小鼠胚胎干细胞NT3基因转染后移植对脊髓损伤的恢复作用**☆

秦茂林1，杨卫兵2，李红丽1，李成仁1，刘建军1

课题背景：本课题前期受到国家自然科学基金资助资助，项目编号3000172，已经顺利结题。该课题应用研究得到解放军第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室与解放军第一八一医院皮肤科联合申请的广西省科学研究与技术开发基金资助，项目经费15万元，拟培养人胚胎干细胞，并着重其移植治疗临床相关病例的应用研究。

应用要点：①实验应用NT-3基因转染胚胎干细胞，以经典维甲酸4-/4+法体外诱导转染后的胚胎干细胞分化为神经前体细胞（神经元前体和胶质细胞前体），找到最佳的体外分化的条件。②将分化后的混合细胞移植到大鼠脊髓横断模型的损伤部位，观察移植物能否增强神经元功能的恢复。

偏倚或不足：由于实验周期限制，在脊髓损伤的移植治疗过程中存在一些观察盲区，如细胞移植后缺乏进行整个损伤神经元重建的研究，仅对损伤区域进行形态学观察难以说明神经元整体的恢复；另外NT3表达的研究存在一些不足。拟进行损伤区域近侧脊髓的连续切片，免疫细胞化学染色对神经元形态的恢复及NT3在蛋白水平的表达进行观察，经过三维重建进一步了解整个受损伤神经元的形态结构变化。

1解放军第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室，重庆市 400038；2解放军第一八一医院皮肤科，广西壮族自治区桂林市 541002

秦茂林☆，男，1974年生，河南省洛阳市人，汉族，博士，讲师，主要从事干细胞与发育再生方面的研究。
qinmaolinyypa@
yahoo.com

杨卫兵☆，博士，副主任医师，解放军第一八一医院皮肤科，广西壮族自治区桂林市 541002

李红丽☆，博士，副教授，解放军第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室，重庆市 400038
lihlimm@
yahoo.com

国家自然科学基金（3000172）*；广西省科学研究与技术开发基金（2005）*

摘要
目的:由胚胎干细胞分化的神经细胞移植能够在一定程度上恢复脊髓损伤模型动物的功能，此发现使胚胎干细胞成为一种用于移植学研究的重要工具。观察经NT3基因转染修饰的小鼠MESPU35（ES-NT3）胚胎干细胞株移植对脊髓损伤动物脊髓结构和功能重建的恢复效果。
方法：实验于2004-09/12 在解放军第三军医大学组织胚胎学教研室实验室完成。①材料：清洁级成年Wistar大鼠36只，随机数字表法分为模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组，12只/组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。移植所用MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株均由本室冻存。②实验方法：复苏MESPU35和ES-NT3细胞株，采用经典维甲酸4-/4+法诱导两种胚胎干细胞神经定向分化，收集分化9 d后的细胞，调整细胞终浓度至5×1010 L－1备用。各组大鼠均建立L4 脊髓损伤模型，在脊髓完全横断后10 min内，基因转染细胞移植组分多点缓慢注入ES-NT3胚胎干细胞悬液， 2 μL/点，细胞总数约4×105个，注射位置为损伤区域白质与灰质交界处；未转染细胞移植组同法注射MESPU35胚胎干细胞悬液，模型对照组注射等量生理盐水。③实验评估：各组大鼠分别于术前、术后即刻、术后15 d和30 d进行后肢运动功能Tarlov评分检测，分数越低表示运动功能恢复越差。后肢运动功能检测30 min后进行斜板实验，检测大鼠抓握和维持姿势能力。微型注射器将25％的辣根过氧化物酶2μL注入大鼠坐骨神经内，2 d后取L1~L4脊髓常规冰冻切片，参照Mesulam法进行过氧化物酶逆行追踪。
结果：因细菌感染，模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组各死亡2只、1只、2只。①后肢运动功能检测：各组大鼠术后即刻后肢运动功能评分为0。术后15 d，30 d与模型对照组比较，未转染细胞移植组后肢运动功能评分升高(P < 0.01)，但未达到正常水平；基因转染细胞移植组恢复程度最高，后肢运动功能评分基本接近正常水平，明显高于未转染细胞移植组(P < 0.05)。②斜板试验：与后肢运动功能检测结果基本相似。③辣根过氧化物酶逆行追踪情况：模型对照组未见阳性神经元。术后30 d基因转染细胞移植组阳性神经元增至最多，脊髓结构恢复情况优于未转染细胞移植组。
结论：经NT3基因转染修饰的鼠MESPU35胚胎干细胞向神经定向诱导分化后，移植治疗脊髓损伤大鼠能更好地促进脊髓功能恢复和结构重建。
关键词：胚胎干细胞；NT-3基因；脊髓损伤；大鼠

