兔自体脂肪干细胞成骨诱导后经皮注射修复骨缺损★

马舟涌1，李放2，雷伟1，陈晓斌2，常玉立2，苏强2，余兆仲2

课题背景：以往的骨组织工程大多应用骨髓间充质干细胞，近年来因获取和培养扩增脂肪干细胞比骨髓间充质干细胞具有优势，所以本实验选择脂肪干细胞作为种子细胞,定向诱导其向骨细胞分化,并且体外诱导后移植到体内，试图观察多因素干预对骨缺损的效果。

应用要点：①通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞，获取了较量多数量的细胞，并经过表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后，细胞Nestin、NSE、GFAP表达阳性，表明在适当的条件下骨髓间充质干细胞可以诱导分化出神经干细胞。②为了解决神经干细胞在实验研究中的示踪问题，采用BrdU对神经干细胞进行体外和体内标记，1周后其标记率高达85%以上，说明BrdU标记和检测的准确性高、标记率高，是跟踪监测神经干细胞移植的理想标记物。

相关链接：对神经干细胞的研究近年来许多实验均致力于神经干细胞来源的问题，以期获得一个可靠的获取大量纯化神经干细胞的方法，其中最受关注的是骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞可以来源于自体,并且获取简单，从而克服了许多异体神经干细胞移植的弊端，为神经干细胞治疗带来新的希望。但是要将骨髓间充质干细胞真正应用于临床,仍然存在一些问题：①需要进一步检测从骨髓间充质干细胞分化而来的神经干细胞是否具有神经干细胞的一系列功能。②需要深入了解调控骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化的分子机制等。

1解放军第四军医大学西京医院骨科，陕西省西安市 710032；2解放军北京军区总医院骨科，北京市 100700

马舟涌★，男，1979年生，山西省运城市人，汉族，解放军第四军医大学在读硕士，主要从事椎间盘和骨组织工程的研究。
mazhouyong23@163.com

摘要
目的:探索兔自体脂肪干细胞、成骨诱导后的脂肪干细胞联合骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶（bone morphogenetic protein-2/ Fibrin glue，BMP-2/ FG）经皮移植到骨缺损后体内成骨能力的差异。
方法：实验于2006-08/2007-11在北京军区总医院全军骨科研究所完成。①实验材料：清洁级日本大耳白兔，2.0~2.5 kg,雌雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：制作新西兰大白兔桡骨中段15 mm骨缺损模型35侧，随机分为5组，每组7侧：未诱导细胞组、诱导细胞组、未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组、空白对照组。未诱导细胞组、诱导细胞组直接用生理盐水重悬未诱导脂肪干细胞和经成骨诱导的脂肪干细胞，未诱导细胞+BMP-2/FG、诱导细胞+ BMP-2/FG组分别用含20 g/L 骨形态发生蛋白-2、5 g/L纤维蛋白原的生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导的脂肪干细胞。③实验评估: X射线片观察各组骨缺损修复情况，并进行生物力学检测。
结果：①12周时，未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组在骨缺损区新生骨的数量明显优于未诱导细胞组、诱导细胞组(P均 < 0.05)。②术后4周X射线显示，未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组阻射密度值高于其他组(P均 < 0.05)，未诱导细胞组与诱导细胞组无差别。术后8，12周时，诱导细胞组高于未诱导细胞组，未诱导细胞+BMP-2/FG、诱导细胞+ BMP-2/FG组均高于其他组，诱导细胞+ BMP-2/FG组高于未诱导细胞+BMP-2/FG组(P均 < 0.05)。③生物力学检测显示，未诱导细胞+BMP-2/FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均明显高于其他组，并且诱导细胞+ BMP-2/FG组高于未诱导细胞+BMP-2/FG组(P均 < 0.05)。未诱导细胞组与诱导细胞组无差别。
结论: 成骨诱导脂肪干细胞及联合BMP-2/FG移植后8周和12周时具有更强的成骨能力，可作为种子细胞应用于骨组织工程。
关键词：脂肪干细胞；骨形态发生蛋白；细胞培养；细胞移植；经皮注射；纤维蛋白胶

马舟涌，李放，雷伟，陈晓斌，常玉立，苏强，余兆仲.兔自体脂肪干细胞成骨诱导后经皮注射修复骨缺损[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2245-2249 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12k/12k-2245(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号:1673-8225
(2008)12-02245-05

