性神经元一起使脑内兴奋和抑制功能趋于协调和平衡，从而提高其空间学习记忆能力。隔-海马通路中胆碱能通路与GABA通路一起参与学习记忆活动的调节，补充和保护基底前脑内侧隔核和斜角带核的胆碱能神经元和GABA能神经元是恢复宿主的空间学习记忆能力的重要措施[24]。

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