秦茂林，杨卫兵，李红丽，李成仁，刘建军.小鼠胚胎干细胞NT3基因转染后移植对脊髓损伤的恢复作用[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12(12):2263-2266
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2263(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02263-04

Effects of neurotrophin-3 modified embryonic stem cells transplantation on the recovery of spinal cord injury

AIM:Embryonic stem cell (ES)-derived neural cells transplantation can recover the function of spinal cord injury animal models, therefore ES cells plays an important role in transplantation researches. This study was designed to observe effects of mouse MESPU35 (ES-NT3 cells) modified by neurotrophin-3 gene (NT-3) on the structure and function recovery in rats with spinal cord injury.
METHODS: This experiment was conducted in laboratory of Department of Histology and Embryology, the Third Military Medical University of Chinese PLA from September to December in 2004.①Thirty-six clean-level adult Wistar rats were divided into three groups by the method of random digits table: model control group, transplantation control group and transplantation group, with 12 rats in each group. All the disposals were in accordance with the guideline of animal ethics. MESPU35 cell strain and ES-NT3 cell strain used for transplant were frozen in this laboratory.②After anesthesia, MESPU35 cell strain and ES-NT3 cell strain were induced to differentiate with typical retinoic acid 4-/4+ method. Nine days later, cells were collected and adjusted into a density of 5×1010 L-1. Rat spinal cord was exposed, and the transection model of injury was fabricated on L4 spine cord within 10 minutes. For the transplantation control group and transplantation group, the suspenseful fluid of MESPU35 and ES-NT3 cell strains (totally 4×105 cells), was slowly injected at the juncture between white matter and grey matter in lesioned spinal cord respectively, 2 μL for each lesion site. The rats of model control group were injected with the same dose of physiologic saline.③The hindlimb locomotor function of rats in three groups were detected with Tarlov score before operation, and at 0, 15, 30 days after operation. The lower score indicated poorer recovery of the hindlimb locomotor function. Thirty minutes after the detection, the inclined plane trial was performed to test the grasping and posture maintenance ability of the rats. Before drawing the materials from rats, 2 μL 25% horseradish peroxidase (HRP) was injected in sciatic nerve by microinjector. Two days later, L1–4 spinal cord sections of rats were frozen with routine method, and staining was performed according to Mesulam’s method to observe HRP retrogradation tracing.
RESULTS: Due to bacterial infection, there were 2, 1, 2 animals died respectively in model control group, transplantation control group and transplantation group.①Detection of hindlimb locomotor function: All rats were scored as 0 at 0 day after operation. Compared with the model control group, scores of hindlimb locomotor function at 15 and 30 days after operation increased obviously in the transplantation control group (P < 0.01), however still lower than normal level. Rats of transplantation group had the highest scores and were near to normal level, which were significantly higher than that of transplantation control group (P < 0.05).②Inclined plane test: The identical results were observed in the hindlimb locomotor function detection.③HRP retrogradation tracing test: No positive neurons were observed in model control group. The numbers of staining positive neuron increased to the most level in spinal cord of rats in transplantation group at 30 days after operation, and the structure of spinal cord had better recovery than transplantation control group.
CONCLUSION: Neural differentiation of rat MESPU35 ES cells modified by NT-3 is transplanted in rats with spinal cord injury, which can promote both function recovery and structure reconstruction of injured spinal cord.

Qin ML, Yang WB, Li HL, Li CR, Liu JJ.Effects of neurotrophin-3 modified embryonic stem cells transplantation on the recovery of spinal cord injury.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(12):2263-2266(China)
[www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/08-12/12k-2263(ps).pdf]

中图分类号: R394.2
文献标识码: A
文章编号: 1673-8225
(2008)12-02231-04

在特定的条件下,中枢神经在某些程度上有再生能力，但比周围神经再生困难得多[1]。胚胎干细胞分化的神经细胞移植能够在一定程度上恢复脊髓损伤模型动物的功能，这些发现使胚胎干细胞成为一种用于移植学研究的重要工具[2]。本实验利用来源于C57BL/6J小鼠的MESPU35胚胎干细胞株经NT3基因转染修饰（ES-NT3）后，在特定条件进行4-/4+法诱导神经分化，将其移植到脊髓损伤大鼠模型，通过斜板实验和后肢运动功能评分、辣根过氧化物酶束路追踪等方法观察损伤模型在结构和功能上的恢复。