Percutaneous autologous adipose derived stem cell transplantation for bone defect after osteogenic induction in rabbits

AIM:The loss of neurons is the severest in the basal forebrain of senile dementia patients. This study was aimed to verify the effects of neural stem cells (NSC) transplantation on the parvalbumin (PV)-positive neurons in the basal forebrain and the abilities of leaning and memory in the rat model of senile dementia.
METHODS: This study was done in the Department of Anatomy, Guangzhou Medical College from December 2005 to July 2006.①Animals: SPF class adult male SD rats (n=28) were randomly divided into three groups: normal control group (n =8), model control group (n =8), and NSC group (n =12). Furthermore, new-born SD rats (n =10) were used to isolate and culture NSC. All the manipulations were in accordance with the animal ethnic standard.②Methods: The rats of model group and NSC group were made by left fimbria-fornix transaction. NSCs were obtained from the basal forebrain by using the serum-free culturing. And 4 μL NSC suspension (2.5×1010 L-1) was stereotaxically implanted into the injured lesion (coordinates: anterior-posterior, +0.6 mm; lateral, +0.6 mm; dorsal-ventral, -5.5 mm from bregma) instantly after fimbria-fornix transaction.③Evaluation: Four weeks postoperation, the learning and memory abilities were measured by Y-maze test. Then, the brains were taken out after anesthesia and cut on a microtome. The number of PV-positive neurons in the basal forebrain was analyzed by using ABC immunohistochemical staining method and image analysis.
RESULTS: ①Effects on learning and memory abilities: The abilities in NSC group were significantly higher than that in model control group (P < 0.05 or P < 0.01), and almost reached the normal level (P > 0.05).②Effects on PV-positive neurons: Compared with normal control group, PV-positive neurons in the medial septum (MS) and the vertical limb of the diagonal band of Broca (VDB) in model control group decreased by 62.5% and 30.4%, respectively. The decrease extent in NSC group was distinctly smaller than that in model control group (P < 0.01). The area, circumference, and gray value of PV-positive neurons in MS and VDB of model control group were significantly reduced compared with normal control group (P < 0.05 or P < 0.01). However, all the characteristic parameters in NSC group were significantly increased than those in model control group (P < 0.05 or P < 0.01).③Correlative analysis: The number of PV-positive neurons in MS and VDB was negatively correlated with the times of learning of rats (r=-0.76 to -0.79, P < 0.01) and positively correlated with the ability of memory (r=0.78 to 0.84, P < 0.01), which were measured by Y-maze test.
CONCLUSION: NSC transplantation can supply and protect PV-positive degenerative neurons in the basal forebrain and is effective on improving the abilities of learning and memory in the rat model of senile dementia. The relation of them is positive correlative.

Gu HG, Long DH, Li XB, Zhang GP, Su T, Li JM, Leng SL. Effect of neural stem cells transplantation on parvalbumin-positive neurons of the basal forebrain and abilities of learning and memory in a rat model of senile dementia.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2235-2239(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2235(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02231-04

各种原因引起的骨缺损、骨折的延迟愈合及骨不连是骨科临床工作中经常遇到的一个难题。目前临床上常用的治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植和人工骨移植等。近年来组织工程学技术的迅速发展,对骨不连进行了组织工程研究，大量文献报道中应用于骨组织工程中的种子细胞基本来源于骨髓，但人体脂肪组织十分丰富，用其分离脂肪间质干细胞可避免获取骨髓间质干细胞时给供者带来极大痛苦。脂肪干细胞是2001年Zuk等[1]从脂肪组织中提取的一种新的干细胞，能够向骨、软骨、心肌细胞等多个方向分化，所以本实验就用自体脂肪干细胞作为种子细胞进行研究。

