全骨髓贴壁法获纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化*★

张建富 1，孟庆海1，金澎1，刘广义2

课题背景：2006年山东省自然科学基金资助项目。课题取得了下列研究成果：①通过全骨髓贴壁法获得较纯化的骨髓间充质干细胞，并成功诱导分化为神经干细胞。②实验证实BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）可作为神经干细胞体内示踪的理想标记物。

应用要点：①通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞，获取了较量多数量的细胞，并经过表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后，细胞Nestin、NSE、GFAP表达阳性，表明在适当的条件下骨髓间充质干细胞可以诱导分化出神经干细胞。②为了解决神经干细胞在实验研究中的示踪问题，采用BrdU对神经干细胞进行体外和体内标记，1周后其标记率高达85%以上，说明BrdU标记和检测的准确性高、标记率高，是跟踪监测神经干细胞移植的理想标记物。

相关链接：对神经干细胞的研究近年来许多实验均致力于神经干细胞来源的问题，以期获得一个可靠的获取大量纯化神经干细胞的方法，其中最受关注的是骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞可以来源于自体,并且获取简单，从而克服了许多异体神经干细胞移植的弊端，为神经干细胞治疗带来新的希望。但是要将骨髓间充质干细胞真正应用于临床,仍然存在一些问题：①需要进一步检测从骨髓间充质干细胞分化而来的神经干细胞是否具有神经干细胞的一系列功能。②需要深入了解调控骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化的分子机制等。

1 青岛大学医学院附属医院神经外科，山东省青岛市 266003；2 青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所，山东省青岛市 266003

张建富★，男，1982年生，山东省潍坊市人，汉族，青岛大学医学院在读硕士，主要从事胶质瘤的临床治疗研究。
yanxinzhang1234@yahoo.com.cn

通讯作者：孟庆海，主任医师，硕士生导师，青岛大学医学院附属医院神经外科，山东省青岛市
266003 qhmeng301@
shou.com

摘要
目的:基底前脑是老年性痴呆患者脑皮质下神经元丢失最严重的区域，实验拟验证经神经干细胞移植治疗后老年痴呆鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的变化以及对其空间学习记忆能力方面的影响。
方法：实验于2005-12/2006-07在广州医学院解剖学教研室完成。①动物：清洁级SD雄性大鼠28只，随机数字表法分为3组：正常对照组8只、模型对照组8只、细胞移植组12只。另取10只新生SD鼠用于神经干细胞的分离培养。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：模型对照组、细胞移植组大鼠切断左侧穹隆海马伞，建立老年性痴呆动物模型。利用无血清培养技术获得鼠基底前脑神经干细胞，吸取2.5×1010 L－1细胞悬液4 μL，术后即刻细胞移植组损伤侧行细胞移植，坐标为前囟+0.6 mm，外侧+0.6 mm插入，腹侧-5.5 mm。③实验评估：移植后4周，采用Y型迷宫对各组动物进行学习记忆能力检测。麻醉后取脑制备组织切片，ABC法免疫组化染色结合图像分析观察各组大鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元的变化。
结果：①对空间学习记忆能力的影响：细胞移植组空间学习能力、记忆能力均显著高于模型对照组（P < 0.05或P < 0.01），基本达到正常水平（P > 0.05）。②对小白蛋白阳性神经元的影响：与正常对照组比较，模型对照组损伤侧内侧隔核和斜角带核的小白蛋白阳性神经元数目分别减少62.5%和30.4%；细胞移植组降低幅度明显小于模型对照组（P < 0.01）。与正常对照组比较，模型对照组损伤侧内侧隔核、斜角带核小白蛋白阳性神经元的面积、周长、灰度均显著降低（P < 0.05或0.01）；细胞移植组上述指标较模型对照组均显著增加（P < 0.05或0.01）。③相关性分析：小白蛋白阳性神经元数目与大鼠在Y型迷宫中的学习次数呈显著负相关（r =-0.76~-0.79，P < 0.01），与记忆能力呈显著正相关（r = 0.78~0.84，P < 0.01）。
结论：神经干细胞移植对老年性痴呆模型鼠基底前脑退变的小白蛋白阳性神经元具有补充和保护作用，并能够明显改善其学习记忆能力，二者呈正性相关。
关键词：神经干细胞；老年性痴呆；小白蛋白阳性神经元；学习；记忆；大鼠