设计：随机对照动物实验。
单位：解放军第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室，解放军第一八一医院皮肤科。
材料：实验于2004-09/12在解放军第三军医大学组织胚胎学教研室实验室完成。①动物：清洁级成年Wistar大鼠36只（由解放军第三军医大学动物实验中心提供，许可证号SKSC（军2002008）），体质量200~250 g，雌雄不拘，随机数字表法分为模型对照组、未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组，12只/组，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②主要材料与试剂：移植所用MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株均由本室冻存；DMEM培养基(Gibco公司)；2×10-4 mol/L谷氨酰胺(华美公司)；1×非必需氨基酸(Gibco公司)；1×103 U/mL白血病抑制因子（Gibco公司）；10%小牛血清（杭州四季青生物研究所）；5%胎牛血清（Gibco公司）；维甲酸(Sigma公司)；辣根过氧化物酶（Sigma VI公司)。
设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，干预实施及评估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
胚胎干细胞神经定向分化[4]：复苏MESPU35细胞株和ES-NT3细胞株，经典维甲酸4-/4+法（即拟胚体自然生长4 d，不加维甲酸，随后4 d添加维甲酸诱导形成高比例神经拟胚体）诱导以上两种胚胎干细胞神经定向分化，收集分化9 d后的细胞，调整细胞终浓度至5×1010 L－1备用于脊髓移植。
L4脊髓损伤模型的制备：各组大鼠均建立L4髓损伤模型，用1％戊巴比妥钠按25 mg/kg体质量腹腔注射麻醉，常规手术方法暴露L4段脊髓，用眼科镊将脊髓轻轻挑起，完全剪断，肌肉缝合封闭椎管缺损，缝皮。
胚胎干细胞脊髓内移植：未转染细胞移植组、基因转染细胞移植组大鼠在脊髓完全横断后10 min内，分别多点缓慢注入分化9 d后的MESPU35和ES-NT3胚胎干细胞悬液，2 μL/点，

细胞总数约4×105个，注射位置为损伤区域白质与灰质交界处，距脊髓表面约0.6 mm；模型对照组大鼠用相同方法注射等量生理盐水。分层缝合切口，术后在伤口局部滴加青霉素防止感染，一般情况下动物在术后2.0~ 3.0 h苏醒。术后20 d内每天给动物腹腔注射青霉素 10万U/ kg，每天将动物的膀胱人工排空两次，直到动物自身排尿反射恢复。
动物后肢运动功能检测：各组大鼠分别于术前、术后即刻、术后15 d和30 d进行后肢运动功能评分检测，评定前排空膀胱。采用改良的Tarlov评分标准[5]，共分为6级。0分：后肢无活动，不能负重；1分：可见后肢轻度活动，但不能负重；2分：可见明显的后肢活动，但不能负重；3分：后肢可支持体重，能走一两步；4分：可走动，但动作不稳或有肌强直；5分：后肢活动正常。
斜板试验：各组大鼠均在后肢运动功能检测30 min后进行斜板实验，检测大鼠抓握和维持姿势能力。采用标准为改良的Rivlin和Tator法[6]，在自制的可调角度爬坡斜板器上进行，检查时将大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直位放置，斜板每次升高5°，大鼠能够停留5 s的最大角度为其功能值。
辣根过氧化物酶逆行追踪：在取材前2 d给予麻醉，切开动物左侧臀部皮肤，分离肌肉，暴露坐骨神经，用微型注射器将25％的辣根过氧化物酶2μL注入坐骨神经内；注射时程8~10 min，缝合皮肤。术后即刻、术后15 d和30 d进行运动功能评分和斜板实验后，麻醉动物，打开椎管，取出L1~4脊髓，40 g/L多聚甲醛液中浸泡固定6 h，30%蔗糖多聚甲醛液中浸泡至组织块沉至瓶底，恒冷切片机切片，片厚30 μm。按Mesulam法[7]进行过氧化物酶底物显色反应，切片封固后光镜下观察。
主要观察指标：①后肢运动功能检测。②斜板试验结果。③辣根过氧化物酶逆行追踪情况。
统计学方法：由第一作者采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析，实验数据以_x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2.1 后肢运动功能检测各组大鼠L4平面脊髓全横断后，后肢完全瘫痪，术后即刻后肢运动功能评分为0。术后15 d，30 d与模型对照组比较，未转染细胞移植组恢复较好，后肢运动功能评分较高，差异有显著性意义(P < 0.01)，但未达到正常水平；基因转染细胞移植组恢复程度最高，后肢运动功能评分基本接近正常水平，与未转染细胞移植组比较差异显著(P < 0.05)。见表1。