设计：以细胞支架和细胞因子为研究对象，试验因素为多因素，骨缺损修复程度为检测指标随机对照实验。
单位：解放军北京军区总医院全军骨科研究所。
材料：实验于2006-08/2007-11在解放军北京军区总医院全军骨科研究所完成。
清洁级日本大耳白兔，2.0~2.5 kg,雌雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）、超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、CO2恒温培养箱（日本SANYO公司）、地塞米松（美国Sigma公司）、II型胶原酶（Gibco分装）、β-甘油磷酸钠（美国Sigma公司）、胰蛋白酶（北京纵横洋洲医药生物科技有限公司）、L-抗坏血酸（美国Sigma公司）、胎牛血清（安普干细胞）、α-MEM培养基（美国Hyclone公司）、纤维蛋白原（美国Sigma公司）、凝血酶（美国Sigma公司）、BMP-2(解放军军事医学科学院三所提供)。
设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，实施为第一、四、五作者，评估为第二、三、六、七作者，采用盲法评估，均受过系统培训。
方法：
兔脂肪干细胞的分离、传代、鉴定及诱导培养：3%戊巴比妥钠麻醉后，取兔肩胛下脂肪，清除小血管、外包膜和结缔组织，PBS冲洗3遍，眼科剪剪碎成糊状，0.075%Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴箱中消化1 h，每10 min振动1次，过滤后离心-重悬于α-MEM进行培养。3 d后换液，以后每3 d换液1次。细胞铺满瓶底时,用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞进行传代[2-3]。获得的3代脂肪干细胞用采用免疫组织化学法检测细胞表面抗原CD44表达为阳性。另外获得的2代脂肪干细胞以1×105/cm2接种到 25 cm2塑料培养瓶内，换用含有 1×10-7 mol/L地塞米松[4]、50 mg/L抗坏血酸和 10 mmol/L β-甘油磷酸钠的成骨诱导液进行成骨诱导2周[5- 6]。
动物模型的制作及分组：术前1 d脱毛剂备皮后，以1 mL/kg3%戊巴比妥钠麻醉、麻醉满意后碘伏消毒双侧前肢，逐层铺巾。在常规无菌操作下，在前臂中段前内侧作长2.0~3.0 cm纵形切口，切开皮肤、筋膜，逐层分开肌肉、血管、神经，充分暴露桡骨中段，作1.5 cm的骨缺损，并切除骨缺损区骨膜。清理切口内的碎骨片，生理盐水彻底冲洗，逐层关闭切口，术后72 h开始经皮移植细胞。经早好模型的前腿随机分为5组：未诱导细胞组、诱导细胞组[7]、未诱导细胞+骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶（bone morphogenetic protein-2/Fibrin glue，BMP-2/FG）组、诱导细胞+ BMP-2/FG组、空白对照组。造模后移植：显微镜下观察细胞，各选取9瓶经成骨诱导液诱导12 d的和无诱导的脂肪干细胞，经胰蛋白酶消化后，离心收集，计数。未诱导细胞组、诱导细胞组直接用生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导液诱导12 d的脂肪干细胞，未诱导细胞+ BMP-2/ FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组分别用含20 g/L BMP-2、5 g/L纤维蛋白原的生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导液诱导12 d的脂肪干细胞（现用现制，悬浮细胞为诱导液诱导12 d的，且终浓度为8×109 L-1），另外再用生理盐水配制4×105 U/L的凝血酶溶液。纤维蛋白胶的制作：用医用生物蛋白胶台上附件（推液支架、连接针座及喷液头组件）分别在无菌条件下经皮注射至兔的前肢桡骨骨缺损处，注射液的总量为500 μL[8]，而空白对照组则直接注射500 μL的生理盐水，
观测内容：①术后观察动物活动及伤口愈合情况。②X射线观察:术后即刻、细胞移植后每4周于麻醉后摄双侧尺桡骨正位片，摄片条件统一为46 kV,2.50 mAs，曝光时间10.1 ms，投照距离110 cm。阻射密度以同一照片骨缺损邻近区域相同面积皮质骨密度为100，相同面积照片底色为0来测量骨缺损区阻射密度相对值，同一照片骨缺损区的平均阻射密度取所有可见阻射阴影密度的均值。③大体标本观察各组分别在术后4、8周各组处死适量动物，获取2侧前肢，12周处死所有动物。观察骨缺损区大致修复状况。④生物力学检查：12周时处死试验动物，取所有桡骨进行四点弯曲试验，施压的2点距离为15 mm，与骨缺损的宽度相等。使用长春试验机研究所生产的CSS-66010型生物力学试验机得出四点弯曲最大负荷(破坏负荷)。
主要观察指标:术后X射线检查及生物力学检测。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计学处理，多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用t检验。 P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 动物术后活动及伤口观察 2只动物麻醉死亡，从实验组剔除后又纳入2只动物，保持总数不变。所有动物术后饮食正常，手术切口无红肿及渗液，一期愈合。
2.2 各组术后影像学观察实验各组不同时相骨缺损区域，阻射密度值见表l，X射线片见图1。