谷海刚，龙大宏，李晓滨，张贵平，苏涛，李佳楣，冷水龙. 神经干细胞移植对老年痴呆模型鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元和学习记忆能力的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2235-2239
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2235(ps).pdf]

中图分类号:R394.2
文献标识码:B
文章编号:1673-8225
(2008)12-02240-05

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural stem cells by whole bone marrow adherence method

AIM:The loss of neurons is the severest in the basal forebrain of senile dementia patients. This study was aimed to verify the effects of neural stem cells (NSC) transplantation on the parvalbumin (PV)-positive neurons in the basal forebrain and the abilities of leaning and memory in the rat model of senile dementia.
METHODS: This study was done in the Department of Anatomy, Guangzhou Medical College from December 2005 to July 2006.①Animals: SPF class adult male SD rats (n=28) were randomly divided into three groups: normal control group (n =8), model control group (n =8), and NSC group (n =12). Furthermore, new-born SD rats (n =10) were used to isolate and culture NSC. All the manipulations were in accordance with the animal ethnic standard.②Methods: The rats of model group and NSC group were made by left fimbria-fornix transaction. NSCs were obtained from the basal forebrain by using the serum-free culturing. And 4 μL NSC suspension (2.5×1010 L-1) was stereotaxically implanted into the injured lesion (coordinates: anterior-posterior, +0.6 mm; lateral, +0.6 mm; dorsal-ventral, -5.5 mm from bregma) instantly after fimbria-fornix transaction.③Evaluation: Four weeks postoperation, the learning and memory abilities were measured by Y-maze test. Then, the brains were taken out after anesthesia and cut on a microtome. The number of PV-positive neurons in the basal forebrain was analyzed by using ABC immunohistochemical staining method and image analysis.
RESULTS: ①Effects on learning and memory abilities: The abilities in NSC group were significantly higher than that in model control group (P < 0.05 or P < 0.01), and almost reached the normal level (P > 0.05).②Effects on PV-positive neurons: Compared with normal control group, PV-positive neurons in the medial septum (MS) and the vertical limb of the diagonal band of Broca (VDB) in model control group decreased by 62.5% and 30.4%, respectively. The decrease extent in NSC group was distinctly smaller than that in model control group (P < 0.01). The area, circumference, and gray value of PV-positive neurons in MS and VDB of model control group were significantly reduced compared with normal control group (P < 0.05 or P < 0.01). However, all the characteristic parameters in NSC group were significantly increased than those in model control group (P < 0.05 or P < 0.01).③Correlative analysis: The number of PV-positive neurons in MS and VDB was negatively correlated with the times of learning of rats (r=-0.76 to -0.79, P < 0.01) and positively correlated with the ability of memory (r=0.78 to 0.84, P < 0.01), which were measured by Y-maze test.
CONCLUSION: NSC transplantation can supply and protect PV-positive degenerative neurons in the basal forebrain and is effective on improving the abilities of learning and memory in the rat model of senile dementia. The relation of them is positive correlative.

Gu HG, Long DH, Li XB, Zhang GP, Su T, Li JM, Leng SL. Effect of neural stem cells transplantation on parvalbumin-positive neurons of the basal forebrain and abilities of learning and memory in a rat model of senile dementia.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2235-2239(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2235(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02231-04

神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力, 能自我更新并足以提供大量神经组织细胞的细胞。目前神经干细胞仍不能用于临床的原因在于其来源和数量有限。神经干细胞可能获得的途径包括胚胎来源和成体来源两个途径，成体来源的神经干细胞由于避免了从胚胎或胎儿获取神经干细胞面临的伦理学束缚, 是未来神经干细胞的主要来源途径。其中来源于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)的神经干细胞是最近研究的一个热点。在本实验中，通过全骨髓贴壁法分离纯化BMSCs，并诱导分化为神经干细胞，检测其特异性表面抗原以进行鉴定，并对神经干细胞的体内外标记进行了观察研究。