2.2 斜板试验结果各组大鼠术前斜板角度均能达到 55o，脊髓全横断后角度下降。术后15 d，30 d与模型对照组比较，未转染细胞移植组恢复较好，斜板角度较高，差异有显著性意义(P < 0.05)，但未达到正常水平；基因转染细胞移植组恢复程度最好，斜板角度基本接近正常水平，与未转染细胞移植组比较差异显著(P < 0.05)。见表2。

2.3 辣根过氧化物酶逆行追踪情况切片观察发现辣根过氧化物酶标记胞体多数位于脊髓前角外侧核，胞体被染成蓝色。模型对照组未见阳性神经元；未转染细胞移植组术后15 d，30 d均可见少量阳性神经元；基因转染细胞移植组术后15 d前角可见阳性神经元，数量也较少，染色较淡，术后30 d阳性神经元增多，同时染色加深。见图1。

传统观点认为，控制机体随意运动的是皮质脊髓束，其他下行传导路主要调节肌张力和脊髓反射，大鼠脊髓横切后神经纤维残留量与运动功能恢复有关[8-9]。Basso等[10]研究了大鼠下胸段脊髓不同程度损伤后脊髓组织残留比例与后肢运动功能恢复的关系，发现少至5%的残留就可引起瘫痪后肢恢复部分或全部关节运动；当残留达到10%时，截瘫动物可站立甚至行走。因此，很少量的残留纤维即可恢复较好的功能，残留纤维稍有增加功能便会明显改善。当残留比例超过40%时，大鼠后肢运动功能可达到正常。因此，在研究脊髓全横断的修复时，必须保证模型动物脊髓的完全断开[11]，否则容易出现假阳性结果。
胚胎干细胞移植被认为是修复中枢神经系统疾病包括退行性疾病和损伤最有发展潜能的治疗方案之一，尤其是对于脊髓损伤[12-13]。最近有科学家提出移植的胚胎干细胞分化物来替代损伤、死亡的神经元，重建神经元回路，并在损伤部位的近端和远端间起连接中断作用[14]。此外，有研究表明可通过对胚胎干细胞的基因修饰使它们能表达外源性基因，然后将其移植到脊髓受损部位，使它们能分泌大量的治疗性神经营养因子，阻止分化来的神经元死亡并促进神经纤维再生[15]。因此，移植到损伤脊髓内的胚胎干细胞要求容易大量获得、扩增和储存，并且易于基因操作，本实验选用MESPU35和ES-NT3细胞都符合以上标准。NT3属于神经营养因子家族的成员，具有广泛的神经营养和诱向作用，能够促进神经元的存活和轴突生长的导向[16-17]。早有报道证明胚胎干细胞存在NT3基因的高亲和力受体TrkC，广泛分布于胚胎干细胞膜，能够和外源性的NT3基因结合，产生生物学效应[18]。辣根过氧化物酶逆行追踪实验观察到术后15 d、30 d移植组动物脊髓内出现较多的染色阳性神经元，而移植对照组的神经元数量较少、染色强度弱。这些说明移植了ES-NT3细胞神经分化物的大鼠脊髓在结构上得到了更好的重建，推测转染了NT3基因的胚胎干细胞能够表达外源性的NT3蛋白，该外源蛋白表达的增加能够促进分化形成的神经元存活和神经纤维轴突的伸长。
改良Tarlov评分标准具有灵敏度高，实施方法简单的优点，但评分标准范围跨度较大、记分跳跃分布，欠缺准确性[19]；而斜板实验具有重复性好、简单易行的优点，缺点是对运动功能评价单一，人为因素影响大[20]。本实验结合改良Tarlov评分和斜板实验，弥补了单一评定方法产生的不足，通过观察，动物脊髓损伤后直接移植MESPU35细胞神经分化物，能够使损伤大鼠脊髓在运动功能上得到一定程度的恢复，但远未达到正常；而移植ES-NT3细胞神经分化物的大鼠，术后30 d运动功能基本恢复正常。以上结果提示经过NT-3基因转染操作后的胚胎干细胞神经分化物移植对脊髓损伤大鼠运动功能的恢复优于普通的胚胎干细胞。
本实验结果表明，移植MESPU35和ES-NT3胚胎干细胞神经分化物可以促进大鼠脊髓损伤后功能和结构形态的恢复，其中移植ES-NT3的治疗效果更好，提示结合胚胎干细胞移植和基因治疗可以更好地促进脊髓功能和结构的重建，有可能达到治疗大鼠脊髓损伤目的，为临床治疗脊髓损伤提供新的线索。

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