术后X射线随访，术后4周，诱导细胞组缺损区亦出现较均匀密度增高影，但周围少量骨痂，但未能桥接断端，未诱导细胞组骨断端较为清晰，但有新骨生成，缺损区密度略低于诱导细胞组，诱导细胞组与未诱导细胞组的阻射密度值无统计学差别（P > 0.05）。未诱导细胞+ BMP-2/ FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组的缺损区骨断端不清，都出现较均匀密度增高影，未诱导细胞+ BMP-2/FG组缺损区密度较诱导细胞+BMP-2/FG组略低，未诱导细胞+ BMP-2/ FG组阻射密度值比未诱导细胞组高(P < 0.05）。诱导细胞+ BMP-2/FG组阻射密度值比诱导细胞组高(P < 0.05）,空白对照组未见明显的新骨生成。术后8周，诱导细胞+ BMP-2/FG组新生骨大量形成，部分皮质连续性恢复，骨痂密度高；已有2侧骨髓腔部分再通(2/7)，未诱导细胞+ BMP-2/ FG组新生骨大量形成，形状略有不规整，周围骨痂密度高，范围较大，尺桡骨固有的曲度加大，已有1侧骨髓腔部分再通(1/7)；未诱导细胞组、诱导细胞组缺损处有明显新骨形成，连接两断端但未诱导细胞组新骨略少；空白对照组桡骨断端与尺骨相连续处可见有少许新骨形成。诱导细胞组阻射密度值比未诱导细胞组高（P < 0.05），未诱导细胞+ BMP-2/ FG组阻射密度值比未诱导细胞组高（P < 0.05），诱导细胞+ BMP-2/FG组的阻射密度值比诱导细胞组高 (P < 0.05)，诱导细胞+ BMP-2/FG组阻射密度值比未诱导细胞+ BMP-2/ FG组高(P < 0.05)。术后12周，诱导细胞+ BMP-2/ FG组4侧髓腔完全再通(5/7)，1侧髓腔部分再通(1/7), 2侧髓腔未通(2/7)，新生骨密度与正常皮质无明显差异；未诱导细胞+ BMP-2/ FG组5侧髓腔完全再通(4/7)，1侧髓腔部分再通(1/7)，1侧髓腔未通(1/7)新生骨密度与正常皮质相似，但骨皮质明显厚于正常骨，皮质边缘尤其是原骨断端部可见小的“骨质增生”样骨性突出影。诱导细胞组3侧髓腔完全再通（3/7），3侧髓腔部分再通(3/7)，1侧缺损区新生骨桥接断端，密度较高（1/7）；未诱导细胞组3侧髓腔完全再通(3/7)，2侧髓腔部分再通(2/7)，2侧缺损区新生骨桥接断端，密度较高(2/7)；空白对照组两骨断端变钝，硬化，骨髓腔封闭。诱导细胞组阻射密度值比未诱导细胞组高 (P < 0.05)，未诱导细胞+ BMP-2/ FG组阻射密度值比未诱导细胞组高(P < 0.05)，诱导细胞+ BMP-2/FG组阻射密度值比诱导细胞组高(P < 0.05），诱导细胞+ BMP-2/FG组阻射密度值比未诱导细胞+ BMP-2/ FG组高(P < 0.05）。
2.3 各组生物力学测定 12周后的生物力学检测结果：未诱导细胞组、诱导细胞组、未诱导细胞+ BMP-2/ FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组、空白对照组标本四点弯曲最大负荷的平均值依次为（193.6±19.4）N、（203.0±21.7）N、（239.4±36.9）N、（241.2±26.1）N、（149±124.6）N。未诱导细胞+ BMP-2/ FG组、诱导细胞+ BMP-2/FG组标本的四点弯曲最大负荷明显高于未诱导细胞组、诱导细胞组、空白对照组 (P < 0.05)，诱导细胞组、未诱导细胞+ BMP-2/ FG组间无统计学差异(P < 0.05)，B、C分别大于空白对照组(P < 0.05)。生物力学测定的结果证明各组在骨缺损部位的成骨能力依次为：诱导细胞+ BMP-2/FG组>未诱导细胞+ BMP-2/FG组>未诱导细胞组、诱导细胞组>空白对照组，说明成骨诱导的脂肪干细胞和联合BMP-2/FG移植可以增强体内成骨作用。