设计：观察实验。
单位：青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所。
材料：实验于2006-11/2007-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。选取出生4周左右Wistar大鼠，雌雄不拘，SPF级，体质量200 g左右，由青岛市实验动物和动物实验中心提供（合格证号:SCXK20030010），实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。主要试剂包括：胎牛血清(PAA公司)；DMEM/F12培养液(GIBC0公司)；鼠重组碱性成纤维细胞生长因子(rR-bFGF)、鼠重组表皮生长因子(rR-EGF)(TBD科技公司)；兔抗巢蛋白(Nestin)单抗、兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗、小鼠抗BrdU单抗、即用型DAB显色试剂盒、SABC免疫组化染色试剂盒、SABC(小鼠IgG)-FITC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶）（Sigma公司）。
设计、实施、评估者：设计及资料收集、实施与评估为本文所有作者，均经过专业培训，非盲法评估。
方法：
BMSCs的分离和纯化：取Wistar大鼠脱颈处死，体积分数0.75乙醇浸泡5 min，置于超净工作台上，严格无菌条件下取大鼠双侧股骨和胫骨，将骨骺端剪去，暴露两端骨髓腔，用5 mL注射器抽取体积分数0.20血清培养液反复冲洗骨髓腔，冲洗液收集于无菌离心管中，得到细胞悬液 1 000 r/min离心3 min。弃去上清液。加入培养液充分吹打至单细胞悬液，调细胞密度为4× 108 L-1，接种于培养瓶中，置于37℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养。48 h后全量换液，以后每三四天换液1次，去除杂质细胞，剩余贴壁细胞即为BMSCs。BMSCs的培养扩增和诱导分化：待细胞长至80%~90%融合后用0.25 g/L胰酶消化，以细胞密度4×108L-1接种传代。以后每5~7 d传代1次。传至第3代时，在原培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子终质量浓度 200 ng/L进行诱导分化。每日用倒置相差显微镜观察记录细胞生长情况和形态变化。
细胞免疫组织化学染色鉴定：取诱导后7 d和14 d细胞接种入24孔培养板培养24 h，采用SABC法进行免疫组织化学鉴定(一抗分别为Nestin单抗、NSE

单抗、GFAP单抗；二抗为生物素化羊抗兔IgG，以确定诱导分化的细胞是否为神经元和胶质细胞)。步骤为:细胞经4%多聚甲醛固定；0.01 mol/L PBS冲洗；滴加一抗4℃孵育过夜；生物化二抗室温孵育30 min；链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物室温孵育30 min；DAB显色剂染色 30 min。呈棕黄色的细胞为阳性，阳性对照为星形细胞瘤和神经元肿瘤，阴性对照孔不加一抗。倒置光学显微镜下观察拍照。
Brdu标记神经干细胞的体外研究：将诱导分化后的细胞接种入24孔培养板，待细胞生长至50%时加入BrdU（终浓度50 mmol/L）继续培养，48 h后用PBS洗涤，4%多聚甲醛固定15 min后进行免疫组织化学及免疫荧光染色（一抗为小鼠抗BrdU单抗，二抗为生物素化羊抗小鼠IgG），封片观察。
Brdu标记神经干细胞的体内研究：用50μL微量注射器将Brdu标记的神经干细胞注入Wistar大鼠基底节区（前囟中点前1 mm,矢状缝右旁3.5 mm，深度为颅骨下 5 mm），共注入细胞1×106个(10μL)，1周后处死大鼠取脑, 于穿刺点位置附近作石蜡切片并进行免疫组化染色和免疫荧光染色（一抗为小鼠抗BrdU单抗，二抗为生物素化羊抗小鼠IgG），封片观察。
主要观察指标：①BMSCs生长特性。②BMSCs诱导后形态观察。③巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白细胞免疫组织化学鉴定。④神经干细胞的体内、外标记。

2.1 BMSCs生长特性 BMSCs分离后初接种于培养瓶可见大量悬浮细胞，见图1。

24 h后可见细胞贴壁，但混杂有大量红细胞及杂质，48 h后全量换液去除未贴壁细胞，其余贴壁细胞多呈纺锤形。三四天后细胞进入对数生长期，细胞呈集落样生长，形成多个克隆团样结构，见图2。7 d左右可观察到贴壁细胞逐渐增多,形成突起并彼此发生联系, 细胞排列成漩涡状、网状、辐射状。10~14 d时细胞融合成片。原代培养的BMSCs形态多样，主要有成纤维样细胞，体积较大，占90%左右；另有较少的圆形内皮样细胞。
2.2 BMSCs诱导后形态观察 BMSCs经表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导72 h后，部分细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态。继续培养72 h可见细胞呈现典型神经元样改变，细胞伸出两个或多个突起, 胞体呈多角形或不规则形, 折光性较强, 细胞突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁。

2.3 细胞免疫组织化学鉴定巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达 BMSCs经诱导分化7 d后，部分有核细胞呈现典型的神经元样改变并表达巢蛋白抗原，见图3。

表明其具有干细胞特性;诱导分化14 d后,检测到来源于BMSCs的部分细胞可分别表达神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白，见图4，5。随着培养时间的延长, 神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫反应阳性细胞的比例逐渐增多。

2.4 神经干细胞的体内、外标记神经干细胞体外免疫组织化学显示胞核呈棕色的阳性细胞密布，见图6。

同一细胞培养孔内随机取10个不同视野计算标记阳性率,而后计算不同的5个标本,结果显示BrdU标记阳性率> 85%。细胞免疫荧光染色可见神经干细胞染色明显，见图7。

BrdU标记的神经干细胞注入体内后1周仍可见明显的BrdU着色,穿刺点位置可见密集的BrdU阳性细胞，见图8、9。

BMSCs是骨髓中除造血干细胞以外的非造血性干细胞,于20世纪80年代成功分离[1],并发现其具有多种分化潜能, 可以分化为心血管细胞、中枢神经细胞、肺细胞、肾细胞和皮肤细胞等[2-7]。由于骨髓、脑组织中的前体细胞具有许多共性,近年来一些学者试图寻找神经干细胞及BMSCs之间的关联。Nilsson等[8]成功在体外将人和小鼠BMSCs通过加入特殊生长因子诱导分化出成熟神经细胞。Sanchez-Ramos等[9]2000年报道,来自骨髓的成体干细胞可以形成神经元。BMSCs可以向神经干细胞方向进行分化的证据[10]，提示BMSCs可以作神经干细胞的源细胞或替代性细胞,在细胞移植治疗中枢神经系统疾病方面发挥积极作用。
自骨髓中获取BMSCs有多种方法[11-13]，本实验采用全骨髓贴壁培养法所获得的BMSCs具有更高的生物学活性，在培养初期，BMSCs可很快贴壁，但早期细胞贴壁不牢，适当延长初次换液时间可获得更多的BMSCs，一般在48 h后初次换液，三四天后细胞即进入对数生长期。在本实验中发现有两种形态的细胞值得注意，一种是成纤维细胞：细胞的形态呈梭形、扇形或星形,细胞胞质常向外伸出二三个长短不同的突起,细胞边缘不整齐,胞浆透明,细胞核呈圆形, 核仁明显。另一种是多形细胞：这些细胞初期呈圆形，有分裂能力及克隆形成能力, 在持续培养观察中发现这些细胞形态可发生变化，逐渐发出细胞突起，细胞形态不规则，表现为多形细胞。在本实验传代培养中发现，具有克隆能力的BMSCs经传代后, 其数量明显多于原代培养，说明本实验所采用的细胞培养方法适用于BMSCs的体外生存与扩增。
影响BMSCs向神经干细胞系定向分化的因素比较复杂，有研究表明碱性成纤维细胞生长因子可促进神经干细胞增殖并决定其分化方向[14],表皮生长因子对增殖起协同作用[15]。本实验通过适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子成功地诱导BMSCs转化为神经干细胞，并促进其增殖、抑制分化。培养7 d后可见Nestin阳性细胞，表明BMSCs在体外诱导分化后具有干细胞特征，诱导细胞继续培养，部分细胞体积逐渐增大，出芽形成细胞突起，免疫组织化学检测发现部分细胞分别表达NSE和GFAP，证实这些细胞具有神经元和神经胶质细胞的特征，同时也证明了神经干细胞的可分化特征。
在神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究过程中，作者需要随时监测神经干细胞在体内的迁移和分化。BrdU作为一种嘧啶类似物，可以当细胞处于DNA合成期时掺入到新合成的DNA中,只要细胞不凋亡,这种BrdU在胞核的DNA中长期存留[16]。本实验采用BrdU对NSCs进行体外和体内标记，分别进行免疫组化和免疫荧光检测，观察标记1周后其标记率 > 85%，神经干细胞的形态、生长、增殖及分化并不受影响。在细胞培养板和石蜡包埋切片中BrdU均可被显示，背景低，阳性和阴性易区分[17]，而且使用BrdU对活体动物无任何副作用。与同位素和荧光标记技术相比，BrdU标记和检测的准确性高、标记率高，方法简便，迅速安全，是跟踪监测神经干细胞移植的理想标记物[18-20]。

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