在细胞水平，骨折的修复包括以下4个连续的过程：细胞募集，骨诱导，骨调控，骨传导。骨折发生后，邻近及全身的基质干细胞募集于骨折处，骨折局部具有促进骨愈合的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)等骨生长因子分泌增多[9]，诱导募集的干细胞向成骨细胞分化，出现骨的再生。因此，如果骨折的愈合过程中某一个或多个阶段受到阻碍，都必然导致骨折不愈合。所以本实验就增加骨缺损局部骨缺损BMP浓度来增加其对骨修复。显然开放手术的方法进一步破坏了骨缺损、骨不连区域的血供，阻碍了干细胞的募集，但经皮注射可以避免破坏原有的血供。
由于临床上的骨缺损都有自发愈合的倾向，所以在实验中造模时缺损必须标准的缺损，本实验图桡骨骨缺损造模时，当骨缺损为1 mL时，10周后大部分都已自然愈合，所以本实验的骨缺损模型为1.5 mL，临床上治疗大部分通过自体骨和异体骨移植。但是自体骨不仅提供的骨量十分有限，而且可能导致供区的创伤、畸形、疼痛及感染等问题，更重要的是造成了新的骨质缺损；异体骨有发生排斥反应及感染病毒性肝炎、艾滋病等传染病的风险；单纯人工骨移植由于其成骨效能非常低。所以有大量学者进行了大量骨替代材料的研究[10-12]。本实验以前研究的基础上证明：提取和获得同样数量的骨髓间充质干细胞所需的时间较长、费用较高、活力较低，另外骨髓中干细胞含量少，仅占有核细胞的1/105左右，并且骨髓抽取的量存在一定限制。所以本试验就通过提取兔脂肪干细胞，并验证且克服了以上不足之处[ 2,13-15]。所以脂肪干细胞可作为组织再生工程干细胞理想的替代资源，有非常重要的研究和应用价值。其取材也比较方便，在体外培养有明显的增殖能力。近年来，有学者尝试经皮注射自体骨髓中单个核白细胞的方法治疗骨不连取得了满意的疗效。体内和体外实验均证明基因重组人骨形成蛋白-2有明显骨诱导活性[16-17]。纤维蛋白胶[8]可以作为骨髓间充质干细胞支架来修复骨不连，但也有文献报道[2]，脂肪干细胞复合骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶对骨缺损治疗中无明显促进作用，引起学术界争论，本实验利用X射线评价及四点弯曲试验来测定其效果。
本实验通过使用可注射的纤维蛋白封闭剂原理[18]，在溶液喷出喷液头时即成凝胶[3]，避免了使局部BMP及脂肪干细胞浓度下降[19]，并且纤维蛋白胶具有刺激细胞分化的作用[20-21]，利用X射线片的平均阻射密度值代表局部骨缺损新骨形成的量，从而达到量化，可以进行更准确的比较。本实验通过放射学方法证明,修复小段骨缺损8、12周时的成骨能力而言：诱导后脂肪干细胞复合纤维蛋白胶及BMP移植组的成骨能力＞单纯脂肪干细胞复合纤维蛋白胶及BMP移植组＞诱导后脂肪干细胞复合BMP移植组＞单纯脂肪干细胞复合BMP移植组，但4周时，诱导后脂肪干细胞复合BMP/FG移植组与单纯脂肪干细胞复合BMP/FG移植组并无明显差别，具体原因正在研究中，在所有时相中，诱导后脂肪干细胞复合纤维蛋白胶及BMP移植组和单纯脂肪干细胞复合纤维蛋白胶及BMP移植组的成骨能力大于其他三组。
既往类似研究的生物力学检测多为测量三点弯曲最大负荷。但是三点弯曲施压部位为骨缺损的中部，在这种负荷情况下，通过横切面的弯矩在承受负荷点上最大，此点处骨所受的压应力与张应力也最大，因而如果此点骨修复不牢固的话，容易发生断裂。所以单纯三点弯曲并不能客观评价整段骨缺损的修复效果。本研究改为测量四点弯曲最大负荷，施压的两点距离为15 mm，与骨缺损的宽度相等，正位于骨缺损的两侧。这样使标本发生纯弯曲，骨缺损部位均匀受力，骨缺损局部形变明显减小，大大降低了某一个点的应力，因而能够更恰当地评价整段骨缺损的力学性能，进而评价骨修复效果，而本试验对12周后进行测量，证明诱导后脂肪干细胞复合BMP/FG移植组最大负荷大于单纯脂肪干细胞复合BMP/FG移植组的成骨能力。

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